Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 6
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 16
Глава 1 РОЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЧУМНОГО МИКРОБА С
КЛЕТКАМИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ ОРГАНИЗМА ХОЗЯИНА В
ПРОЯВЛЕНИИ МЕХАНИЗМОВ ЕГО ВИРУЛЕНТНОСТИ И
ЦИТОТОКСИЧНОСТИ 16
Глава 2 НОВЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ В ИЗУЧЕНИИ БИОЛОГИЧЕСКИХ
СВОЙСТВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ И ДРУГИХ ФАКУЛЬТАТИВНЫХ
ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПАРАЗИТОВ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ
МЕТОДОВ ПРОТОЧНО-ЦИТОФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО АНАЛИЗА 33
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 50
Глава 3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 50
3.1 Материалы 50
Штаммы микроорганизмов 50
Антигены и пр епар аты 5 0
Флуоресцирующие красители 51
Цитофлуориметрическое оборудование 51
3.2 Микробиологические методы 55
Выращивание бактерий на питательных средах и приготовление бактериальных взвесей 55
Определение жизнеспособности бактерий, оценка интенсивности
их размножения или гибели в образцах цельной крови человека 55
Световая, люминесцентная и электронная микроскопия бактерий 56
Электрофоретический метод исследования белков Yersinia pestis 57
Оценка неоднородности культур Y. pestis по содержанию на клетку ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов 57
3.3 Иммунологические методы 58
Взятие крови, выделение лейкоцитов и инактивация сывороточного комплемента в крови 58
Определение абсолютного и относительного содержания лейкоцитов 60
3.3.3 Люминесцентная микроскопия и морфологический анализ
лейкоцитов 60
3.3.4 Получение распределений лейкоцитов крови по фазам клеточного
цикла 61
3.3.5 Оценка состояния (структуры) ядерного хроматина лейкоцитов 61
Определение содержания в фагоцитах бактерицидных гранул с эластазной и миелопероксидазной активностью. Оценка in vitro интенсивности дегрануляции клеток врожденного иммунитета 62
Определение фагоцитарной активности лейкоцитов и оценка их гибели in vitro по типу апоптоза 63
3.4 Методы учета и представления результатов цитофлуориметрического
анализа 63
3.5 Статистические методы 65
Глава 4 ХАРАКТЕРИСТИКА КЛЕТОК В КУЛЬТУРАХ Y. PESTIS,
ВЫРАЩЕННЫХ ПРИ ТЕМПЕРАТУРАХ 28 и 37 С 66
4.1 Акгивация процессов синтеза ДНК, белка и специфических
поверхностных антигенов в клетках Y. pestis EV НИИЭГ, растущих на
жидкой питательной среде при температуре 37 С 67
4.2 Особенности распределений чумных микробов по клеточному циклу
в культурах вирулентного и авирулентного штаммов Y. pestis 78
Глава 5 РАЗРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ ДЛЯ
ИЗУЧЕНИЯ IN VITRO АНТИФАГОЦИТАРНЫХ И
ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЧУМНОГО МИКРОБА 81
5.1 Сохранение стабильности состояния ядерного хроматина и
бактерицидных гранул лейкоцитов в процессе длительной инкубации
образцов цельной крови человека 81
5.2 Сравнительное исследование антифагоцитарных и цитотоксических
свойств клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 и
37 С 91
5.3 Эффект сывороточных опсонинов на фагоцитарную активность
клеток врожденного иммунитета и интенсивность их повреждения in vitro
чумными микробами 101
5.4 Изучение особенностей развития апоптоза лейкоцитов крови человека
под влиянием клеток высоковирулентного и авирулентного штаммов
чумного микроба 107
Глава 6 ВЛИЯНИЕ ПРОТИВОЧУМНОЙ ВАКЦИНАЦИИ НА
ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ И ИНТЕНСИВНОСТЬ
ПОВРЕЖДЕНИЯ ЛЕЙКОЦИТОВ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПРИ
ВЗАИМОДЕЙСТВИИ IN VITRO С КЛЕТКАМИ И АНТИГЕНАМИ
Y. PESTIS 111
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 120
ВЫВОДЫ 132
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ 134
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
АО - акридиновый оранжевый
ГКПБ - Государственная коллекция патогенных бактерий
ЖЧВ - живая чумная вакцина
ЗФР - забуференный физиологический раствор
KB - коэффициент вариации
КОЕ - колониеобразующая единица
ЛПС - лшюполисахарид
м.к. - микробная клетка
НИР - научно-исследовательская работа
ПБА - патогенный биологический агент
ПМЛ - полиморфноядерные лейкоциты
ППН - показатель повреждения нейтрофилов
РНАт - реакция нейтрализации антител
РНГА - реакция непрямой гемагглютинац'ии
РТНГА - реакция торможения непрямой гемагглютинации
ФИТЦ - флуоресцеинизотиоцианат
ФЦНТП - Федеральная целевая научно-техническая программа
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
Ig - иммуноглобулины
F1 - фракция 1, капсульный антиген чумного микроба
LD5o - доза вирулентного штамма, вызывающая гибель половины животных,
взятых в эксперимент
М - средняя арифметическая
m - средняя ошибка средней арифметической
п - количество опытов
pCad - плазмида кальцийзависимости
pFra - плазмида, детерминирующая синтез капсульного антигена (F1)
Pgm - признак пигментсорбции
pPst - плазмида пестициногенности
Yop - белки внешней мембраны иерсиний (от англ. Yersinia outer proteins)
Введение к работе
Актуальность проблемы. Чума по-прежнему представляет реальную угрозу для мирового сообщества, о чем свидетельствуют эпидемические осложнения, связанные с активацией ее возбудителя в природных очагах Индии, Мадагаскара и ряда других стран в конце XX - начале XXI веков, а также данные о возможном использовании чумного микроба биотеррористами в качестве ПБА [Онищенко Г.Г., 2003; Кутырев В.В., Куличенко А.Н., 2004; Грижебовский Г.М., 2006; Weir Е., 2005; Calhoun L.N. et al., 2006; Zhou D. et al., 2006; Richard J.L., Grimes D.E., 2008; Smiley S.T., 2008]. Опасность распространения чумы на территории России, а также граничащих с Россией государств, требует решения актуальной проблемы совершенствования средств ее специфической профилактики и лечения.
Создание новых эффективных противочумных вакцин и снижение смертности среди заболевших чумой людей связывают с дальнейшим изучением молекулярных механизмов взаимодействия возбудителя чумы и его антигенов с клетками врожденного иммунитета организма хозяина. На модели чумного сепсиса у мышей, а также в опытах in vitro с лейкоцитами крови лабораторных животных, установлена способность чумного микроба к избирательному подавлению ключевых функций этих клеток (секреция цитокинов, фагоцитоз, ранний апоптоз и другое), лежащих в основе первой линии клеточной антибактериальной защиты, развития местной защитной воспалительной реакции и последующего формирования в организме адаптивного иммунитета [Titball R.W. et al., 2003, DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005; Bosio CM. et al., 2005].
Анализ литературы за последнее десятилетие свидетельствует, что исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета организма хозяина уже не может рассматриваться лишь с позиций определения показателей завершенности или незавершенности лейкоцитарного фагоцитоза. Необходимо изучение повреждающего эффекта на клетки периферической крови чумных микробов, обладающих устойчивостью при температуре 37 С к поглощению и киллингу полиморфноядерными лейкоцитами и моноцитами. Взаимодействуя с поверхностью клеток крови организма хозяина, внеклеточно размножающиеся бактерии секретируют в цитоплазму фагоцитов и лимфоцитов цитотоксические белки {Yersinia outer proteins), кодируемые плазмидой вирулентности, что
запускает массовую гибель лейкоцитов по типу апоптоза и лейкоцитолиз на стадии генерализации чумного инфекционного процесса. Однако, цитотоксические свойства устойчивых к фагоцитозу чумных микробов недостаточно изучены. Существенные различия в клеточных системах естественной иммунологической защиты у людей и мышей заставляют исследователей задуматься о необходимости изучения антифагоцитарных и цитотоксических свойств чумного микроба на моделях его взаимодействия с лейкоцитами крови человека [Cornells G.R., 2002; Titball R.W. et al., 2003; DeLeo F.R., Hinnebusch B.J., 2005].
Процессы массивной секреторной дегрануляции и гибели лейкоцитов, запускаемые в крови пациентов токсинами устойчивых к фагоцитозу бактерий, играют решающую роль в генерализации воспаления и в развитии характерных для сепсиса инфекционных осложнений [Маянский А.Н. с соавт., 1999; Козинец Г.И. с соавт., 2002; Casey Н., 2004], особенно при легочных бактериальных инфекциях [Simpson A J. et al., 2001; Kawabata К. et al., 2002]. Существует гипотеза о ключевой роли этих процессов в развитии тромбогеморрагического синдрома и эндотоксического шока при чуме, основанная на результатах морфологической детекции в ядерном хроматине и цитоплазматических гранулах лейкоцитов крови пациентов интенсивных дегенеративных изменений, предшествующих летальному исходу заболевания в клинических условиях [Исин Ж.М., 1990]. Для -' подтверждения или опровержения данной гипотезы необходима информация о характере развития процессов секреторной дегрануляции и апоптотической гибели лейкоцитов в цельной крови человека под влиянием чумных микробов с различными биологическими свойствами. Получение такой информации в условиях in vitro является новой, актуальной задачей, решение которой может иметь большое теоретическое и практическое значение.
Клеточная природа иммунитета при чуме не вызывает сомнения [Покровская М.П., Каганова Л.С., 1947; Коробкова Е.И., 1955; Самойлова Л.В., 1963; Самойлова Л.В. с соавт., 1970; Сагимбеков У.А. с соавт., 1986; Васильева Г.И., 1990; Дубровина В.И., 2004; Cowan С. et al., 2005], и все известные на сегодняшний день методы определения in vitro специфической сенсибилизации организма к инфекционному агенту основаны на учете реакций повреждения лейкоцитов крови антигеном [Фрадкин В.А., 1985; Гюлазян Н.М. с соавт., 2006].
Способность вакцинации (специфических антител к V-антигену) предотвращать апоптоз лейкоцитов периферической крови при экспериментальной чуме и в условиях in vitro лежит в основе современного способа оценки напряженности приобретенного противочумного иммунитета у привитых против чумы лабораторных животных [Bashaw J. et al., 2007].
Для определения in vitro уровня напряженности противочумного иммунитета у человека необходимо изучение особенностей взаимодействия чумного микроба и его антигенов с лейкоцитами крови привитых и не привитых против чумы людей с использованием современных методов цитологического анализа, способных адекватно оценивать исход взаимодействия патогенных бактерий с клетками иммунной системы организма хозяина [Кравцов А.Л., 1997].
При изучении фагоцитоза, дегрануляции и апоптоза в последние годы начинают внедряться экспериментальные системы, исключающие влияние на данные процессы неспецифической активации клеток и различных факторов, связанных с выделением популяций лейкоцитов из периферической крови пациентов. Это достигается путем непосредственного введения инфекционного агента или его антигенов в цельную кровь, культивирования образцов крови в оптимальных условиях и использования метода проточной цитофлуориметрии для быстрого определения в микрообъемах культивируемой крови показателей фагоцитоза, реактивности бактерицидных систем активных фагоцитов и индуцированного апоптоза [Козинец Г.И. с соавт., 2002; Гюлазян Н.М. с соавт., 2006; Abrams W.R. et al., 1983; Bassoe K-F et al., 1984; Cinco M. et al., 1994; Raybourne R.B., Bunnind KJ, 1994; Alvarez-Barrientos A. et al., 2000; Kravtsov A.L. et al., 2001-2002].
Эффективность использования метода проточной цитометрии для изучения взаимодействия чумных микробов с организмом хозяина установлена в опытах in vitro с перитонеальными макрофагами [Кравцов А.Л. с соавт., 1994; Кравцов А.Л., 1997], а также с клетками, выделенными из легких и бронхоальвеолярной _, жидкости лабораторных животных [Bosio СМ. et al., 2005]. Для изучения в условиях in vitro взаимодействия возбудителя чумы и его антигенов с лейкоцитами цельной крови человека этот современный метод оценки взаимодействия
патогенных бактерий с клетками иммунной системы организма хозяина не применялся.
Цель диссертационной работы - разработка экспериментальной системы для изучения взаимодействия чумного микроба с лейкоцитами цельной крови человека и оценки клеточного противочумного иммунитета у лиц, привитых живой чумной вакциной.
Основные задачи исследования.
Изучить влияние условий культивирования на синтез в клетках Yersinia pestis ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов. Определить характер распределений отдельных бактерий по клеточному циклу (по содержанию ДНК на клетку) в культурах вирулентного, вакцинного и авирулентного штаммов чумного микроба, выращенных при температурах 28 и 37 С.
Изучить антифагоцитарные и цитотоксические свойства клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах 28 и 37 С, в экспериментальной системе их взаимодействия in vitro с лейкоцитами цельной крови человека, а также динамику размножения чумных микробов с различными антифагоцитарными свойствами в крови с температурой 37 С.
Оценить эффективность опсонизации живых клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных при температурах,28 и 37 С, термолабильным комплементом и термоггабильными Ig G сыворотки крови по изменению показателей фагоцитарной активное ги, секреторной дегрануляции и раннего апоптоза клеток врожденного иммунитета человека.
Выявить различия в цитотоксическом эффекте клеток вакцинного EV НИИЭГ (Pgm"; pFra+; pCad+; pPst+), вирулентного 231 (Pgm+; pFra+; pCad+; pPst+) и авирулентного KM 260 (12) (Pgm+; pFra"; pCad"; pPst") штаммов Y. pestis на лейкоциты крови человека.
Изучить убитые чумные микробы' и их отдельные антигены как индукторы развития процессов дегрануляции и гибели лейкоцитов в крови привитых и не привитых против чумы людей.
Научная новизна. Впервые разработана экспериментальная система, позволяющая исследовать процесс фагоцитоза, а также процессы секреторной дегрануляции и апоптоза лейкоцитов при непосредственном введении чумного
микроба или его очищенных антигенов в образцы цельной крови человека, основанная на измерении методом проточной цитофлуориметрии относительного содержания ДНК и лизосомальных гранул в отдельных лейкоцитах. Показано, что применение разработанной системы позволяет идентифицировать и дифференцировать в крови человека клетки врожденного иммунитета (моноциты и гранулоцитьт) по внутриклеточному содержанию бактерицидных веществ, локализованных в первичных (азурофильных) гранулах, регистрировать поглощение бактерий (бактериальной ДНК) активными фагоцитами, оценивать функциональную активацию в фагоцитах протеолитических и бактерицидных систем (дегрануляцию), а также определять характер индуцируемой бактериями гибели (фрагментации ДНК) лейкоцитов в экспериментальных условиях, исключающих влияние различных факторов, связанных с выделением клеточных популяций и неспецифической клеточной активацией.
С использованием разработанной системы впервые изучено взаимодействие с лейкоцитами цельной крови человека чумных микробов, выращенных при температурах 28 и 37 С. Получены новые данные о влиянии условий , культивирования на степень устойчивости опсонизированных клеток Y. pestis к лейкоцитарному фагоцитозу, о способности размножающихся в крови чумных микробов подавлять, в отличие от золотистого стафилококка, секреторную i дегрануляцию фагоцитов и их гибель по типу апоптоза на ранней стадии (в течение первых 6-8 ч) взаимодействия с клетками иммунной системы организма хозяина.
Впервые с использованием метода проточной цитометрии исследован эффект сывороточных опсонинов на исход взаимодействия чумного микроба с клетками врожденного иммунитета человека. Установлено, что развитие в моноцитах и гранулоцитах крови лиц, не привитых чумной вакциной, процессов секреторной дегрануляции и раннего апоптоза зависит от опсонизации живых чумных микробов, выращенных при температуре 28 С, сывороточным комплементом и не зависит от термостабильных сывороточных опсонинов (Ig G). Получена информация об устойчивости живых клеток Y. pestis, выращенных при температуре 37 С, к опсонизации комплементом, подтверждающая на модели клеток крови человека способность факторов вирулентности чумного микроба инактивировагь белки сывороточного комплемента.
Впервые изучена динамика гибели лейкоцитов при размножении в крови человека чумных микробов с различными биологическими свойствами, зависимость интенсивности этого процесса от длительности срока инкубации и исходной микробной концентрации. Установлено, что устойчивые к фагоцитозу чумные микробы вызывают гибель лейкоцитов крови с длительной задержкой по времени (в интервале от 24 до 48 ч инкубации), характерной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). В отличие от бактерий, выращенных при температуре 28 С, они не могут вызвать гибели фагоцитов на ранней стадии взаимодействия с клетками крови человека (в течение первых 6-8 ч инкубации).
Новой является информация о различном характере реакции in vitro лизосомального аппарата и ядерного хроматина клеток врожденного иммунитета лиц, привитых и не привитых живой чумной вакциной, на контакт с убитыми клетками, липополисахаридом и капсульным антигеном чумного микроба. Впервые показано, что противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание специфических антигенов Y. pestis в периферической крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер гибели клеток иммунной системы по типу индуцированного апоптоза.
Практическая значимость работы заключается в создании
экспериментальной основы для изучения антифагоцитарных и цитотоксических
свойств чумного микроба с использованием современного метода
цитологического анализа, учитывающего функциональные параметры большого числа индивидуальных клеток в гетерогенных популяциях. Методические приемы, разработанные в процессе выполнения диссертации, нашли применение в научных исследованиях сотрудников РосНИПЧИ «Микроб» и Саратовского Государственного медицинского университета: для сравнительной оценки устойчивости бактерий к лейкоцитарному фагоцитозу и киллингу полиморфноядерными лейкоцитами крови человека; для изучения факторов, влияющих на развитие апоптоза лейкоцитов в крови человека и лабораторных животных; для прогнозирования осложнений у инфицированных новорожденных в клинических условиях по показателям интенсивности дегрануляции лейкоцитов периферической крови и лейкоцитарного апоптоза.
Полученные в работе экспериментальные данные могут служить основой для дальнейших исследований, направленных на дифференцирование штаммов Y. pestis по степени их патогенності! и эпидемической опасности для человека, а также на разработку эффективного теста оценки in vitro напряженности приобретенного клеточного иммунитета у лиц, привитых чумной вакциной.
По маїериалам диссертационной работы составлены:
методические рекомендации «Экспресс - метод выделения лейкоцитов из цельной крови человека и экспериментальных животных», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол №9 от 01.10.99 г. и утверждены-директором института «Микроб»;
методические рекомендации «Оценка уровня азурофильной дегрануляции нейтрофилов в цельной крови человека с использованием проточной цитометрии», одобрены Ученым советом РосНИПЧИ «Микроб», протокол №6 от 06.07.01 г. и утверждены директором института «Микроб»;
3) методические рекомендации «Организация работы и обеззараживание
материала, содержащего возбудителя чумы при проведении исследований
методом проточной цитофлуориметрии», одобрены Ученым советом ФГУЗ
РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора, протокол № 6 от 12.12.08 г. и
утверждены директором института «Микроб».
Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям и курсах усовершенствования врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб».
Основные положения, выносимые на защиту:
Информация об антифагоцитарных и цитотоксических свойствах чумного микроба может быть получена в экспериментальной системе, основанной на введении живых бактерий в цельную кровь человека и использовании проточной цитофлуориметрии для измерения в отдельных лейкоцитах культивируемой крови относительного содержания ДНК и бактерицидных (азурофильных) гранул.
Взаимодействие чумных микробов с лейкоцитами крови лиц, не привитых чумной вакциной, носит характер незавершенного фагоцитоза: с низкой эффективностью распознавания и поглощения бактерий фагоцитами; с подавлением развития в фагоцитах процесса секреторной дегрануляции; с нарушением защитного механизма быстрой гибели нейтрофилов по типу раннего апоптоза.
Интенсивность подавления защитной реакции клеток врожденного иммунитета человека факторами вирулентности Y. pestis и, как следствие, скорость размножения бактерий в крови с температурой 37 С зависят от условий выращивания исходной бактериальной культуры (температура 28 или 37 С), от степени неоднородности клеток микробной популяции по содержанию ДНК, белка и специфических поверхностных антигенов.
Устойчивые к фагоцитозу чумные микробы индуцируют гибель лейкоцитов в цельной крови человека по типу позднего апоптоза - с длительной отсрочкой по времени, типичной для генерализации воспалительного процесса (сепсиса). Штаммы Y. pestis EV НИИЭГ, 231 и КМ 260(12), относящиеся к различным группам патогенності! (опасности), отличаются по способности и характеру индукции в крови позднего цитотоксического эффекта.
Противочумная вакцинация активирует секреторную функцию клеток врожденного иммунитета, осуществляющих распознавание антигенов чумного микроба в крови человека, и оказывает модулирующее воздействие на характер развития индуцированного бактериями апоптоза.
Апробация работы. Исследования проведены в рамках плановых НИР, в которых автор являлся соисполнителем: НИР 019-3-03 «Изучение взаимодействия чумного микроба с клетками крови в модельных системах in vitro» на 2003-2007 годы; НИР «Изучение роли биомолекул возбудителей особо опасных
инфекционных заболеваний (чумы и холеры) в контроле апоптоза (запрограммированной гибели) эукариотических клеток» как раздела ФЦНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002-2006 годы.
Результаты экспериментальной работы были доложены на: второй
Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (май 1998 г.,
Саратов); юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение ипрофилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология и ветеринария», посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (ноябрь 1998 г., Киров); международной научной конференции учреждений по борьбе и изучению природно-очаговых инфекций Министерства Здоровья и Социальной Защиты (Улан-Батор, Монголия, 1999); юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии», посвященной 25-ю ГНЦ прикладной микробиологии (декабрь 1999 г., Оболенск); VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика» (декабрь 2000 г., Санкт-Петербург); международной конференции Saratov Fall Meeting 2000:OpticaI Technologies in Biophysics and Medicine II (october 2000, Saratov, Russia); международной конференции Saratov Fall Meeting 2001: Optical Technologies in Biophysics and Medicine III (october 2001, Saratov, Russia); научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ (октябрь 2004 г., Н.Новгород); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» (сентябрь 2004, Саратов); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила н реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (сентябрь 2007, Саратов); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (сентябрь-октябрь 2008, Волгоград); научно-
практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб»: «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000, 2003, 2005-2008 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 научные работы, в том числе 8 статей, из которых 2 - в рекомендованных ВАК изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 91 отечественный и 173 зарубежных источников. Текст иллюстрирован 23 рисунками и 7 таблицами. Общий объем диссертации составляет 157 страниц.
Похожие диссертации на Взаимодействие чумного микроба и его антигенов с клетками крови человека in vitro
