Введение к работе
Актуальность исследования.
Сибирская язва является серьезной проблемой здравоохранения и ветеринарии Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются случаи заражения людей и животных этим опасным инфекционным заболеванием (Ипатенко Н , 1996, Онищенко Г с соавт , 1999) Тенденции к ухудшению эпидемиологической ситуации по сибирской язве (Черкасский Б, 2002, Ясинский А с соавт, 2005), угроза и реальные случаи применения Bacillus anthracis в биотеррористических целях (Bush L ct al, 2001, Jermgan J et al, 2001, Spencer R , Lightloot N , 2001) требуют дальнейшего совершенствования средств защиты и диагностики Рекомендованные для иммунопрофилактики людей и сельскохозяйственных животных живые вакцины получены в середине прошлого столетия классическими способами аттенуации вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы Относительно высокий уровень их реакто-генности (Степанов А с соавт, 1996, Turnbull Р et al, 1986, 1991, Ivins В , 1990) обусловлен наличием в геноме плазмиды pXOl, детерминирующей синтез трехкомпонентного токсина, состоящего из протек-тивного антигена, отечного и летального факторов Развитие иммунного ответа макроорганизма обусловливает преимущественно протективный антиген (ПА) токсина Отечный (ОФ) и летальный (ЛФ) факторы, взаимодействуя с протеолитически активированным ПА, образуют токсичные комплексы, запускающие патогенетические процессы сибиреязвенной инфекции (Leppla S , 1991)
Для производства менее реактогенных химических сибиреязвенных вакцин разработаны методы выделения и очистки ПА из культуральных фильтратов вакцинных штаммов В anthracis (Безносов М , 1997, Leppla S , 1988, Quinn С et al, 1988) Однако предложенные методики хроматографического разделения компонентов токсина, имеющих очень близкие значения молекулярных масс (ПА - 83 кДа, ОФ - 89 кДа, ЛФ -85 кДа), не позволяют получить иммуногенный препарат свободный от сопутствующих белков В минимальных количествах ОФ и ЛФ присутствуют в образцах всех химических вакцин, получаемых из аттенуиро-ванных штаммов, причем их содержание не нормировано и сильно варьирует Именно с наличием реактогенных примесей ОФ и ЛФ в препаратах химических сибиреязвенных вакцин, производимых в США и Великобритании, связывают возникновение нередких (у 30 % вакцинированных) аллергических реакций или даже некроза тканей на месте введения (Swanson-Biearman S , 2001)
Современные достижения биологической науки открывают новые возможности для создания менее реактогенных, но эффективных вакцинных препаратов Среди развиваемых генетических и молекулярно-биологических направлений одним из перспективных является клонирование генов синтеза факторов иммуногенности в гомо- и гетерологич-ных системах с целью создания живых вакцин и продуцентов протек-тивных антигенов
Молекулярные механизмы сохранения иммуногенности и снижения вирулентности аттенуированных культур стали понятны после установления плазмидной детерминации синтеза основных факторов патогенносте и иммуногенности В anthracis (Mikesell Р et al, 1983, Green В et al, 1985, Uchida 1 et al, 1985) В геноме В anthracis содержатся два высокомолекулярных репликона - pXOl (182 т п н ) и рХ02 (93,5 т п н ) В процессе аттенуации происходит элиминация плазмиды рХ02, обусловливающей синтез капсулы, защищающей микробную клетку от фагоцитоза, что приводит к неспособности штамма вызывать развитие специфического инфекционного процесса в организме хозяина Репликон pXOl содержит детерминанты суа, lef и pag, кодирующие синтез ОФ, ЛФ и ПА, составляющие сибиреязвенный экзотоксин, и регуляторные области - atxA и pagR, отвечающие за регуляцию синтеза токсина, капсулы и белков S-слоя (Hoftmaster A , Koehler Т , 1999, Okinaka R et al,
1999, Mignot T et al, 2003) Нуклеотидная последовательность клониро
ванного участка плазмиды pXOl, ответственного за синтез ПА, установ
лена S Welkos etal (1988)
Впервые ген pag, детерминирующий синтез ПА, клонирован М Vodkin и S Leppla (1983) в штамме Escherichia coll Однако уровни продукции ПА рекомбинантными штаммами Е coll (5—10 нг/мл) были на несколько порядков ниже значений, установленных для вакцинного штамма В anthracis Sterne34F2(15 мкг/мл) Впоследствии неоднократно предпринимались попытки клонирования гена pag в штаммах различных бактериальных видов Е coh (Gupta Р et al, 1999, Chauhan V et al, 2001), Salmonella typhimurium (Coulson N , et al, 1994), Lactobacillus casei (Zegers N et al, 1999), В subtilis (Ivins В и Welkos S , 1986, Baillie L et al, 1998) , В anthracis (Barnard J , Friedlander A, 1999, Cohen S et al,
2000, Aloni-Gnnstein R et al, 2005) В большинстве случаев гибридные
плазмиды при функционировании в гетерологичных системах оказыва
лись нестабильными или не могли обеспечить высокой продукции ПА
Уровень синтеза ПА в генно-инженерных штаммах лимитируется слабостью собственного промотора гена pag сибиреязвенного микроба, наличием позитивного (atxA) и негативного (pagR) регуляторов и активностью протеолитических ферментов реципиентных штаммов Наиболее
успешной оказалась работа S Cohen с соавторами (2000), клонировавших структурный ген pagA под сильным промотором а-амилазы в штамме В anthracis Сообщается о высокой секреции ПА (100 мкг/мл) Попытки дальнейшего усовершенствования генетических конструкций за счет использования еще более мощных промоторов не увенчались успехом (Gat О et al, 2003) Гиперсекреция ПА, с одной стороны, сопровождалась нестабильностью гибридных плазмид, с другой - вела к «секретируемому стрессу», выражающемуся в значительном снижении выработки антител к ПА К повышению продукции ПА приводят деле-ции или мутации в области негативной регуляции гена pag (Bailhe L et al, 1998, Barnard J , Fnedlander A et al, 1999) Гибридные плазмиды с делециями в pagR области получены В Ivins и S Welkos (1986)
Отечественными авторами также предпринимались попытки клонирования гена pag в гетерологичных системах - в вакцинных штаммах Franctsella tularensis (Павлов В , Тедиков В , 1995), Yersinia pestis (Кис-личкина О с соавт , 1991, Алимов А, Павлов В, 1995), Е со/і, В subtihs, Staphylococcus aureus (Тедиков В с соавт , 1993) Однако, до последнего времени в распоряжении отечественных ученых отсутствовали как стабильные векторные плазмиды, содержащие ген синтеза ПА, так и эффективные рекомбинантные продуценты ПА
Таким образом, все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы,
Цель диссертационной работы генно-инженерное конструирование эффективных и стабильных штаммов-продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба
Основные задачи исследования:
Микробиологический анализ реципиентных и донорных штаммов для создания продуцентов протективного антигена, оптимизация метода трансформационной передачи гибридной ДНК в клетки В anthracis и В subtihs, поиск возможных способов селекции трансформантов, продуцирующих протективный антиген
Конструирование гибридных плазмид, содержащих ген синтеза протективного антигена, клонирование гена pag в гомо- и гетерологичных бациллярных штаммах
Получение и отбор рекомбинантных штаммов с высокой продукцией протективного антигена сибиреязвенного микроба
Изучение стабильности генно-инженерных штаммов-продуцентов протективного антигена in vitro и in vivo
Сравнение уровней продукции протективного антигена рекомби-нантными и вакцинными штаммами сибиреязвенного микроба с использованием биохимических и иммунохимических методов исследования
6 Изучение иммуногенных свойств сконструированных штаммов с клонированным геном pag на модели лабораторных животных
Научная новизна исследования.
Впервые на основе бесплазмидных производных отечественных вакцинных штаммов В cmthracis СТИ-1 и В anthracis 55 получены реком-бинантные штаммы, являющиеся эффективными продуцентами протективного антигена
Сконструирована гибридная плазмида pUB110PA-l, содержащая ген pag, стабильно функционирующая в составе бациллярных штаммов и обеспечивающая высокий уровень продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба
Рекомбинантные штаммы В anthracis СТИАТПА-1, В anthracis 55АТПА-1 и В subtilis \УВ600АТПА-1 стабильны при пассировании in vitro и in vivo, обладают низкой активностью протеолитических ферментов и пятикратно превосходят вакцинные штаммы В anthracis СТИ-1 и В anthracis 55 по уровню продукции протективного антигена
В экспериментах на морских свинках и линейных BALB/c мышах показано, что рекомбинантные штаммы В anthracis СТИАТПА-1 и В subtilis \УВ600АТПА-1, содержащие гибридную плазмиду pUB110PA-l, обладают протективным эффектом, обеспечивая защиту лабораторных животных на уровне вакцинного штамма В an-thiacis СТИ-1
В Роспатент подана заявка № 2006122787 на патентование рекомби-нантного штамма В anthracis СТИАТПА-1 (pUB110PA-l) - продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба (дата приоритета 26 06 2006 г )
Практическая ценность.
В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонированы рекомбинантные штаммы В anthracis КМ95 (В anthracis 55АТПА-1), В anthracis КМ96 (В antracis СТИАТПА-1) и В subtilis КМ 199 (В subtilis WB600nA-1) Штаммы содержат гибридный репликон pUBllOPA-І, несущий ген pag Штаммы В anthracis 55АТПА-1, В antracis СТИАТПА-1 и В subtilis \В600ПА-1 являются безопасными, стабильными и эффективными продуцентами протективного антигена сибиреязвенного микроба - основного компонента химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов
В Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" депонированы изогенные штаммы В anthracis КМ92(2) (В anthracis 55ДТ) -бесплазмидный производный вакцинного штамма В anthracis 55, и В anthracis КМ92(3) - (В anthracis 55ATSpo") - аспорогенный мутант бес-плазмидного производного штамма В anthracis 55 Штаммы предназна-
чены для использования в качестве реципиентов при осуществлении клонирования детерминантов иммуногенности сибиреязвенного микроба
По материалам диссертации составлены методические рекомендации "Комплекс методических подходов к определению продукции протек-тивного антигена сибиреязвенного микроба", одобренные Ученым советом РосНИПЧИ "Микроб" (протокол Ученого совета РосНИПЧИ "Микроб" №2 от 17 04 2007 г) и утвержденные директором РосНИПЧИ "Микроб"
Материалы диссертации используются в лекциях по генетике бактерий на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при РосНИПЧИ «Микроб»
Основные положения, выносимые на защиту.
На основе протеазодефицитных бесплазмидных производных В antiacis СТИАТ, В anthracis 55АТ и В subtdis WB600 сконструированы штаммы-продуценты протективного антигена сибиреязвенного микроба Рекомбинантные штаммы В antracis СТИАТПА-1, В anthtacis 55АТПА-1 и В subtihs У/В600ПА-1 содержат гибридный репликон pUB110PA-l (6,5 т п н ) с включенным в его состав геном pag
Сконструированные штаммы В antraas СТИАТПА-1, В anthracis 55АТПА-1 и В subtihs \УВ600ПА-1 по уровню продукции протективного антигена (80 - 90 мкг/мл) пятикратно превосходят вакцинные культуры В anthracis СТИ-1 и В anthracis 55
Рекомбинантные штаммы В antracis СТИАТПА-1, В anthracis 55АТПА-1 и В subtihs \УВ600ПА-1 сохраняют биологические свойства при пассировании in vitro и in vivo Гибридная плазмида pUB110PA-l стабильно функционирует в составе бациллярных штаммов в условиях селективного давления, а также при чередовании пассажей на селективных и обычных средах
Генно-инженерные штаммы В anthracis СТИАТПА-1 и В subtihs WB600nA-l в иммунизирующей дозе (3 - 5 х 107спор) не обладают остаточной вирулентностью для мышей линии BALB/c и морских свинок и обеспечивают их эффективную защиту от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на Всероссийской научно-практической конференции "Медицинская микробиология-XXI век" (г Саратов, 2004), Международной конференции "Молекулярная медицина и биобезопасность" (г Москва, 2004), Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Окружающая среда и здоровье"
(г Суздаль, 2005), VI Межгосударственной научно-практической конференции "Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях" (г Волгоград, 2005), Российском медицинском форуме "Фундаментальная наука и практика" (г Москва, 2006), IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (г Москва, 2007), итоговых научно - практических конференциях РосНИПЧИ "Микроб" (2004, 2005 и 2006 гг)
Публикации. Основное содержание работы отражено в 11 научных публикациях, из них статей в рекомендованных ВАК изданиях - 2
Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 58 отечественных и 158 зарубежных источников Общий объем диссертации составляет 133 страницы машинописного текста Текст иллюстрирован 5 таблицами и 18 рисунками
