Введение к работе
Актуальность темы исследования и степень ее разработанности
Туляремия - зоонозная природно-очаговая инфекция, представляющая серьезную опасность для населения из-за почти 100 % восприимчивости к ней людей (Олсуфьев, 1975). Возбудитель туляремии был впервые выделен в 1911 г. от сусликов с симптомами, подобными чуме, в графстве Туляре (Tulare), Калифорния, США. И, хотя история изучения возбудителя туляремии насчитывает более ста лет, до настоящего времени нет исчерпывающих сведений о факторах патогенности бактерий Fran-cisella tularensis, их молекулярных структурах и механизмах действия (Barker, 2007; Павлов, 2012). Современные знания о патогенезе туляремийной инфекции основываются, главным образом, на изучении экспериментальной туляремии на мышиной модели (Lyonsand, 2007).
Туляремия достаточно легко лечится антибиотиками, но, в случаях заражения F. tularensis subsp. tularensis биотипом А, частота летальных исходов при отсутствии лечения может достигать 10-50 % в зависимости от "входных ворот" инфекции (Sjostedt, 2003). Наиболее опасные - абдоминальная (тифоидная) и торакальная (легочная) формы - без надлежащего лечения летальны в 30 % случаев (Dennis, 2001). Высокая патогенность F. tularensis subsp. tularensis и тяжелое течение заболевания при аэрозольном заражении обусловливают возможность использования штаммов этого подвида в качестве агента биотерроризма (Rotz, 2002).
Для профилактики туляремии в Российской Федерации используется живая ту-ляремийная вакцина на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ, которая была создана в СССР в 40-50 годах двадцатого столетия (Олсуфьев, 1975). На основе вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ в США был создан экспериментальный вакцинный штамм LVS (Eigelsbach, 1961). В соответствии с МУ 3.3.1.2161-07 "Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба", утвержденными Главным государственным санитарным врачом РФ в 2007 году, свойства потенциальных вакцинных штаммов сравниваются со свойствами вакцинного штамма F. tularensis 15 НИИЭГ. Для изучения приживаемости, безвредности, реактогенности, иммуногенности кандидатов в вакцинные штаммы, а также их влияния на иммунную систему используются морские свинки. На мышах, согласно МУ 3.3.1.2161-07, определяют только степень остаточной вирулентности испытуемого штамма при подкожном заражении.
Использование морских свинок при оценке вакцинных штаммов туляремийного микроба связано с высокой чувствительностью мышей даже к низковирулентным штаммам, таким, как F. tularensis 15 НИИЭГ и LVS (Fortier, 1991). Кроме того, согласно литературным данным, экспериментальная туляремия у морских свинок более приближена к характеру течения этой инфекции у человека и приматов (Cowley, 2011). Тем не менее, для изучения иммунопатогенеза туляремии традиционно используется мышиная модель, поскольку из всех лабораторных животных только для мышей разработаны тест-системы, позволяющие исследовать различные звенья иммунитета (Lyonsand, 2007). Наличие моноклональных антител к отдельным CD-рецепторам иммунокомпетентных клеток, а также коммерческие наборы для определения цитокинов позволяют изучать тонкие механизмы формирования специфического иммунитета у мышей (Chiavolini, 2007; Ray, 2009). Использование различных линий мышей с определенно измененными генотипами также способствует детальному изучению этого процесса (Shen, 2004; Трунова, 2011; Cowley, 2011).
Большая часть опубликованных зарубежных работ по исследованию иммунного процесса при туляремии выполнена на штамме F. tularensis LVS, для которого F. tularensis 15 НИИЭГ является родительским. Возбудитель туляремии является внутриклеточным паразитом (Culkin, 1997; Forestal, 2007), поэтому он вызывает развитие преимущественно клеточно-опосредованного иммунитета (Elkins, 1993; Ki-rimanjeswara, 2008; Eneslatt, 2011). Иммунизация мышей штаммом F. tularensis LVS приводит к индукции пулов специфичных CD4+ и CD 8+ Т-клеток, способных секре-тировать большой спектр провоспалительных цитокинов, в частности, ФНО-а и гамма-интерферон (Conlan, 1994). Наряду с синтезом специфических антител, роль В-клеток связана и с регуляцией притока нейтрофилов в селезенку на ранней стадии инфицирования иммунных мышей (Bosio, 2001).
К недостаткам существующих живых вакцин следует отнести их высокую ре-актогенность и остаточную вирулентность, что не исключает возможность возникновения инфекционного процесса у лиц с нарушениями иммунного статуса (Hollis, 1989; Whipp, 2003; Leelaporn, 2008). Реактогенность, являющаяся одним из важных признаков вакцинного штамма, коррелирует с остаточной вирулентностью. Высокая чувствительность мышей к туляремии (Elkins, 2003; Conlan, 2003) и расширенный к настоящему времени спектр методов изучения физиологических параметров у этих животных обусловливают целесообразность использования этой модели для оценки реактогенности потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы. В качестве критерия тяжести клинических проявлений при экспериментальной туляремии у мышей используют динамику изменения веса животных (Chiavolini, 2008; Ray, 2009)
Таким образом, подбор критериев реактогенности и разработка алгоритма отбора и оценки создаваемых генетически детерминированных кандидат-вакцин на основе штамма F. tularensis 15 НИИЭГ является актуальной задачей современных исследований в области туляремии. Следует подчеркнуть важность скрининговой оценки генетически детерминированных вакцинных штаммов F. tularensis, поэтому ключевым этапом в изучении свойств кандидат-вакцин может являться обоснованное применение клеточных тестов in vitro, позволяющих минимизировать использование экспериментальных животных, что соответствует мировым этическим стандартам.
Цель исследования - разработка алгоритма отбора и предварительной оценки иммунобиологических свойств потенциальных вакцинных штаммов F. tularensis на мышиной модели.
Задачи исследования:
1. Выбрать линию мышей, позволяющую адекватно оценивать иммунопротектив-
ные свойства потенциальных вакцинных штаммов F. tularensis.
2. Оценить возможность использования макрофагоподобных клеток
линии J774.1A для предварительной характеристики (способности к внутрикле
точному размножению) и отбора потенциальных вакцинных штаммов
F. tularensis.
-
Выбрать критерии реактогенности и иммуногенности потенциальных вакцинных туляремийных штаммов на мышиной модели туляремии.
-
Провести сравнение иммунобиологических свойств потенциального вакцинного туляремийного штамма F. tularensis 15/23-1АгесА и вакцинного штамма 15 НИИЭГ.
-
Разработать алгоритм отбора и оценки потенциальных туляремийных вакцинных штаммов.
Научная новизна
Приоритет в способе стабилизации и аттенуации вакцинного туляремийного штамма защищен патентами на изобретение № 2457247 и № 2460791 РФ и подана заявка на получение патента на изобретение под № 2013147130 от 23.10.2013 г. «Штамм Francisella tularensis 15/23-АгесА со сниженной реактогенностью для создания живой туляремиинои вакцины и способа ее получения».
Впервые установлено, что использование мышиной макрофагоподобной клеточной линии1774.1А позволяет предварительно оценить способность кандидатов в вакцинные штаммы F. tularensis к размножению, распространению и приживаемости в организме мышей линии BALB/c.
Впервые показана возможность использования мышей линии BALB/c для определения реактогенности, приживаемости и иммуногенной активности кандидатов в вакцинные штаммы туляремийного микроба.
Показано, что изменение веса и гематологические показатели крови у мышей достоверно изменяются в зависимости от остаточной вирулентности туляремийных штаммов и могут служить критериями реактогенности потенциальных вакцинных штаммов F. tularensis.
Практическая значимость
В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ФБУН ГНЦ ПМБ («ГКПМ-Оболенск») депонированы штаммы F. tularensis subsp. holarctica 15ArecA (per. номер 6622) с делецией гена recA, F. tularensis subsp. holarctica 15ArecD (per. номер B-6823) с делецией гена recD, F. tularensis subsp. holarctica 15/23-ІАгесА (per. номер 6623) с делецией одной копии гена iglC и гена гесА, F. tularensis subsp. holarctica 15/23-lArecD (per. номер B-6821) с делецией одной копии гена iglC и гена recD (федеральный уровень внедрения).
По материалам диссертации составлены методические рекомендации: «Порядок работы с СПФ животными в современных исследованиях», одобренные Ученым советом ФБУН ГНЦ ПМБ и утвержденные директором ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ № 7 от 11.09.2013 г.); «Использование современных средств содержания животных», одобренные Ученым советом ФБУН ГНЦ ПМБ и утвержденные директором ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ № 7 от 11.09.2013 г.). «Оценка напряженности специфического клеточного иммунитета у людей к возбудителю туляремии in vitro», одобренные Ученым советом ФБУН ГНЦ ПМБ и утвержденные директором ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ № 8 от 07.10.2011 г.) (учрежденческий уровень внедрения).
Разработанный алгоритм отбора и предварительной оценки иммунобиологических свойств потенциальных вакцинных штаммов F. tularensis используется для изучения свойств потенциальных кандидатов в вакцинные штаммы против туляремиинои инфекции (учрежденческий уровень внедрения).
Материалы диссертации используются при чтении лекций на курсах первичной специализации и повышения квалификации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при ФБУН ГНЦ ПМБ (учрежденческий уровень внедрения).
Методология и методы исследования
В исследованиях использовали экспериментальные методы: микробиологические, биологические, биохимические, иммунологические, оценки физиологического состояния животных, методы статистической обработки результатов.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Мыши линии BALB/c являются адекватной моделью для характеристики потенциальных туляремийных вакцинных штаммов.
-
Размножение штаммов F. tularensis с разной степенью аттенуации в макро-фагодобных клетках линии J774.1А коррелирует с приживаемостью и иммуно-генностью этих штаммов в организме мышей линии BALB/c.
-
Вес и гематологические показатели у мышей являются интегральными критериями реактогенности туляремийных вакцинных штаммов.
-
Уровень синтеза гамма-интерферона спленоцитами мышей, иммунизированных штаммами F. tularensis с разной степенью аттенуации, коррелирует с про-тективными свойствами этих штаммов и может использоваться как один из критериев иммуногенности.
-
Штамм F. tularensis 15/23-1АгесА обладает сниженной реактогенностью, стабильностью биологических свойств и сохраняет иммуногенность, сравнимую с существующим вакцинным штаммом 15 НИИЭГ.
Апробация результатов
Результаты исследований получены с использованием современного поверенного и сертифицированного оборудования с привлечением статистических методов обработки данных.
Материалы диссертации представлены на четырех Всероссийских и международных научных конференциях: международной конференции «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (Санкт-Петербург, 5-7 июня 2013 года), 2-ой ежегодной научно-практической конференции «Наука о лабораторных животных: современные подходы» (Санкт-Петербург, 21-22 декабря 2012 г.), 5-ой Балтийской международной конференции «Микробные углеводы» (Суздаль, 2-6 сентября 2012 г.) и на научно-практической школе конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 25-27 мая 2010 г.).
План и аннотация диссертации обсуждены и одобрены на заседании Ученого совета ФБУН ГНЦ ПМБ от 20 апреля 2012 г. (протокол №5, приказ №118 от 27 апреля 2012г.). Результаты исследований доложены на заседании межлабораторного научного семинара ФБУН ГНЦ ПМБ (протокол № 33 от 1 октября 2013 г.).
Публикации
Основное содержание работы отражено в 12 научных публикациях, в том числе в 5 статьях в журналах из списка изданий, рекомендованных ВАК, два патента на изобретение, одна заявка на патент и четыре работы - в материалах конференций.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, три главы результатов исследований с их обсуждением, заключение, выводы и список использованных источников, включающий 45 работ отечественных и 192 зарубежных авторов. Работа содержит 14 таблиц и иллюстрирована 24 рисунками.
