Введение к работе
Актуальность проблемы
Чума - одна из наиболее опасных инфекционных болезней человека На протяжении многих веков чумной микроб был причиной массовых эпидемий Документальные подтверждения о массовых поражениях людей во многих странах мира датируются с V века до нашей эры. И в настоящее время чума представляет реальную угрозу, так как является природно-очаговым заболеванием и периодически вызывает эпизоотии в 42 природных очагах Российской Федерации и ближнего зарубежья [Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., 2004], а также в других странах мира. По данным ВОЗ в мире ежегодно регистрируется более 2000 случаев заболеваний человека чумой [Plague, WHO, 2009].
Возбудитель чумы обладает высокой фенотипической и генетической изменчивостью, отмеченной рядом исследователей, как для штаммов из разных природных очагов, так и для штаммов, циркулирующих в одном природном очаге [Anisimov А.Р. et al., 2004].
Зарубежные исследователи для внутривидовой дифференциации штаммов чумного микроба используют классификацию, предложенную R. Devignat (1951) Классификация основана на биохимических различиях (способности к ферментации глицерина, редукции нитратов и окислению аммиака) и историко-географическом происхождении штаммов. Согласно данной классификации штаммы чумного микроба распределяют на три биовара: antiqua (античный)' medievalis (средневековый) и orientalis (восточный). Эта классификация не учитывает разнообразие штаммов, выделяемых на территориях Центральной Азии Кавказа, Западной Сибири, Африки. Об этом свидетельствуют опубликованные в последние годы сведения о рамнозопозитивных слабовирулентных штаммах из природных очагов полевочьего типа Китая, которые D. Zhou et al. (2004) выделили в новый биовар microtus, а также ряд публикаций отечественных ученых описывающих разные подвиды чумного микроба из природных очагов на территории России и ближнего зарубежья [Тимофеева Л.А. с соавт., 1974- Елкин Ю.М. с соавт., 1977; Логачев Л.И., 1979; Вершинина Т.Н., 1986].
Классификация, принятая в 1985 г. на Всесоюзном совещании по таксономии чумного микроба, основана на фенотипических свойствах, вирулентности по отношению к лабораторным животным и ландшафтно-географической приуроченности штаммов. Согласно этой классификации все штаммы Yersinia pestis подразделяют на пять подвидов - основной и 4 неосновных (кавказский алтайский, гиссарский и улэгейский) подвида. Штаммы основного подвида с высоким эпидемическим потенциалом вирулентны как для диких, так и для лабораторных животных. Фенотипические характеристики штаммов основного подвида, выделяемых в разных природных очагах, различаются и соответствуют характеристикам какого-либо из биоваров: antiqua, medievalis, orientalis. Штаммы неосновных подвидов избирательно вирулентны для лабораторных животных, их эпидемическая значимость ниже, чем у штаммов основного подвида.
До сих пор широко используются методы индикации, идентификации типирования чумного микроба, основанные на определении различных фенотипических свойств. Нестабильность фенотипа затрудняет интерпретацию результатов, что может привести к ошибочным выводам. Бурное развитие молекулярной генетики в последнее время привело к разработке приемов детекции, идентификации и типирования микроорганизмов, основанных на анализе
структуры генома. Использование более стабильной основы позволит повысить точность индикации, идентификации и типирования штаммов чумного микроба и усовершенствовать фенотипические схемы классификации.
В то же время, каждый молекулярно-генетический подход обладает разной информативностью и еще не описан единственный метод, позволяющий эффективно проводить типирование и служить основой для совершенствования таксономии чумного микроба. Поэтому возникает необходимость в комплексном подходе к решению данной проблемы.
Существуют разные мнения по поводу алгоритмов типирования штаммов чумного микроба. Ю.А. Попов с соавт. (2009), проанализировав материалы по генетическому типированию предложили комплексный алгоритм из четырех этапов генодиагностического анализа штаммов Y. pestis: 1-й этап - определение видовой принадлежности штамма (дифференциация чумного микроба от близкородственных иерсиний) путем проведения моно- и мультилокусных ПЦР и плазмидного скрининга; 2-й этап - выявление и определение распространенности генов, ассоциированных с вирулентностью возбудителя с помощью моно- и мультилокусных ПЦР; 3-й этап - выяснение параметров структурной изменчивости генов вирулентности у штаммов Y. pestis различного происхождения методом секвенирования; 4-й этап - определение принадлежности штаммов к конкретному подвиду, биовару, природному очагу посредством моно-и мультилокусных ПЦР, мультилокусного VNTR анализа и секвенирования генов, кодирующих дифференциальные признаки.
Для повышения эффективности этого алгоритма важен правильный выбор ДНК - мишеней, набор которых может пополняться по мере их выявления и изучения. На основе анализа литературных сведений можно говорить о перспективности сочетания таких высокодискриминирующих методов, как метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга (ВРФ), основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов ДНК [Terletski V. et al., 2003, 2004], и метод мультилокусного VNTR анализа (ПЦР - VNTR, сиквенс-VNTR) [Сучков И. Ю. с соавт., 2002, 2004; Pourcel С. et al., 2004; Lowell J. et al., 2005; Li Y. et al., 2009]. ВРФ еще не применялся для типирования штаммов чумного микроба, а варианты VNTR анализа, апробированные на штаммах чумного микроба, обладают либо излишней (по-штаммовой), либо недостаточной (объединяющей штаммы разных подвидов в одну группу) дискриминирующей способностью.
Поэтому выбор ДНК мишеней с тандемными повторами, определяющими подвидовую и очаговую принадлежность штаммов весьма актуален. Сочетание методов, позволяющих судить о внутривидовых вариациях всего генома (вычитающий рестрикционный фингерпринтинг) и отдельных его локусов (VNTR анализ), позволит наиболее эффективно оценивать таксономическое положение изучаемых штаммов чумного микроба, выявлять их эволюционные связи, проводить паспортизацию штаммов.
Цель работы - разработка методических подходов для генетического типирования штаммов чумного микроба на основе VNTR анализа и метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга.
Задачи исследования:
1. Охарактеризовать штаммы чумного микроба, циркулирующие в природных очагах стран СНГ и Монголии, по наличию основных детерминант вирулентности и изучить их фенотипическое проявление. Подобрать штаммы,
полноцепные по составу детерминант вирулентности, на которых будет изучаться эффективность методов генетического типирования.
2. Выбрать потенциальные пары ферментов для проведения вычитающего
рестрикционного анализа штаммов чумного микроба и вирулентных штаммов
псевдотуберкулезного микроба Проверить эффективность выбранных пар
рестриктаз на референтных штаммах.
3. Получить фингерпринты вычитающей рестрикции репрезентативной
выборки штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов. Провести
компьютерный анализ данных вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и
оценить эффективность дифференциации штаммов чумного микроба из разных
очагов и вирулентных штаммов возбудителя псевдотуберкулеза.
-
Выявить новые вариабельные тандемные нуклеотидные повторы в геноме }'. pestis. Подобрать праймеры к обнаруженным областям с тандемными повторами и оптимизировать параметры амплификации этих областей.
-
Изучить вариабельность выявленных VNTR областей генома штаммов Y. pestis разного происхождения и вирулентных штаммов У. pseudotuberculosis. Определить нуклеотидную последовательность фрагментов ДНК, содержащих вариабельные тандемные повторы.
6. Разработать способ VNTR-ПЦР дифференциации штаммов чумного и
псевдотуберкулезного микробов с одновременным внутривидовым типированием
штаммов чумного микроба. Разработать методический подход к
мультиспейсерному сиквенс типированию для идентификации и генотипирования
штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба.
7. Оценить эффективность использования метода вычитающего
рестрикционного фингерпринтинга, разработанных мультиспейсерного сиквенс
типирования и VNTR-ПЦР для дифференциации чумного и псевдотуберкулезного
микробов, генетического типирования, усовершенствования схем классификации
чумного микроба и эпидемиологического анализа штаммов чумного микроба
разного географического происхождения.
Научная новизна работы
Получена характеристика штаммов Y. pestis из природных очагов стран СНГ и Монголии по особенностям фенотипа и распространенности детерминант вирулентности - области пигментации и плазмиды кальцийзависимости. Показано, что в некоторых природных очагах (Дагестанский равнинно-предгорный, Зауральский степной и Волго-Уральский песчаный) циркулируют группы штаммов с повышенной частотой утраты детерминант вирулентности как хромосомной, так и плазмидной локализации.
Впервые получены молекулярные портреты штаммов чумного и псевдотуберкулезного микробов с помощью метода вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и показана корреляция фингерпринтов штаммов чумного микроба с их подвидовой принадлежностью, а в ряде случаев- с очаговой принадлежностью.
Впервые на основе VNTR областей межгенных пространств /u Показано, что разработанный способ мультиспейсерпого сиквенс типирования эффективен при типировании штаммов псевдотуберкулезного микроба. Теоретически обосновано и экспериментально установлено, что усовершенствование классификационных систем, основанных на фемотипических характеристиках, не всегда позволяющих четко определить принадлежность штаммов чумного микроба к очагу и мезоочагу, возможно па основе комплексного использования методов мультиспейсерного сиквенс типирования и вычитающего рестрикционного фингерпринтинга Удачный выбор ДНК-мишеней и молекулярпо-генетических методик, основанных на мультиспейсерном сиквенс типировании и вычитающем рестрикционном фингерпринтинге, позволили охарактеризовать особенности генетической структуры таласских штаммов чумного микроба. Определено, что генотипы таласских штаммов имеют уникальную генетическую формулу по строению вариабельных участков /ra/G-YPOI967 и YPO196I-YPO1960. В ходе кластерного анализа методом попарного невзвешенного группирования с арифметическим усреднением (UPGMA) определена наибольшая близость штаммов таласской группы к штаммам неосновных подвидов. По результатам работы получен патент на изобретение, зарегистрированное в государственном реестре интеллектуальной собственности Российской Федерации: «Способ дифференциации чумного и псевдотуберкулёзного микробов с одновременной внутривидовой дифференциацией штаммов чумного микроба» №2332464. Практическая значимость работы Разработана VNTR-ПЦР, использующая в качестве ДНК-мишени hutG -YP01967 область, для дифференциации штаммов чумного и псевдотуберкулезного микроба и одновременного внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Очевидно, что использование данного метода в практической работе учреждений Роспотребнадзора имеет экономическое преимущество. По результатам работы составлены методические рекомендации: «Выделение противочумного института «Микроб» (протоколы № 2 от 17. 04. 2007 г., № 7 от 12. 12. 2008 г., соответственно). Положения, выносимые на защиту: Для оценки эффективности методов генетического типирования создана референс-панель штаммов чумного микроба, отобранных из различных ландшафтно-географических областей, с полным набором детерминант вирулентности. Метод вычитающего рестрикционного фингерпринтинга эффективен для внутривидового типирования штаммов чумного микроба. Подобранная комбинация эндонуклеаз рестрикции ЕсоШ - Paul позволяет получать молекулярные портреты штаммов чумного микроба, отражающие их подвидовую и очаговую принадлежность. Мультиспейсерное сиквенс типирование на основе трех VNTR областей хромосомы: /to/G-YP01967, YP01967-arwE, YPO1961-YPO I960 позволяет дифференцировать штаммы чумного и псевдотуберкулезного микроба, определять подвидовую, очаговую и мезоочаговую принадлежность штаммов чумного микроба. 4. VNTR - ПЦР с праймерами TAN1-TAN2 дифференцирует штаммы 5. Кластеры генотипов, полученные методами вычитающего рестрикционного 6. Генотипы штаммов чумного микроба Таласской группы, полученные Апробация работы. Материалы диссертации представлены на следующих конференциях: II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями» (Санкт-Петербург, 2006); IX съезд Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); X Всероссийская медико-биологическая конференция молодых исследователей "Человек и его здоровье" (Санкт-Петербург, 2007); Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Генодиагностика инфекционных заболеваний — 2007» («Молекулярная диагностика - 2007» Москва, 2007), Международная школа - конференция «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (посвященная 40-летию создания ГосНИИгенетика, Москва -Пущино, 2008), XII Всероссийская медико - биологическая научная конференция молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург. 2009). Так же результаты исследования были представлены и доложены на ежегодных итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009 гг.). Публикации По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, из которых 4 опубликованы в рекомендованных ВАК РФ изданиях. Структура и объем диссертации Диссертация представлена на 173 страницах машинописного текста, состоит из введения, главы обзора литературы, семи глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 13 таблицами и 21 рисунком. Библиографический указатель содержит 163 источника, из них 51 отечественная и 112 зарубежных работ.
и очистка геномной ДНК Yersinia pestis, пригодной для тонких молекулярно-
биологических экспериментов», «Способ межвидовой и внутривидовой
дифференциации патогенных иерсиний {Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis) с
определением их потенциальной вирулентности», одобренные Ученым советом и
утвержденные директором Российского научно-исследовательского
чумного и псевдотуберкулезного микроба, а также штаммы чумного микроба,
принадлежащие к разным подвидам и циркулирующие в разных природных очагах.
фингерпринтинга и мультиспсйсерного сиквспс типирования, полностью
коррелируют с существующей подвидовой классификацией чумного микроба и
показывают неоднородность большинства подвидов в соответствии с очаговой
принадлежностью.
методами вычитающего рестрикционного фингерпринтинга и мультиспейсерного
сиквепс типирования, имеют существенные отличия от генотипов штаммов
известных подвидов, что позволяет выделить их в отдельный внутривидовой
таксон.Похожие диссертации на Разработка методических подходов к генотипированию штаммов чумного микроба
