Введение к работе
Актуальность проблемы
Холера продолжает оставаться одной из наиболее важных социально-значимых инфекций и представляет серьезную проблему для мирового здравоохранения, требующую постоянного и всестороннего контроля и интегрированного подхода к ее решению. Наряду с ростом заболеваемости типичной холерой, этиологическими агентами которой являются холерные вибрионы Vibrio cholerae O1 и О139 серогрупп [Москвитина Э.А. с соавт., 2012; Cholera, Wkly.Epid.Rec., 2011], в различных регионах мира все чаще регистрируются множественные случаи и вспышки острых кишечных инфекций, вызываемых представителями других серогрупп. К настоящему моменту известно более двухсот серогрупп холерных вибрионов, отличающихся по структуре О-боковых цепей основного соматического антигена [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001; Beltran P. et al., 1999]. Патогенный и эпидемический потенциал холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп остается малоисследованным. Известны случаи, когда эти вибрионы явились причиной крупных вспышек холероподобных инфекций, таких как произошедшие в Судане и Чехословакии в 1968 г., в Перу в 1994 г., в Индии в 1996 г. [Aldova E. et al., 1968; Dalsgaard A. et al., 1995; Rudra S. et al., 1996; Faruque S.M. et al., 1998]. Чаще патогенные вибрионы неО1/неО139 серогрупп вызывают небольшие локальные вспышки кишечных инфекций или отдельные случаи гастроэнтеритов, септицемий, кожных и других болезней [Rivera I.N.G. et al., 2001; Ottaviani D. et al., 2011]. Аналогичные случаи, обусловленные V. cholerae неО1/неО139 регистрируются и в Российской Федерации – в Поволжском регионе (в Астраханской, Саратовской, Самарской, Нижегородской областях, Калмыкии, Башкирии, Мордовии), других регионах России (в Ростовской, Челябинской, Пермской областях) и в ближнем зарубежье (в Узбекистане, Туркмении, Украине) [Онищенко Г.Г. с соавт., 2001]. В то же время свойства штаммов V.cholerae неО1/неО139, выделенных на этих территориях, исследованы лишь фрагментарно. В литературе имеется ограниченное число публикаций по фенотипическим и генетическим особенностям штаммов V.cholerae неО1/неО139, в том числе и по изучению распространения у них основных и дополнительных факторов патогенности, характерных для традиционных возбудителей холеры О1 и О139 серогрупп. Практически отсутствуют данные по изучению организации геномов штаммов V.cholerae неО1/неО139, выделенных на территории Поволжского региона России. Остаются не вполне ясными механизмы патогенности вибрионов неО1/неО139 серогрупп, лишенных, как правило, генетических детерминант основных факторов вирулентности - генов холерного токсина (ХТ) ctxAB и токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА) tcpA. Их выявление представляет собой важную задачу, в том числе и для практического здравоохранения. Лишь отчасти исследовано у холерных вибрионов различных серогрупп распространение генов патогенности, таких
как различные токсины и факторы колонизации, системы секреции разных типов [Монахова Е.В., 2012; Ghosh C. et al., 1997]. Предполагается, что штаммы неО1/неО139 серогрупп являются природными резервуарами генов факторов патогенности, которые они могут передавать другим холерным вибрионам [Chatterjee S. et al., 2009]. Особый интерес представляет изучение токсигенных штаммов V.cholerae неО1/неО139, способных к продукции основных факторов вирулентности – ХТ и ТКПА. Исследование таких штаммов необходимо для получения ответа на вопрос о механизмах образования вирулентных штаммов V.cholerae различных серогрупп и определения наиболее вероятных путей формирования новых опасных вариантов V.cholerae, которые могут оказаться способными к эпидемическому распространению и представить значительную проблему в связи с отсутствием специфических средств диагностики и профилактики вызываемой ими инфекции.
Цель работы
Определение распространения генов факторов патогенности и персистенции и проведение их структурно-функционального анализа у штаммов Vibrio cholerae неО1/неО139 серогрупп.
Задачи исследования
1. Получить комплексную фенотипическую характеристику штаммов V.cholerae неО1/неО139, выделенных в Российской Федерации, в ближнем и дальнем зарубежье, на основе анализа данных по их культурально-морфологическим, биохимическим, серологическим свойствам и по антибиотикоустойчивости.
2. Определить распространение генов основных и дополнительных факторов вирулентности возбудителя холеры у вибрионов неО1/неО139 серогрупп, выделенных в Поволжском и других регионах Российской Федерации и на территории пограничных государств в периоды различных эпидемических ситуаций.
3. Установить генетические особенности штаммов V.cholerae неО1/неО139, изолированных на эндемичных по холере территориях в Юго-Восточной Азии.
4. Провести генетический анализ токсигенных вибрионов неО1/неО139 серогрупп, выделенных в Узбекистане и Юго-Восточной Азии. Установить молекулярные механизмы их формирования.
5. Определить распространение у штаммов V.cholerae неО1/неО139 генов систем секреции третьего и шестого типов, генов некоторых токсинов. Разработать способ детекции различных вариантов структурного гена токсинкорегулируемых пилей адгезии tcpA у холерных вибрионов разных серогрупп и выявить с его помощью новые аллели этого гена.
6. Разработать способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов различных серогрупп на основе вариабельности генов gmhD, orf2 и rjg, фланкирующих кластер генов биосинтеза О-антигена.
Научная новизна работы
Получена комплексная фенотипическая и генетическая характеристика штаммов V.cholerae неО1/неО139, выделенных на территории Поволжского и других регионов Российской Федерации, а также в ближнем зарубежье. Выявлен ряд антибиотикоустойчивых (к стрептомицину, ампициллину, канамицину, сульфаметаксазолу и тетрациклину) штаммов холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп, циркулирующих на эндемичных по холере территориях.
Впервые установлено, что в геноме большинства штаммов V.cholerae неО1/неО139, выделенных в Поволжском регионе, как и в других регионах Российской Федерации, отсутствуют гены основных факторов патогенности – ХТ и ТКПА, а также гены островов патогенности VPI, VPI-2; пандемичности VSP-I, VSP-II; коньюгативных транспозонов. В тоже время показано, что в коровой части хромосомы всех этих штаммов содержатся гены hapA, rtxA, hlyA, кодирующие биосинтез факторов патогенности – гемагглютинин/протеазы, мультифункционального автопроцессируемого токсина RTX, гемолизина/цитолизина. Показано, что холерные вибрионы неО1/неО139 серогрупп, выделенные в эпидемически значимые периоды, а также циркулирующие на эндемичных территориях, содержат большее число генов патогенности, что указывает на потенциальную опасность этих штаммов. Впервые проведено развернутое исследование генетической организации токсигенных штаммов неО1/неО139 серогрупп, выделенных в Узбекистане. Установлено, что они имеют уникальный состав генов факторов патогенности и содержат новые аллели этих генов, не встречающиеся у эпидемических штаммов О1 и О139 серогрупп, что подтверждает принадлежность этих штаммов к независимым линиям эволюции вирулентных V.cholerae.
Впервые разработана ПЦР с универсальными праймерами, обеспечивающая детекцию различных вариантов структурного гена tcpA ТКПА, и выявлены новые аллели этого гена у штаммов V.cholerae неО1/неО139. Установлено, что в геноме 30% холерных вибрионов неО1/неО139 серогрупп, выделенных в Российской Федерации и за рубежом, содержатся гены системы секреции третьего типа (СС3Т), и в геномах всех штаммов – системы секреции шестого типа (СС6Т), которые могут отвечать за патогенные свойства этих вибрионов. Впервые разработан эффективный способ определения генетического родства штаммов V.cholerae различного происхождения, основанный на вариабельности генов gmhD, orf2 и rjg, фланкирующих кластер генов О-антигена. Приоритетность разработки подтверждена получением патента на изобретение «Способ определения генетического родства холерных вибрионов различных серогрупп методом секвенирования генов, фланкирующих кластер генов биосинтеза О-антигена» (Патент RU №2393231). С помощью этого метода впервые установлено, что штаммы V.cholerae, имеющие клональное происхождение, могут относиться к различным серогруппам, что свидетельствует о наличии механизма изменения серогрупповой принадлежности, не связанного с горизонтальным переносом генов кластера О-антигена.
Практическая значимость работы
По результатам работы оформлены и утверждены методические рекомендации «Способ определения генетического родства штаммов холерных вибрионов методом секвенирования генов, фланкирующих кластер генов биосинтеза О-антигена», утвержденные директором института 12 декабря 2008 г. Разработаны методические рекомендации «Детекция различных вариантов гена tcpA токсин-корегулируемых пилей адгезии возбудителя холеры в ПЦР с универсальными праймерами», утвержденные директором института 20 апреля 2012 г. Полученные данные молекулярно-генетического анализа V.cholerae неО1/неО139 используются для паспортизации штаммов ГКПБ при РосНИПЧИ «Микроб». В ГКПБ депонирован Vibrio cholerae КМ227, в качестве модельного штамма холерного вибриона неО1/неО139 серогруппы, содержащего в геноме остров пандемичности VSP-II, SXT элемент и гены СС3Т и СС6Т и рекомендуемого для изучения роли этих генетических элементов в патогенности холерных вибрионов. Полученные в ходе выполнения работы данные по генетической организации штаммов V.cholerae неО1/неО139 используются при чтении лекций на курсах «ПЦР в диагностике инфекционных болезней и индикации патогенных микроорганизмов» при РосНИПЧИ «Микроб».
Положения, выносимые на защиту
1. Штаммы V.cholerae неО1/неО139 серогрупп, выделенные в Поволжском и других регионах Российской Федерации, как правило, не содержат генов ctxA и tcpA основных факторов патогенности – холерного токсина и токсинкорегулируемых пилей адгезии, но несут гены hapA биосинтеза гемагглютинин/протеазы, rtxA мультифункционального автопроцессируемого токсина RTX, hlyA гемолизина/цитолизина. В геномах 30% этих штаммов присутствуют гены системы секреции третьего типа, и у всех штаммов содержатся гены системы секреции шестого типа. Сочетанное действие этих факторов может обеспечивать патогенность штаммов V.cholerae неО1/неО139.
2. Холерные вибрионы неО1/неО139 серогрупп, выделенные в эпидемически значимые периоды, а также циркулирующие на эндемичных территориях, содержат большее число генов патогенности, что делает их потенциально опасными штаммами, а также природными резервуарами этих генов.
3. Токсигенные штаммы неО1/неО139 серогрупп имеют уникальный состав генов факторов патогенности, не встречающийся в таком сочетании у эпидемических штаммов О1 и О139 серогрупп. Значительные отличия в нуклеотидных последовательностях их генов от эпидемических изолятов V.cholerae свидетельствуют о принадлежности большинства изученных токсигенных штаммов неО1/неО139 серогрупп к независимым линиям эволюции токсигенных холерных вибрионов.
4. Впервые на основе использования вариабельности генов gmhD, orf2 и rjg, фланкирующих кластер генов биосинтеза О-антигена, установлено, что штаммы V.cholerae неО1/неО139, имеющие клональное происхождение, могут относиться к различным серогруппам, что подтверждает наличие у них механизма изменения серогрупповой принадлежности, не связанного с горизонтальным переносом генов кластера О-антигена.
Апробация работы
Материалы работы доложены на 10-ой Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург, 2007; VI Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярная диагностика – 2007», Москва, 2007; заседаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации, Ростов-на-Дону, 2008, 2009, 2011 гг.; 3-ей научно-практической школе-конференции молодых ученых и специалистов «Современные технологии обеспечения биологической безопасности», Оболенск, 2011; IV ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням, Москва, 2012 г.; X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2012 г.; итоговых конференциях РосНИПЧИ «Микроб», 2009 г., 2012 г.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 4 в периодических изданиях из «Перечня ведущих рецензируемых научных журналов, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки России».
Структура и объём диссертации
Диссертация представлена на 170 страницах текста, состоит из введения, главы обзора литературы, шести глав собственных исследований (в том числе, одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 19 рисунками. Библиографический указатель содержит 198 отечественных и зарубежных источников.
