Введение к работе
АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Напряженная эпидемическая ситуация в мире, обусловленная продолжающимися вспышками и эпидемиями холеры в странах Юго-Восточной Азии и Африки, создают реальную возможность завоза этой инфекции на территорию России (Андрусенко и др., 2009; Ломов, 2009; Марамович и др., 2009; Safa et al, 2008; Taneja et al, 2009). К настоящему времени известно, что в результате эволюции в пределах вида образовалось три эпидемически опасных штамма, отличающихся друг от друга по структуре и функциям генома - V. cholerae 01 серогруппы классического биовара, V. cholerae 01 серогруппы биовара эльтор и V. cholerae 0139 серогруппы. V.cholerae классического биовара был, видимо, возбудителем первых шести пандемии (1817-1923 гг.) азиатской холеры. Однако к началу прошлого столетия эти вибрионы были вытеснены на эндемичной для них территории холерными вибрионами биовара эльтор, которые вызвали текущую, 7-ю, пандемію холеры, начавшуюся в 1961т. и продолжающуюся до сих пор (Бароян, 1971; Смирнова, Кутырев, 2004; Faruque et al., 1998; Sack et al, 2004). Что касается внезапно появившегося в 1992 г. в Индии и Бангладеш эпидемически опасного штамма V.cholerae ранее неизвестной 0139 серогруппы, то прогноз ряда исследователей о начале новой, 8-ой, пандемии холеры, связанной с этим возбудителем, пока не оправдался (Ramamurthy et al., 1993; Mukhopadhyay et al., 1995).
Секвенированне генома V.cholerae показало, что основные факторы его патогенности расположены на мобильных генетических элементах (МГЭ) -умеренных профагах (СТХф и RS1), «островах патогенности» (VPI-1, VPI-2) и «пандемичности» (VSP-I, VSP-2). Ключевым фактором патогенности возбудителя холер является холерный токсин (XT), биосинтез которого определяется генами ctxAB, входящими в состав профага СТХф. При этом xoлqжыe вибрионы классического биовара продуцируют XT 1-ого типа, a V.cholerae биовара эльтор -XT 2-ого типа. Наличие большого числа МГЭ определяет высокую вариабельность генома возбудителя холеры, которая выражается в изменении его размеров и функции за счет потери или приобретения мобильных элементов. Такие изменения генома могут обусловить появление новых клонов с разным набором генов патогенности. Так, в последнее время происходит формирование патогенных клонов V. cholerae биовара эльтор, отличительной особенностью которых является присутствие либо
МГЭ, либо их отдельных генов, характерных только для классических вибрионов. Наибольший интерес представляют штаммы V.cholerae биовара эльтор, содержащие классический профаг СТХф и продуцирующие XT 1-ого типа. Такие штаммы, как правило, более вирулентные и вызвали эпидемические вспышки холеры в Бангладеш, Мозамбике, Индии и Вьетнаме (Safa et al, 2006; Raychoudhuri et al, 2008; Safa et al, 2008; Nguyen et al, 2009; Taneja et al, 2009). Наряду с появлением атипичных штаммов с повышенной вирулентностью значительную проблему представляют .и нетоксигенные клоны, сохранившие весь набор других известных генов патогенности. Эти штаммы являются потенциально эпидемически опасными и способны вызывать диарейные заболевания за счет, видимо, дополнительных факторов патогенности (Онищенко и др., 2007; Монахова и др., 2009; Boyd et al, 2000; Pichel et ah, 2003; Sing et ah, 2001). Одним из возможных механизмов образования таких атоксигенных клонов может быть спонтанная утрата генома лрофага СТХф (Кульшань и др., 2006; Смирнова и др., 2007).
Таким образом, вполне очевидна актуальность исследований, направленных на дальнейшее изучение механизмов формирования атипичных штаммов с измененными вирулентными свойствами V.cholerae. В первую очередь большой интерес представляют исследования механизмов образования высокотоксигенных штаммов V.cholerae биовара эльтор. Эта проблема имеет не только существенное фундаментальное значение, но и представляет практическую ценность, поскольку штаммы с высоким уровнем продукции XT 2-ого типа могли бы использоваться для получения этого белка, необходимого для создания более эффективных холерных диагностических и профилактических препаратов. Широкое распространение среди разных штаммов транспозонов, локалюованных на плазмидах или входящих в состав интегронов, и их большой вклад в эволюцию патогенных бактерий позволяют рассмотреть возможность их участия в изменении продукции холерного токсина у возбудителя холеры эльтор.
ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ - получение и сравнительный анализ фенотипических и молекулярно-генегических свойств различных атипичных по продукции холерного токсина штаммов V.cholerae биовара эльтор.
С помощью транспозона Tn5-Mob (KmR) на модельном штамме V.cholerae МАК757 биовара эльтор получить мутанты с измененной продукцией XT.
Провести сравнительный фенотипический анализ исходного штамма и мутантов с измененной продукцией XT, определив продукцию гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы (РГАП), шннозо-чувствительных гемагглютішируюігшх пилей адгезии (МЧПА), экзополисахарида, а также подвижность и способность образовывать биопленку; дать оценку вирулентности сравниваемых штаммов.
Провести молекулярно-генетический анализ транспозонных мутантов с измененным уровнем продукции холерного токсина.
Сравнить протеомные профили исходного штамма и мутанта с пшерпродукцией XT.
Выделить, очистить и изучить антигенные свойства XT 2-ого типа, продуцируемого созданным штаммом V.cholerae биовара эльтор с гиперпродукцией этого белка.
Обнаружено, что внедрение транспозона Tn5-Mob (KmR) в хромосолгу модельного штамма V.choleraeMAK757 биовара эльтор, несущего две копии профага СТХср, в 5 % случаев приводит к образованию различных мутантов с измененной продукцией XT. В результате молекулярно-генетического анализа впервые показано, что у мутантов I группы (KmR Тох++ч) произошла индуцированная транспозоном утрата одной из копий профага и сохранение в коровой области второй копии лишь генов ctxAB. Уровень биосинтеза XT у таких клонов, потерявших более 60 % генома коровой части оставшегося профага, но сохранивших лишь onqjoH ctxAB, возрастает более чем в 2000 раз по сравнению с исходным штаммом, составляя 43,0±3,2 мкг/мл по данным ELISA. Во II группе мутантов (KmR Тох**) встраивание транспозона в хромосому привело к потере одной копии профага с сохранением всех генов второй копии, что обусловило увеличение уровня биосинтеза XT более чем в 100 раз (2,7±0,7 мкг/мл). В Ш группу входили нетоксигенные мутанты (KmR Тох~), возникшие в результате утраты всех генов двух копий профагов за исключением гена rstR. Таким образом, показан новый, раннее не известньш путь образования штаммов холерного
вибриона как с повышенной токсигенностыо, так и лишенных этого свойства.
При сравнительном анализе протеомов исходного штамма (МАК757 Тох*) и его мутанта с гиперпродукцией XT (МАК757 KmR Тох+++) обнаружено, что в клетках МАК757 KmR Tox*" из 531 выявленного белка редукцій генома профага сопровождается изменением содержания 27 белков,' из которых репрессируется синтез 23 белков, связанных, в основном, с энергетическим обменом, и индуцируется синтез 4 белков, участвующих в транспорте аминокислот. В целом, полученные данные указывают на происходящие изменения клеточного метаболизма и энергетического гомеостаза у штамма МАК757 KmR Тох'м+, что связано, видимо, с гиперэкспрессией генов XT.
Показано, что полученные мутанты как с повышенной продукцией XT, так и утратившие способность синтезировать этот белок (ветедствие делении обеих копии профага СТХф) могут сохраняться в составе биопленки в течение длительного периода.
Впервые создан бесплазмидный штамм V.cholerae биовара эльтор с высоким уровнем продукции XT. Приоритетность этих данных подтверждена получением патента №2326941 "Штамм бактерий Vibrio с/го/егае-продуцент холерного токсина II типа".
В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирована изогенные штаммы V.cholerae биовара эльтор с различной экспрессией генов ctxAB, которые могут быть использованы для получения новых данных о механизмах регулящш активности генов XT и о влиянии уровня продукции этого фактора патогенности на развитие холерогенной реакции. Полученный штамм с высоким уровнем продукции XT 2-ого типа может быть использован для получения этого белка с целью изготовления более эффективных иммунодиагностических и профилактических препаратов против холеры, вызванной V.cholerae биовара эльтор.
По результатам работы составлены методические рекомендации: «Использование транспозона Tn5-Mob для получения штаммов Vibrio cholerae с измененной продукцией холерного токсина», одобренные Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол №1 от 09 апреля 2009 г.) и утвержденные директором института 24 апреля 2009 г.
