Введение к работе
Актуальность исследования. Почвенные бактерии сем. Rhizobiaceae
вступают в симбиоз с бобовыми растениями. При этом на корнях растений образуются клубеньки, в которых бактерии, преобразованные в бактероиды, фиксируют атмосферный азот. Формирование симбиоза происходит при участии различных сигнальных молекул обоих партнеров. Важную роль в этом процессе играют поверхностные полисахариды бактерий. Клубеньковые бактерии синтезируют четыре типа поверхностных полисахаридов -экзополисахариды (ЭПС), капсулярные полисахариды (КПС), липополисаха-риды (ЛПС) и (3-1,2-глюканы (Fraysse et al., 2003).
Объектом наших исследований были клубеньковые бактерии Sinorhizo-Ыит meliloti, вступающие в симбиоз с люцерной, донником и пажитником. В настоящее время у этого вида ризобий детально изучены только экзополисахариды - ЭПС1 и ЭПС2. У эталонного штамма 1021 S. meliloti была установлена структура ЭПС1 и ЭПС2, изучена генетика их синтеза и его регуляции. Показана роль ЭПС в формировании симбиоза. Липополисахариды - наименее изученные полисахариды S. meliloti. Структура полисахаридной части ЛПС не установлена ни для одного штамма S. meliloti, не выяснены функции большинства генов, контролирующих синтез коровой области ЛПС. Практически ничего не известно о генах синтеза О-цепи S. meliloti. Исследование роли ЛПС в симбиозе проводилось только у штамма 1021 S. meliloti.
Основным подходом в изучении структуры, функций и генетики синтеза полисахаридов в настоящее время остается получение Тп5-транспозоновых мутантов с нарушениями синтеза полисахаридов. Новые возможности в изучении функций полисахаридов и генетики их синтеза открылись после полного секвенирования генома эталонного штамма 1021 S. meliloti (Galibert et al., 2001). Кроме двух уже исследованных кластеров генов, детерминирующих синтез ЭПС1 и ЭПС2, на мегаплазмиде pSynh S. meliloti было выявлено несколько генетических кластеров, которые также могут быть связаны с синтезом полисахаридов (Finan et al., 2001). Их функции у S. meliloti пока не известны. Таким образом, изложенные сведения определяют актуальность данной работы.
Целью нашей работы было - выявление новых генов Sinorhizobium meliloti, вовлеченных в контроль синтеза липополисахаридов и других поверхностных полисахаридов и выяснение их роли в формировании бобово-ризобиальном симбиоза бактерий с Medicago sativa. Задачами данной работы являлись:
Получение Тп5-мутантов S. meliloti с нарушениями синтеза ЛПС и других поверхностных полисахаридов, первичная характеристика их ЛПС и капсулярных полисахаридов при помощи ДСН-ПААГ-электрофореза.
Изучение симбиотических свойств - эффективности и нодуляционной конкурентоспособности - Тп5-мутантов S. meliloti с измененными поверхностными полисахаридами.
Идентификация генов, инактивированных Тп5-инсерциями у полученных мутантов S. meliloti.
Изучение компонентного состава липополисахаридов штамма СХМ1-188
S. meliloti и ЛПС-мутантов с помощью газо-жидкостной хроматографии и гель-фильтрации.
Научная новизна полученных результатов. Впервые получено два Тп5-мутанта S. meliloti, не имеющих высокомолекулярной формы ЛПС (ЛПС1). Показано, что отсутствие ЛПС1 в одном случае связано с Тп5-инсерцией в гене fabF2, кодирующем ацил-АПБ-синтазу, фермент синтеза 27-ОН-С28 жирной кислоты (жк) в липидной части ЛПС, а в другом случае - с Тп5-мутацией в гене metH, кодирующем метионинсинтазу. Показано, что отсутствие высокомолекулярного ЛПС1 у S. meliloti не влияет на способность формировать симбиоз с люцерной и симбиотическую эффективность, но приводит к снижению нодуляционной конкурентоспособности бактерий. Впервые получен Тп5-мутант S. meliloti по гену tolC и показано, что мутация в этом гене приводит к нарушению секреции экзополисахаридов S. meliloti. Установлено, что мутант по гену tolC S. meliloti не способен вступать в симбиоз с Medicago sativa. Показано, что белок-канал TolC у S. meliloti вовлечен в секрецию белков ExsH и ExpEl. Получены Тп5-мутанты S. meliloti по генам SMc00951 и SMc02705 и изучены их симбиотические свойства. Исследован Тп5-мутант S. meliloti по гену phbA и показано, что мутация влияет на синтез ЭПС1 и ПОМ при выращивании бактерий на минимальной среде. Установлено, что ген phbA у S. meliloti транскрибируется во время симбиоза.
Практическая значимость работы. Результаты исследований были использованы в научно-практическом пособии "Биологическое разнообразие клубеньковых бактерий в экосистемах и агроценозах" (Румянцева и др., 2011). Мутант Tsl52, характеризующийся повышенной симбиотической эффективностью и конкурентоспособностью, проходит испытания в географической сети опытов (ГСО). Мутант Tsl52 применяется в качестве штамма-тестера для оценки нодуляционной конкурентоспособности штаммов S. meliloti в микровегетационных опытах. Результаты данной работы могут быть использованы в материалах курса лекций «Симбиогенетика», читаемого на кафедре генетики и селекции СПбГУ. Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Тп5-мутанты S. meliloti, лишенные высокомолекулярной формы ЛПС,
формируют эффективный симбиоз с М. sativa и М. truncatula, но
характеризуются резко сниженной конкурентоспособностью.
Отсутствие высокомолекулярного ЛПС у S. meliloti связано с отсутствием длинноцепочечной 270Н-С28 жирной кислоты в липиде А ЛПС.
Белок TolC у S. meliloti необходим для секреции экзополисахаридов ЭПС1 и ЭПС2, секреции белков ExsH и ExpEl и формирования симбиоза с М. sativa. Апробация работы. Результаты работы были представлены на X Международном конгрессе по азотфиксации (С.-Петербург, 1995), 8-м Международном конгрессе по бактериологии и прикладной микробиологии (Иерусалим, 1996), П-м съезде ВОГиС (С-Петербург, 2000), XVI Международном симпозиуме по гликоконъюгатам (Гаага, 2001), XI Международном конгрессе по молекулярным растительно-микробным взаимодействиям (Санкт-Петербург, 2003), III съезде ВОГиС, (Москва), 2004 г., 12 съезде Общества Микробиологов Украины им. С. Н. Виноградского (Ужгород, Украина, 2009 г.).
Данная работа выполнена с использованием оборудования Центра коллективного пользования "Геномные технологии и клеточная биология" ГНУ ВНИИСХМ 03 Россельхозакадемии (ГК Министерства образования и науки №16.552.11.7047).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 9 тезисов докладов на научных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 2-х глав экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 179 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и 44 рисунка. Список литературы включает 347 наименований, из них 17 - на русском языке.
