Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 8
1.1 Фитогормоны 8
1.1.1. Цитокинины 9
1.1.1.1. Структурно-функциональные свойства цитокининов 9
1.1.1.2. Биосинтез цитокининов 14
1.1.1.2.1. Прямой путь биосинтеза цитокининов (de novo) 14
1.1.1.2.2. Биосинтез цитокининов через тРНК 16
1.1.1.3. Метаболизм цитокининов в растениях 20
1.1.1.3.1. Конъюгация цитокининов 21
1.1.1.3.2. Деградация цитокининов 23
1.1.1.4. Рецепция, передача сигнала, транспорт и регуляторная роль цитокининов 25
1.1.2. Ауксины 27
1.1.2.1. Открытие, структура и физиологические свойства ауксинов 27
1.1.2.2. Биосинтез ИУК, метаболизм и транспорт ауксинов 29
1.1.2.3. Рецепция ауксинов и регуляция ауксинами экспрессии генов 31
1.3. Агробактериальные гены биосинтеза цитокининов и ауксинов 32
1.4. Трансгенные растения с генами биосинтеза цитокининов и ауксинов агробактерий 35
1.4.1. Трансгенные растения с геном ipt 36
1.4.2. Трансгенные растения с генами биосинтеза ауксинов іааМи іааН. 37
2. Материалы и методы 41
2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды 41
2.1.1. Условия культивирования бактерий 42
2.2. Растения 43
2.3. Среды 43
2.3.1.Среды для культивирования растений 43
2.3.2. Микробиологические среды 43
2.4. Реактивы, растворы и ферменты 45
2.5 Выделение, очистка и манипуляции с плазмидной ДНК 45
2.6. Введение метки в ДНК 46
2.7. Выделение суммарной растительной ДНК 46
2.8. Перенос ДНК на фильтры по Саузерну 46
2.9. Гибридизация ДНК на фильтрах по Саузерну 47
2.10. Выделение тотальной растительной РНК с использованием горячего фенола47
2.11. РНК-ДНК гибридизация 48
2.12. ПЦР-анализ рекомбинантных бактерий и трансгенных растений 48
2.13. Определение степени метилирования ДНК 49
2.14. Трансформация листовых дисков табака 49
2.15. Определение активности неомицинфосфотрансферазы II (NPT И) 50
2.16. Экстракция цитокининов из растительного материала 50
2.17. Экстракция и очистка ауксинов из растительного материала 51
2.18. Биотест на содержание ауксинов с помощью колеоптилей пшеницы 51
2.19. Стерилизация семян табака 52
2.20. Определение содержания хлорофиллов и каротиноидов в листьях 52
2.21. Измерение С02-газообмена 52
2.22. Измерение флуоресценции хлорофилла в листьях растений 52
2.23. Определение растворимого белка и углеводов в листьях табака 53
2.24. Определение листовой поверхности листьев и общего сухого веса листьев. 53
2.25. Колонизация растений ассоциативными метилотрофными бактериями Methylovorus mays 54
2.26. Выделение хлоропластов 54
2.27. Измерение скорости фотосинтетического выделения кислорода 54
2.28. Анализ устьиц 54
2.29. Прививка растений 55
2.30. Искусственное переопыление трансгенных растений табака 55
3. Результаты и их обсуждение 56
3.1.Создание и изучение трансгенных растений Nicotiana tabacum, экспрессирующих агробактериальный ген биосинтеза цитокининов 56
3.1.1. Конструирование рекомбинантных плазмид с геном ipt под контролем одинарного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35S) 56
3.1.2. Агробактериальная трансформация растений Nicotiana tabacum генетическими конструкциями с агробактериальными геном биосинтеза цитокининов 59
3.1.3. Молекулярно-генетический анализ трансгенных растений табака, трансформированных генетическими конструкциями с генами биосинтеза цитокининов 62
3.1.4. Морфолого-биохимические характеристики растений с повышенным синтезом цитокининов 64
3.1.4.1. Анализ содержания цитокининов в ipt-растениях 64
3.1.4.2. Вариабельность фенотипов ipt-растений 65
3.1.5. Анализ метилирования ДНК в ipt-растениях табака 68
3.1.6. Изучение влияния цитокининов на ipt-растения и их экспланты в нормальных условиях и при действии стрессовых факторов 72
3.2. Получение и анализ трансгенных растений с геном iaaM 76
3.2.1. Конструирование рекомбинантных плазмид, содержащих ген iaaM под контролем двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35SS) 76
3.2.2. Агробактериальная трансформация растений Nicotiana tabacum генетическими конструкциями, содержащими агробактериальный ген биосинтеза ауксинов 79
3.2.3. Молекулярно-генетический анализ растений табака, трансформированных генетическими конструкциями с геном iaaM. 80
3.2.4. Морфолого-биохимические характеристики растений с повышенным синтезом ауксинов 82
3.2.4.1. Анализ роста іааМ-растений в условиях in vitro 82
3.2.4.2. Анализ роста и развития іааМ-растений в условиях закрытого грунта 83
3.2.4.3. Определение уровня эндогенных ауксинов 85
3.2.4.4. Репродуктивные свойства іааМ-растений и анализ первого поколения трансгенных растений 87
3.3. Изучение фотосинтетических параметров в трансгенных растениях с генами ipt и iaaM. 90
3.4. Изучение химерных трансгенных растений табака с различным уровнем ауксинов и цитокининов 96
3.5. Исследование антисмыслового ингибирования генов биосинтеза фитогормонов в трансгенных растениях табака 100
Заключение 107
- Агробактериальные гены биосинтеза цитокининов и ауксинов
- Гибридизация ДНК на фильтрах по Саузерну
- Получение и анализ трансгенных растений с геном iaaM
- Изучение фотосинтетических параметров в трансгенных растениях с генами ipt и iaaM.
Введение к работе
Развитие современных методов генной инженерии растений позволяет по-новому решать разнообразные задачи физиологии, биохимии и молекулярной биологии растений. В 1983 году были опубликованы первые работы по созданию трансгенных растений табака, содержащих чужеродные репортерные гены и гены устойчивости к антибиотикам. В настоящее время благодаря большому скачку в развитии молекулярной биологии стало возможным получение трансгенных растений, экспрессирующих разнообразные гены под контролем промоторов различной силы, локализации и специфичности. Полученные растения используются как в чисто научных целях, так и для создания новых сортов и продуцентов биологически активных веществ.
Как известно, жизнь растений находится под постоянным гормональным контролем. Изменение гормонального баланса растений за счет введения дополнительных генов, участвующих в биосинтезе или деградации гормонов, открывает широкие возможности для изучения гормональной регуляции растений по сравнению с использовавшимися прежде экзогенными методами. Такой подход является наиболее перспективным при решении самых сложных задач от изучения отдельных функций гормонов, системы их взаимной регуляции, их роли в защитных реакциях растений на абиотические стрессы до решения вопросов, связанных с механизмами действия гормонов, их рецепцией и трансдукцией гормонального сигнала в растении. Цитокинины и ауксины являются одними из важнейших гормонов растений. Трансгенные растения с измененным балансом цитокининов и ауксинов за счет встраивания агробактериальных генов их биосинтеза служат удобной моделью для пополнения наших знаний о роли этих гормонов в регуляции процессов роста, репродукций, старения и защитных реакциях растений на неблагоприятные условия. Получение трансгенных растений с антисмысловыми конструкциями этих генов позволяет исследовать возможность антисмыслового ингибирования онкогенов в процессе агробактериальной трансформации растений и создает предпосылки для создания растений с повышенной устойчивостью к этим фитопатогенам.
В связи с этим были поставлены следующие задачи: - получение трансгенных растений табака с агробактериальными генами биосинтеза цитокининов ipt и синтеза ауксинов іааМ, в прямой (смысловой) и обратной (антисмысловой) ориентациях по отношению к промоторам;
- исследование биохимических, физиологических и фотосинтетических свойств полученных растений в условиях in vitro и in vivo;
- анализ влияния измененного содержания фитогормонов на устойчивость растений к стрессовым факторам: пониженным температуре и освещенности, повышенным концентрациям соли, условиям фотоингибирования;
- получение и анализ химерных растений с различным уровнем цитокининов и ауксинов в привое и подвое;
- исследование ингибирования экспрессии агробактериальных генов синтеза фитогормонов с помощью стратегии антисмысловых РНК в полученных трансгенных растениях.
Агробактериальные гены биосинтеза цитокининов и ауксинов
Продукция цитокининов и ауксинов свойственна не только растениям, но и многим бактериям, являющимся симбионтами или паразитами растений (Morris, 1986; Картель и др., 1994). К таким микроорганизмам относятся почвенные патогенные бактерии Agrobacterium tumefaciens, вызывающие опухоли у целого ряда видов растений (Amasino a. Miller., 1982; Hoekema et al., 1983; Пирузян, 1985; Jin et al., 1987). Процесс опухолеобразования у растений, вызываемый агробактериями, обусловлен переносом и встраиванием в геном растений бактериальных генов синтеза фитогормонов. Эти гены локализованы на плазмиде А. tumefaciens, получившей название Ti-плазмиды (Tumor inducing). Участок плазмиды, который непосредственно переносится и встраивается в хромосомы растений, стали называть Т-ДНК (Transfer-DNA). Несмотря на свое прокариотическое происхождение, гены Т-ДНК имеют эукариотическое строение. Они содержат эукариотические регуляторные элементы - эукариотические промоторы и сайты полиаденилирования, а транскрипция этих генов осуществляется растительной РНК-полимеразой II (Willmitzer et al., 1981). Среди генов Т-ДНК, отвечающих за различные функции фитопатогенного процесса, выделяют 6 генов, участвующих в биосинтезе и регуляции растительных гормонов, ауксинов и цитокининов (транскрипты 5, 2, 1, 4, 6а и 6b) (Willmitzer et al., 1983; Akiyoshi et al., 1984; McGaw et al., 1988). Экспрессия этих бактериальных генов приводит к неорганизованному росту и размножению растительных клеток в месте заражения патогеном и образованию опухоли, называемой корончатым галлом. В связи с. этим гены биосинтеза фитогормонов агробактерий получили название онкогенов. Первоначальными методами исследований генов Т-ДНК Ті-плазмид А. tumefaciens были методы инсерционного мутагенеза. Нарушение функции генов ауксинового локуса приводило к снижению синтеза ауксинов в опухолях и появлению побегов ("shooty -мутанты), а нарушение цитокининового локуса вызывало уменьшение количества цитокининов и образование многочисленных корней ("rooty -мутанты) (Garfinkel et al., 1981; Ooms et al., 1981; Joos et al., 1983). В связи с этим ауксиновый локус стали называть локусом tms (от английского tumour morphology shooty), а локус, отвечающий за синтез цитокининов - tmr (tumour morphology rooty).
По этой номенклатуре основные гены биосинтеза ауксинов обозначаются как tmsl и tms2, а ген, отвечающий за синтез цитокининов - как ген tmr. Ген tmr (или ген 4 по номеру транскрипта) кодирует фермент изопентенилтрансферазу, отвечающий за первый этап синтеза цитокининов и обозначается как ген ipt (Akiyoshi et al., 1984; Barry et al., 1984; Buchmann et al., 1985). Реакция включает присоединение изопентенильной боковой цепи к б -АМФ: 2-изопентенил-пирофосфат + б -АМФ = = изопентениладенозин-Б -монофосфат + пирофосфат. Данная стадия считается скоростьлимитирующей в процессе биосинтеза цитокининов, поскольку ИПА не накапливается в опухолевых тканях и трансгенных растениях, экспрессирующих ген ipt (Akiyoshi et al., 1984; Smart et al., 1991; Gaudin et al., 1994). Последующие этапы превращения ИПА в биологически активные цитокинины осуществляются ферментами, присутствующими у растений (Gaudin et al., 1994). Определение нуклеотидной последовательности гена ipt показало, что его кодирующая часть составляет 720 п.о. (Barker et al., 1983; Lichtenstein et al., 1984; Strabala et al., 1989). Гены ipt из различных штаммов A. tumefaciens обладают высокой степенью гомологии (Strabala et al., 1989; Drevet et al., 1994). Изопентенилтрансфераза агробактерий представляет собой белок, состоящий из 239-240 аминокислот (Lichtenstein et al., 1984; Strabala et al., 1989) и обладающий массой 27 кДа (Barry et al., 1984; Buchmann et al., 1985; Heinemeyer et al., 1987). Необходимым субстратом этого фермента является 5 -АМФ, но не близкие к нему по строению аденин или аденозин (Morris, 1986). Экспрессия гена ipt показана как в клетках A. tumefaciens и Е. coli, так и в растительных клетках. В различных линиях корончатых галлов обнаруживаются высокие концентрации свободных цитокининов, обычно это - транс-зеатин и зеатинрибозид (Akiyoshi et al., 1984; Ishikawa et al., 1988; McGaw et al., 1988; Song et al., 1995). Так, в стеблевых опухолях клещевины содержание зеатинрибозида увеличено в 10 раз, а транс-зеатина - в 8 раз (Veselov et al., 2003). Кроме того, в тканях корончатых галлов значительно увеличивается содержание связанных форм цитокининов, в частности нуклеотидов цитокининов и гликозидов цитокининов (Scott et al., 1982). Например, количество нуклеотидов цитокининов в стеблевых опухолях клещевины возрастает в 16 раз по сравнению с контролем (Veselov et al., 2003). Характер накопления различных цитокининов в опухолях отличается у разных видов растений, кроме того, обнаружена корреляция между морфологией опухоли и количеством в ней цитокининов (Ishikawa et al., 1988). Биосинтез ауксинов в корончатых галлах, вызываемых агробактериями, осуществляется при участии двух бактериальных генов. Ген tmsl (iaaM или транскрипт 1) кодирует фермент триптофанмонооксигеназу, отвечающую за превращение триптофана в индолил-3-ацетамид (ИАМ) (Thomashow et al., 1986; Van Onckelen et al., 1986). Второй фермент, индолилацетамидгидролаза, продукт гена tms2 (iaaH, транскрипт 2), гидролизует ИАМ до ИУК (Schroder et al., 1984; Thomashow et al., 1984): Триптофан - ИАМ - ИУК Таким образом, функция этого фермента заключается в превращении неактивного ауксина ИАМ в активную форму ауксинов - ИУК.
Субстратами для индолилацетамидгидролазы могут служить и другие индольные производные или аналоги ИАМ, между тем в отсутствие гена iaaM эффективного синтеза ИУК в опухолях не происходит (Kemper et al., 1985). В случае мутации в гене іааН в опухоли накапливается ИАМ (Rudelshteim et al., 1987). При трансформации декапитированных растений и листовых дисков табака штаммами агробактерий, несущими только ген iaaM или ген іааН, опухолеобразования не наблюдалось. При трансформации растений дикими штаммами агробактерий в опухолевых клетках пораженного растения количество ИУК увеличивалось в десятки раз, в частности в опухолях клещевины содержание ИУК возрастало в 13 раз (Veselov et al., 2003). Как и большинство генов Т-ДНК, гены iaaM и іааН различных штаммов агробактерий имеют высокую степень гомологии. Кодирующая последовательность гена iaaM состоит из 2270 п.о. (Klee et al., 1984). Бактериальные гены ipt и iaaM широко используют в генной инженерии растений для трансформации различных видов растений. В настоящее время сконструированы разнообразные векторы с этими генами как под собственными промоторами, так и под различными конститутивными и индуцибельными промоторами. Эти векторы оказались очень полезными в генной инженерии растений для получения растений с измененным гормональным балансом и открыли новые возможности для изучения гормональной регуляции растений. 1.4. Трансгенные растения с генами биосинтеза цитокининов и ауксинов агробактерий При исследовании роли цитокининов и ауксинов в регуляции роста и развития растений возможны три подхода. Первый подход включает в себя экзогенное применение гормонов к отдельным частям и целым растениям. Второй подход заключается в изучении эндогенного количества гормонов в растениях. И третий, ставший возможным лишь в последние годы - это создание различных мутантов и трансгенных растений с измененным гормональным балансом за счет экспрессии генов, участвующих в биосинтезе или разрушении этих фитогормонов. Преимуществами данного подхода по сравнению с исследованием экзогенного воздействия фитогормонов являются отсутствие неконтролируемого поглощения и разрушения гормонов, возможность изучения интактных растений, а также возможность избежать создания нефизиологических концентраций гормонов в месте их применения (Medford et al., 1989; Sitbon et al., 1991; Li et al., 1992; Gaudin et al., 1994). Такие растения могут служить удобной моделью для изучения различных аспектов действия фитогормонов на растения и их взаимодействия друг с другом. Исследования в данной области могут помочь в создании трансгенных растений с новыми полезными качествами и привести к снижению использования химикатов с гормональными свойствами в растениеводстве.
Гибридизация ДНК на фильтрах по Саузерну
Продукция цитокининов и ауксинов свойственна не только растениям, но и многим бактериям, являющимся симбионтами или паразитами растений (Morris, 1986; Картель и др., 1994). К таким микроорганизмам относятся почвенные патогенные бактерии Agrobacterium tumefaciens, вызывающие опухоли у целого ряда видов растений (Amasino a. Miller., 1982; Hoekema et al., 1983; Пирузян, 1985; Jin et al., 1987). Процесс опухолеобразования у растений, вызываемый агробактериями, обусловлен переносом и встраиванием в геном растений бактериальных генов синтеза фитогормонов. Эти гены локализованы на плазмиде А. tumefaciens, получившей название Ti-плазмиды (Tumor inducing). Участок плазмиды, который непосредственно переносится и встраивается в хромосомы растений, стали называть Т-ДНК (Transfer-DNA). Несмотря на свое прокариотическое происхождение, гены Т-ДНК имеют эукариотическое строение. Они содержат эукариотические регуляторные элементы - эукариотические промоторы и сайты полиаденилирования, а транскрипция этих генов осуществляется растительной РНК-полимеразой II (Willmitzer et al., 1981). Среди генов Т-ДНК, отвечающих за различные функции фитопатогенного процесса, выделяют 6 генов, участвующих в биосинтезе и регуляции растительных гормонов, ауксинов и цитокининов (транскрипты 5, 2, 1, 4, 6а и 6b) (Willmitzer et al., 1983; Akiyoshi et al., 1984; McGaw et al., 1988). Экспрессия этих бактериальных генов приводит к неорганизованному росту и размножению растительных клеток в месте заражения патогеном и образованию опухоли, называемой корончатым галлом. В связи с. этим гены биосинтеза фитогормонов агробактерий получили название онкогенов. Первоначальными методами исследований генов Т-ДНК Ті-плазмид А. tumefaciens были методы инсерционного мутагенеза. Нарушение функции генов ауксинового локуса приводило к снижению синтеза ауксинов в опухолях и появлению побегов ("shooty -мутанты), а нарушение цитокининового локуса вызывало уменьшение количества цитокининов и образование многочисленных корней ("rooty -мутанты) (Garfinkel et al., 1981; Ooms et al., 1981; Joos et al., 1983). В связи с этим ауксиновый локус стали называть локусом tms (от английского tumour morphology shooty), а локус, отвечающий за синтез цитокининов - tmr (tumour morphology rooty). По этой номенклатуре основные гены биосинтеза ауксинов обозначаются как tmsl и tms2, а ген, отвечающий за синтез цитокининов - как ген tmr. Ген tmr (или ген 4 по номеру транскрипта) кодирует фермент изопентенилтрансферазу, отвечающий за первый этап синтеза цитокининов и обозначается как ген ipt (Akiyoshi et al., 1984; Barry et al., 1984; Buchmann et al., 1985).
Реакция включает присоединение изопентенильной боковой цепи к б -АМФ: 2-изопентенил-пирофосфат + б -АМФ = = изопентениладенозин-Б -монофосфат + пирофосфат. Данная стадия считается скоростьлимитирующей в процессе биосинтеза цитокининов, поскольку ИПА не накапливается в опухолевых тканях и трансгенных растениях, экспрессирующих ген ipt (Akiyoshi et al., 1984; Smart et al., 1991; Gaudin et al., 1994). Последующие этапы превращения ИПА в биологически активные цитокинины осуществляются ферментами, присутствующими у растений (Gaudin et al., 1994). Определение нуклеотидной последовательности гена ipt показало, что его кодирующая часть составляет 720 п.о. (Barker et al., 1983; Lichtenstein et al., 1984; Strabala et al., 1989). Гены ipt из различных штаммов A. tumefaciens обладают высокой степенью гомологии (Strabala et al., 1989; Drevet et al., 1994). Изопентенилтрансфераза агробактерий представляет собой белок, состоящий из 239-240 аминокислот (Lichtenstein et al., 1984; Strabala et al., 1989) и обладающий массой 27 кДа (Barry et al., 1984; Buchmann et al., 1985; Heinemeyer et al., 1987). Необходимым субстратом этого фермента является 5 -АМФ, но не близкие к нему по строению аденин или аденозин (Morris, 1986). Экспрессия гена ipt показана как в клетках A. tumefaciens и Е. coli, так и в растительных клетках. В различных линиях корончатых галлов обнаруживаются высокие концентрации свободных цитокининов, обычно это - транс-зеатин и зеатинрибозид (Akiyoshi et al., 1984; Ishikawa et al., 1988; McGaw et al., 1988; Song et al., 1995). Так, в стеблевых опухолях клещевины содержание зеатинрибозида увеличено в 10 раз, а транс-зеатина - в 8 раз (Veselov et al., 2003). Кроме того, в тканях корончатых галлов значительно увеличивается содержание связанных форм цитокининов, в частности нуклеотидов цитокининов и гликозидов цитокининов (Scott et al., 1982). Например, количество нуклеотидов цитокининов в стеблевых опухолях клещевины возрастает в 16 раз по сравнению с контролем (Veselov et al., 2003). Характер накопления различных цитокининов в опухолях отличается у разных видов растений, кроме того, обнаружена корреляция между морфологией опухоли и количеством в ней цитокининов (Ishikawa et al., 1988). Биосинтез ауксинов в корончатых галлах, вызываемых агробактериями, осуществляется при участии двух бактериальных генов. Ген tmsl (iaaM или транскрипт 1) кодирует фермент триптофанмонооксигеназу, отвечающую за превращение триптофана в индолил-3-ацетамид (ИАМ) (Thomashow et al., 1986; Van Onckelen et al., 1986). Второй фермент, индолилацетамидгидролаза, продукт гена tms2 (iaaH, транскрипт 2), гидролизует ИАМ до ИУК (Schroder et al., 1984; Thomashow et al., 1984): Триптофан - ИАМ - ИУК Таким образом, функция этого фермента заключается в превращении неактивного ауксина ИАМ в активную форму ауксинов - ИУК. Субстратами для индолилацетамидгидролазы могут служить и другие индольные производные или аналоги ИАМ, между тем в отсутствие гена iaaM эффективного синтеза ИУК в опухолях не происходит (Kemper et al., 1985). В случае мутации в гене іааН в опухоли накапливается ИАМ (Rudelshteim et al., 1987). При трансформации декапитированных растений и листовых дисков табака штаммами агробактерий, несущими только ген iaaM или ген іааН, опухолеобразования не наблюдалось. При трансформации растений дикими штаммами агробактерий в опухолевых клетках пораженного растения количество ИУК увеличивалось в десятки раз, в частности в опухолях клещевины содержание ИУК возрастало в 13 раз (Veselov et al., 2003). Как и большинство генов Т-ДНК, гены iaaM и іааН различных штаммов агробактерий имеют высокую степень гомологии. Кодирующая последовательность гена iaaM состоит из 2270 п.о. (Klee et al., 1984). Бактериальные гены ipt и iaaM широко используют в генной инженерии растений для трансформации различных видов растений.
В настоящее время сконструированы разнообразные векторы с этими генами как под собственными промоторами, так и под различными конститутивными и индуцибельными промоторами. Эти векторы оказались очень полезными в генной инженерии растений для получения растений с измененным гормональным балансом и открыли новые возможности для изучения гормональной регуляции растений. 1.4. Трансгенные растения с генами биосинтеза цитокининов и ауксинов агробактерий При исследовании роли цитокининов и ауксинов в регуляции роста и развития растений возможны три подхода. Первый подход включает в себя экзогенное применение гормонов к отдельным частям и целым растениям. Второй подход заключается в изучении эндогенного количества гормонов в растениях. И третий, ставший возможным лишь в последние годы - это создание различных мутантов и трансгенных растений с измененным гормональным балансом за счет экспрессии генов, участвующих в биосинтезе или разрушении этих фитогормонов. Преимуществами данного подхода по сравнению с исследованием экзогенного воздействия фитогормонов являются отсутствие неконтролируемого поглощения и разрушения гормонов, возможность изучения интактных растений, а также возможность избежать создания нефизиологических концентраций гормонов в месте их применения (Medford et al., 1989; Sitbon et al., 1991; Li et al., 1992; Gaudin et al., 1994). Такие растения могут служить удобной моделью для изучения различных аспектов действия фитогормонов на растения и их взаимодействия друг с другом. Исследования в данной области могут помочь в создании трансгенных растений с новыми полезными качествами и привести к снижению использования химикатов с гормональными свойствами в растениеводстве.
Получение и анализ трансгенных растений с геном iaaM
Агробактериальный ген триптофанмонооксигеназы iaaM, отвечающий за первый этап биосинтеза ИУК, был клонирован в бинарный растительный вектор pSS под контроль сильного двойного промотора 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35SS). Схема клонирования гена представлена на рис. 25. ДНК гена iaaM получили с использованием метода ПЦР. Источником гена iaaM послужила плазмида pDQ14, содержащая его последовательность размером 2270 п.о. из октопиновой Ti-плазмиды pTiA6NC (Klee et al., 1984). Для удобства клонирования гена в бинарный растительный вектор, на оба конца гена был введен рестрикционный сайт Cfr91, входящий в состав олигонуклеотидных праймеров: 1. 5 - CGCCCGGGCTAATTTCTAGTGCGGTAGTT 2. 5 - CGCCCGGGATGTCACCTTCACCTCT. ПЦР-продукт гена iaaM обрабатывали ферментом Cfr9l и сшивали с помощью ДНК-лигазы фага Т4 с плазмидой pBluescriptIIKS+, гидролизованной по тому же сайту рестрикции. Плазмидную ДНК отобранных клонов клеток Е. coli TG2 с геном iaaM гидролизовали эндонуклеазой рестрикции Cfr9l для вырезания гена iaaM и полученный фрагмент ДНК встраивали в бинарный вектор pSS (Voss et al., 1995), также гидролизованный по сайту рестрикции Cfr9\. Растительный вектор pSS содержит сильный двойной промотор 35S РНК вируса мозаики цветной капусты (CaMV 35SS), последовательность поли А и полилинкер с уникальными сайтами рестрикции для встраивания нужного гена. Для отбора рекомбинантных клонов из полученных клонов выделяли плазмидную ДНК и расщепляли ее рестриктазой Smal. В случае встраивания в плазмиду гена iaaM, при данном гидролизе вырезался фрагмент размером 2200 п.о. Ориентацию гена по отношению к промотору устанавливали, анализируя набор фрагментов, образовавшихся после гидролиза рекомбинантных ДНК по внутреннему сайту рестрикции ВатШ. В случае смысловой ориентации встроенного гена размер рестрикционных фрагментов составлял 10000 п.о., 470 п.о. и 300 п.о. При встраивании гена в обратной ориентации вырезались фрагменты ДНК 8700 п.о., 1800 п.о. и 300 п.о. (рис. 26). В результате были получены плазмиды, содержащие ген іааМ в обеих ориентациях по отношению к промотору CaMV 35SS.
Эти плазмидные конструкции, а также плазмиду pSS без вставки, переносили в штамм Agrobacterium tumefaciens GV3101 (pMP90RK) (Koncz a. Shell, 1986) методом прямой трансформации (An et al., 1988). Анализ ДНК полученных клонов, гидролизованной эндонуклеазой Smal, проводили с помощью гибридизации по Саузерну с меченным 32Р ПЦР-продуктом гена iaaM (Sambrook et al., 1989) (рис. 27). Таким образом были отобраны рекомбинантные штаммы агробактерий, содержащие ген іааМ в смысловой и антисмысловой ориентациях по отношению к двойному промотору 35S РНК вируса мозаики цветной капусты CaMV 35SS. Перенос генетических конструкций с геном іааМ в клетки растений табака осуществляли по стандартной методике агробактериальной трансформации листовых дисков. Параллельно проводили перенос в растения "пустого" вектора pSS. После трансформации плазмидой pSS и плазмидной конструкцией с геном іааМ в антисмысловой ориентации трансгенные побеги отделяли через один месяц. Регенерация трансгенных побегов астенического фенотипа после трансформации вектором с геном іааМ в смысловой ориентации происходила только спустя два месяца. Такое ингибирование процессов образования побегов и стимулирование процессов растяжения в клетках растений может указывать на увеличение в них уровня ауксинов. Полученные побеги укореняли и пассировали на безгормональной селективной среде. В результате трансформации и последующей селекции на среде с сульфатом канамицина было отобрано 12 и 17 линий растений-регенерантов, трансформированных, соответственно, растительными векторами с геном іааМ в смысловой и антисмысловой ориентациях по отношению к промотору CaMV 35SS. Трансгенные растения со смысловой копией гена іааМ (іааМ-растения) приобрели аномальный фенотип (рис. 28). Они характеризовались скручиванием листьев, повышенным корнеобразованием и появлением адвентивных корней на стеблях. У взрослых іааМ-растений корни появлялись и на абаксиальной стороне листьев вдоль центральной листовой жилки. Трансформанты с геном іааМ в антисмысловой ориентации имели фенотип, аналогичный контрольному. Нормальный фенотип растений с антисмысловыми копиями агробактериальных генов фитогормонов ipt и іааМ подтвердил наше предположение об отсутствии антисмыслового ингибирования этими генами эндогенных генов в связи с отсутствием гомологии с аналогичными генами растений. Растения, полученные после трансформации плазмидой pSS и экспрессирующие только ген прШ, также фенотипически соответствовали контрольному фенотипу.
Эти растения в дальнейшем служили в качестве контрольных в различных физиолого-биохимических анализах. 3.2.3. Молекулярно-генетический анализ растений табака, трансформированных генетическими конструкциями с геном іааМ Доказательство трансгенной природы индивидуальных растений табака, трансформированных генетическими конструкциями с геном іааМ, и растущих Ш; селективных средах с сульфатом канамицина, проводили при помощи ПЦР. Для синтеза гена прШ использовали праймеры к внутренней области гена nptll (Godoy-Hernandes et al., 1998) и о встраивании в геном растения копии маркерного гена прШ судили по наличию ПЦР-продукта размером 600 п.о. (рис. 29а). Для подтверждения встраивания в геном растений целевого гена іааМ, ПЦР анализ растительной ДНК проводили с использованием праймеров к концевым участкам соответствующих генов. Амплификация фрагментов ДНК, соответствующих по размерам гену триптофанмонооксигеназы (2270 п.о.), подтвердила встраивание его в геном трансгенных растений (рис. 296). Экспрессия агробактериального гена биосинтеза ауксинов в полученных трансгенных растениях табака была показана с помощью РНК-ДНК гибридизации. Результаты гибридизации указывали на синтез соответствующих РНК гена іааМ во всех линиях трансгенных растений (рис. 30). В контрольных растениях аналогичные сигналы отсутствовали. По результатам анализов было отобрано по пять линий трансгенных растений табака с геном іааМ в обеих ориентациях, обладающих наилучшими ростовыми характеристиками. Все полученные линии іааМ-растений при росте in vitro не различались между собой и характеризовались одинаково аномальным фенотипом (рис. 28). Характер морфологических изменений іааМ-растений может указывать на возрастание в них уровня ауксинов, что подтвердилось в наших экспериментах по спонтанному образованию корней на листовых эксплантах іааМ-растений. На среде МС без гормонов iaaM-экспланты формировали многочисленные хорошо разветвленные корни (рис. 316), тогда как на контрольных эксплантах к этому времени наблюдалось образование лишь единичных корней (рис. 31а). Таким образом, экспрессия одного из двух агробактериальных генов биосинтеза ауксинов (iaaM), контролируемого мощным промотором CaMV 35SS, вызвала возрастание активных ауксинов в трансгенных растениях табака. Растения всех независимых линий были высажены в почву для изучения влияния экспрессии гена іааМ на дальнейшее развитие и репродуктивную способность іааМ-растений.
Изучение фотосинтетических параметров в трансгенных растениях с генами ipt и iaaM.
Особое место в изучении механизма действия цитокининов отводится проблеме их активности в хлоропластах. Участие цитокининов в регуляции биогенеза хлоропластов является одним из наиболее ярких проявлений их биологической активности. Действие ауксинов на регуляцию процесса фотосинтеза носит, по-видимому, более опосредованный характер. Основные данные в этой области получены, в основном, при участии экзогенных гормонов. Исследований на трансгенных растений с эндогенным синтезом этих гормонов в настоящее время достаточно мало. С целью изучения влияния повышенного содержания эндогенных цитокининов и ауксинов на фотосинтез трансгенных растений с генами ipt и iaaM, проведено сравнительное исследование различных параметров роста и развития растений табака, выращенных in vitro и in vivo. Полученные результаты представлены в табл. 10 и 11. Показана небольшая обводненность листьев іааМ-растений, особенно выраженная при росте этих растений в условиях in vitro (табл. 10). Усиление ауксинами обводненности тканей может быть связано с их участием в регуляции растяжения растительных клеток. Приведенные нами результаты свидетельствуют о различном влиянии ауксинов на обводненность листьев трансгенных растений в зависимости от условий их роста и питания. Интересно, что относительный вес листьев ipt-растений достоверно не изменялся по сравнению с контролем (табл. 10). Между тем в некоторых исследованиях трансгенных растений, экспрессирующих ген ipt, указывается на обводненность листьев растений, растущих в условиях in vivo (Smigocki, 1995) и in vitro (Макарова и др., 1997). Известно, что влияние цитокининов на растительные ткани в значительной мере зависит от возраста клеток и концентрации гормонов, поэтому полученные в наших исследованиях отличия, могут объясняться полученным уровнем и характером экспрессии встроенного гена биосинтеза цитокининов. Облиственность (удельная площадь листьев) обеих форм трансгенных растений была снижена по сравнению с контрольными растениями. Важно отметить, что действие гормонов зависело от условий роста и питания трансгенных растений.
Зависимость характера влияния гормонов от условий выращивания растений наиболее ярко проявилась при анализе углеводов (табл. 11). В условиях in vitro обнаружено значительное накопление углеводов в листьях трансгенных растений по сравнению с контролем, особенно в листьях ipt-растений - более чем в два раза. Это может быть связано с атграгирующим действием увеличенного уровня эндогенных гормонов в листьях этих растений. В условиях закрытого грунта содержание углеводов существенно снижается только в листьях трансгенных растений с геном iaaM. Известно, что цитокинины активируют биосинтез хлорофиллов в хлоропластах и поэтому оказывают положительное влияние на процесс фотосинтеза, но при высоких концентрациях эти гормоны могут оказывать угнетающее действие. По нашим данным общее содержание хлорофиллов в листьях ipt-растений и іааМ-растений снижалось сильнее в условиях in vitro, чем при росте в закрытом грунте (табл. 11). По данным различных авторов в трансгенных растениях и тканях с геном ipt наблюдается как увеличение хлорофиллов (Li et al, 1992; Bultynck, 1997), так и заметное снижение хлорофиллов в листьях, приводящее к пожелтению растений (Ainley et al., 1993; Smigocki, 1995; Thomas et al., 1995). При этом характер действия цитокининов на соотношение хлорофиллов а/Ь мало изучен. Сообщается, что в трансгенных растениях табака с геном ipt соотношение хлорофиллов изменялось в зависимости от условий выращивания и не зависело от возраста растений (Synkova а. Valcke, 2001). Нами впервые показано, что в листьях ipt-растений наблюдается изменение соотношения хлорофиллов а/Ь при всех условиях выращивания (табл. 11). Снижение соотношения хлорофиллов а/Ь в этих растениях происходит главным образом за счет уменьшения содержания хлорофилла а, основного компонента светособирающего комплекса фотосистемы II (ФСИ). Это может рассматриваться как свидетельство относительно меньшего числа реакционных центров в расчете на единицу хлорофилла в ipt-растениях (Chow a. Anderson, 1987). Другими важными для фотосинтеза пигментами являются каротиноиды. Они играют роль дополнительных рецепторов света, и, кроме того, защищают хлорофилл от окисления (Эдварде и Уокер, 1986; Мерзляк, 1998). Нами обнаружено снижение количества этих пигментов при росте in vitro и in vivo в наших трансгенных растениях с повышенным синтезом цитокининов либо ауксинов (табл. 11). Известно, что соотношение фотосинтетических пигментов - хлорофиллов и каротиноидов является достаточно стабильным показателем. Количество каротиноидов во взрослых и старых листьях многих растений составляет 12-14% от содержания хлорофиллов. В ряде случаев, хотя и не всегда, изменение цвета стареющих листьев связано .с преобладанием процессов разрушения хлорофиллов над каротиноидами, что приводит к пожелтению листьев (Мерзляк и др., 1997; Merzlyak et al., 1999; Matil, 2000). Нами обнаружено возрастание соотношения хлорофиллы/каротиноиды в листьях всех форм]исследуемых растений в условиях in vivo, достоверных различий между контрольными и трансгенными растениями не обнаружено (табл. 11).
Влияние гормонального дисбаланса в трансгенных растениях на фотосинтетическую активность растений оценивали по скорости фотосинтеза и темнового дыхания целых растений, выращенных в закрытом грунте. Измерения СС»2-газообмена, проводимые на целых растениях, позволяют учесть фотосинтетические характеристики листьев всех ярусов и фенотипические изменения растений. Как правило, существует прямая зависимость между площадью листьев и фотосинтезом целого растения. В іааМ-растениях это соответствие сохранялось - снижение площади листьев и фотосинтеза растений составляло 39% по отношению к контролю (рис. 37). В то же время у ipt-растений площадь листьев уменьшилась на 84%, а фотосинтетическая активность упала только на 69%. Важно, что в ipt-растениях наблюдалось сниженное старение листьев нижних ярусов, тогда как в контрольных и іааМ-растениях появлялось больше желтых листьев на нижних ярусах. Как известно, характерным свойством цитокининов является их способность задерживать старение листьев травянистых растений. Поэтому в листьях нижнего яруса ipt-растений в меньшей степени происходило разрушение хлорофиллов, в результате чего они сохраняли существенную фотосинтетическую активность. Скорость С02-газообмена в темноте в трансгенных растениях значительно увеличилась и составила 50% от значения фотосинтеза в іааМ-растениях и 36.4% в ipt-растениях, тогда как в контрольных растениях скорость темнового дыхания была 23.2%. Увеличение темнового дыхания в іааМ-растениях может быть связано с появлением придаточных корней на стеблях. В ipt-растениях проявляется ингибирующее действие высоких концентраций цитокининов, приводящее к снижению фотосинтетической активности этих растений. Одним из наиболее важных свойств молекул хлорофилла является их способность флуоресцировать. Методы, в основе которых лежит явление индукции флуоресценции хлорофилла, позволяют получить наиболее полную информацию о структурно-функциональных характеристиках фотосинтетического аппарата (Корнеев, 2002). Снижение уровня интенсивности флуоресценции хлорофилла (F), входящего в состав реакционных центров ФСІІ, происходит за счет фотохимического и нефотохимического тушения флуоресценции. Соотношение Fv/Fm отражает величину квантового выхода для всех комплексов ФСН исследуемого объекта. Уменьшение соотношения Fv/Fm обычно отождествляется с повреждением комплексов ФСН в результате стресса. Избыточный свет, энергия которого не может быть безопасно реализована в фотосинтетических реакциях, считается одним из основных факторов инактивации комплексов ФСИ. Снижение активности фотосинтетических процессов под воздействием избыточного освещения называется фотоингибированием. Это снижение может быть обратимым и необратимым, вызванным инактивацией комплексов ФСП.
