Введение к работе
. Актуальность тешы. Бобово-рнзобиальный симбиоз уже давно привлекает внимание специалистов, работают в самых различных областях биологии.
Интерес К ЭТОЙ бИОЛОГИЧеСКОЙ СИСтеме ОСОбеННО реЗКО вОЗрОС В ПОСЛеДНИе ГОЛЫ;
когда появилась возможность проводить генетический и молекулярно-биологический анализ наследственных факторов, детерминирующих признаки клубеньковых бактерий, необходимые для вступления в симбиоз. Так, за последние 15 лет у клубеньковых бактерий были выявлены и подробно изучены гены, контролирующие все качественные симбиотические признаки - вирулентность, азотфиксирующую активность и хозяйскую специфичность.
Долгое время единственным способом повышения интенсивности симбиотической азотфиксации был подбор природных активных штаммов клубеньковых бактерий, на основе которых готовили препарат нитрагин, используемый для предпосевной обработки семян бобовых. На сегодняшний день, благодаря бурному развитию методов молекулярной генетики и генной инженерии, появилась реальная возможность направленно конструировать высоко эффективные штаммы клубеньковых бактерий. Однако производственные штаммы, обладающие высокой нитрогеназной активностью и симбиотической эффективностью, в полевых условиях часто не способны конкурировать за образование клубеньков с находящимися в почве штаммами "дикого типа". Поэтому в настоящее время наибольший научный интерес и практическую значимость представляет выявление и изучение генетических детерминант, контролирующих количественные симбиотические призігаки клубеньковых бактерий - эффективность (способность увеличивать массу растении и накопление в них азота по сравнению с контролем без инокуляции) и нолуляционную конкурентоспособность (способность образовывать клубеньки на корнях растения-хозяина в присутствии других штаммов того же вида).
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в изучении генетических детерминант, вовлеченных в контроль симбиотической эффективности и нодуляционной конкурентоспособности клубеньковых бактерий люцерны (Sinnrhkobium tneliloii). Конкретными задачами данной работы являлись:
-
Картирование на метаплазм идах S. meliloti семи генов, мутации в которых приводят к повышению симбиотической эффективности и одного гена, мутация в котором приводит к снижению конкурентоспособности.
-
Клонирование в мультнкопийных векторах мутанткой и "дикой" копии гена стр-107, вовлеченного в контроль нодуляционной конкурентоспособности штамма СХМ1-105 S metitoti. Определение и анализ тгуклеотидиых последовательностей клонированных фрагментов ДНК.
-
Проведение сайт-на прав л енного мутагенеза гена стр-10' у родительского штамма СХМ1-І05 и анализа конкурентоспособности у полученного мутанта. Комплементаииоииый анализ гена стр-10? у мутанта ТІ07, обладающего сниженной конкурентоспособностью.
-
Анализ экспрессии гена стр~107 в чистой культурой ^\имбдо.іі і чес ких..уо, ловиях.
Научная повита работы. На мегаплазмндах S. mehtou картировано пять генов, мутации в которых приводят к повышению симбнотической эффективности штаммов, и один ген, мутация в котором приводит к снижению нодуляционной конкурентоспособности. Показано, что еше два генд, мутации в которых приводят к повышению симбнотической эффективности, локализованы на мегаплаз-миде-I за пределами nod-nif региона.
Впервые проведен молекул ярмо-биологический анализ гена, мутация в котором приводит к снижению нодуляционной конкурентоспособности штамма СХМ1-105 S. meliloti при симбиозе с Medicago saliva. Доказано, что функционирование гена стр-107 действительно влияет на способность штамма CXMI-105 конкурировать за образование клубеньков. Обнаружено, что стр-107 представляет собой самостоятельную транскрипционную единицу и кодирует заякоренный в клеточной мембране 45 кДа протеин, функция которого неизвестна. Показано, что стр-107 экс премируется у свободноживущих клеток S. meliloti, а также на самых ранних этапах становления симбиотических взаимоотношений, и не функционирует в азотфиксирующих бактероидах.
Практическая ценность. На генетические карты мегаплазмид клубеньковых бактерий люцерны нанесено шесть новых генов, принимающих участие в контроле важнейших симбиотических признаков - эффективности и нодуляционной конкурентоспособности. Построенные карты несут дополнительную информацию о структуре генома клубеньковых бактерий, а картированные мутации могут быть использованы в качестве "опорных точек" для дальнейшего построения генетических карт мегаплазмид S. meliloti.
Выявлен и проанализирован ген стр-107, вовлеченный в контроль нодуляционной конкурентоспособности штамма CXMI-105 5, meliloti. Проведение таких исследований способствует наиболее полному выявлению молекулярно-генетическнх основ ранних этапов симбиотического взаимодействия и создает предпосылки для направленного конструирования хозяйственно ценных штаммов клубеньковых бактерий.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на X (С.-Петербург, Россия, 1995) и X] (Париж, Франция, 1997) Международных конгрессах по азотфиксании, а также на Х[ Международном конгрессе по молекулярным растительно-микробным взаимодействиям (С.-Петербург, Россия, 2003). Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, описания материалов и методов, 2-Х гнав экспериментальной части, каждая из которых содержит результаты и обсуждение, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 169 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц и 54 рисунка. Список литературы включает 476 наименований, из них 38 - на русском языке.
