Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1 Эпидемиология туберкулеза 12
1.2 Этиология. Патогенез. Классификация основных форм туберкулеза. 15
1.3 Туберкулез как сложное многофакторное заболевание 21
1.4 Гены предрасположенности к туберкулезу легких 26
1.4; 1 Гены главного комплекса гистосовместимости (HLA). 27
1.4.2 Гены цитокинов (IFNy, IFNyR, IL12, IL12R, TNFa, ILL, ILlRa,IL10). 28
1.4.3 FQUNRAMPI (Natural-Resistance-Associated-Macrophage
Protein 1 gene). 36
1.4.4 Ген рецептора витамина D(VDR) 38
1.4.5 Ген индуцибельной синтазы окиси азота (NOS2) 40
1.4.6 Гены ферментов биотрансформации ксенобиотиков
(CYP1A1, CYP2E1, GSTM1). 41
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1: Материалы исследования 47
2.2 Методы исследования
2.2.1 Выделение геномной ДНК 48
2.2.2 Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК. 49
2.2.3 Рестрикционный анализ. 49
2.2.4 Метод электрофореза в полиакриламидном геле 50
2.2.5 Статистическая обработка полученных результатов 55
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1 Исследование полиморфизма генов цитокинов у больных туберкулезом легких и здоровых доноров из Республики Башкортостан 64
3.1.1 Анализ ассоциаций полиморфного локуса -308G>A гена фактора некроза опухолей (TNFA) с туберкулезом легких... 64
3.1.2 Анализ ассоциаций полиморфного локуса —5ПОТ гена интерлейкина 1 {3 (IL1B) с туберкулезом легких 75
3 Л.3 Анализ ассоциаций полиморфного локуса 3953С>Тгена интерлейкина 1 (3 (IL1B) с туберкулезом легких 81
3.1.4 Анализ ассоциаций сочетаний полиморфных локусов 511 ОТ и 39530Тгена IL1B с туберкулезом легких , 87
3.1.5 Анализ ассоциаций VNTR полиморфизма гена антагониста рецептора интерлейкина ip {IL1RA) с туберкулезом легких 92
3.1.6 Анализ комбинаций полиморфных локусов генов IL1B и IL1RA с туберкулезом легких 102
3.2 Исследование полиморфизма гена NRAMP1 у больных туберкулезом легких и здоровых доноров из Республики Башкортостан. 131
3.2.1 Анализ ассоциаций полиморфного локуса 1'729+55del4 гена NRAMP1 с туберкулезом легких 131
3.2.2 Анализ ассоциаций полиморфного локуса D543Nreua JSJRAMP1 с туберкулезом легких 139
3.2.3 Анализ ассоциаций сочетаний полиморфных локусов 1729+55del4 nD543NreHaNRAMPl с туберкулезом легких.. 146
3.3 Исследование полиморфизма гена рецептора витамина D (VDR) у больных туберкулезом легких и здоровых доноров из Республики Башкортостан — 151
3.3 Л Анализ ассоциаций Fokl полиморфизма гена VDR с туберкулезом легких 152
3.3.2 Анализ ассоциаций Taql полиморфизма гена VDRc туберкулезом легких. 159
3.3.3 Анализ ассоциаций сочетаний полиморфных локусов Foklu Taq\ гена VDR с туберкулезом легких. 165
3.4 Исследование полиморфных локусов генов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP2E1, GSTM1) у больных туберкулезом легких и здоровых доноров из Республики Башкортостан . 170
3.4.1 Анализ ассоциаций полиморфного локусаIle462Valгена CYP1A1 с туберкулезом легких 170
3.4.2 Анализ ассоциаций инсерционного полиморфизма (Ins96) гена CYP2E1 с туберкулезом легких 178
3^4.3 Анализ ассоциаций делеции гена GSTM1 с туберкулезом легких... 183
3.5 Исследование STR полиморфизма гена индуцибельной синтазы окиси азота (NOS2A) у больных туберкулезом легких и здоровых доноров из Республики Башкортостан 191
Заключение 208
Список литературы.
- Эпидемиология туберкулеза
- Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК.
- Исследование полиморфизма генов цитокинов у больных туберкулезом легких и здоровых доноров из Республики Башкортостан
- Анализ ассоциаций сочетаний полиморфных локусов 511 ОТ и 39530Тгена IL1B с туберкулезом легких
Введение к работе
Актуальность проблемы. Туберкулез - это инфекционное заболевание, характеризующееся сложной, полиморфной: клинической картиной и поражением различных органов и тканей. Данное заболевание представляет собой серьезную медико-социальную проблему, поскольку поражает лиц молодого, трудоспособного возраста, приводит к ранней инвалидизации, а также развитию угрожающих жизни осложнений. Ежегодно в мире регистрируется 8-9 миллионов новых случаев; заражения туберкулезом легких (ТЛ). По уровню основных эпидемиологических
( показателей Россия; входит в число 18 стран мира, которые составляют
80% от мирового уровня заболеваемости ТЛ [Чучалин А. Г., 1998]. В 2003
г. заболеваемость ТЛ в России составила 83,2 человека на 100 000
населения, а смертность - 21,8:100 000, что в 2,5 раза выше, чем в 1990 т.
Эпидемиологическая ситуация в Республике Башкортостан (РБ) в целом
отражает общероссийскую обстановку, хотя основные
эпидемиологические показатели ниже среднефедеративного уровня: заболеваемость в 2003 г. составляла 49,8:100 000, смертность - 13,1:100 000 населения. Рост заболеваемости, в первую очередь, вызван ухудшением
;,. социально-экономического уровня жизни значительной части населения,
качества медицинского обслуживания, а также миграцией населения, появлением лиц без определенного места жительства и большого количества амнистированных.
ТЛ — это многофакторное заболевание, которое развивается как результат сложного взаимодействия между Mycobacterium tuberculosis, организмом человека и внешне средовыми факторами. На сегодняшний день накоплен обширный фактический материал в области иммунологии заболевания, установлена главенствующая роль в сопротивляемости
^* инфекции Т-клеточного иммунитета [Orme I.M., 1987; Блум Б. Р. и соавт.,
2002]. С появлением лекарственно-устойчивого ТЛ интенсивно
: 7
исследуется геном МБ с целью выяснения причин устойчивости и
М разработки ДНК-вакцин [Степаншин Ю.Г. и соавт., 1999; Медников Б.Л.,
2005]. Имеются данные о влиянии факторов внешней среды на развитие ТЛ (неблагоприятные экологические и социальные условия, экзогенные и эндогенные интоксикации, наличие сопутствующих заболеваний и др.) [Stead W.W et al., 1990; Ryan F, 1993; Блум. Б. P. и соавт., 2002]. Многочисленные семейные и близнецовые исследования указывают на наличие генетической предрасположенности к ТЛ [Kallmann F.J. and Reisner D„ 1943; Comstock G.W., 1978; Чуканова.В. П. и соавт;, 1981; Хоменко А.Г. и соавт., 1990]. Однако молекулярно-генетические основы
( формирования заболевания пока изучены недостаточно и на сегодняшний
день исследования наследственных основ подверженности ТЛ направлены на поиск конкретных генов, формирующих структуру генетической предрасположенности к заболеванию. Одним из наиболее доступных подходов, применяемых в молекулярно-генетических исследованиях многофакторных заболеваний, является исследование ассоциаций заболевания с полиморфными вариантами генов-кандидатов, белковые продукты которых тем или иным образом могут участвовать в патогенезе болезни. Выявлена ассоциация ТЛ с генами главного комплекса гистосовместимости (HLА), генами цитокинов и их рецепторов (1FNG, IFNGR1, TNFA; 1Ы, 1LIRA, IL10, 1L12, 1L12R1), геном индуцибельной синтазы окиси азота (NOS2A), геном NRAMPJ, ответственным за
рецептора витамина Т> (VDR) и др. [Kallmann F.J.' and Reisner D., 1943;
Comstock G.W., 1978; Goodman A. H., and Motulsky, 1979; Хоменко А.Г. и
! соавт., 1990; Блум Б. Р. и соавт., 2002].
В рамках рассматриваемой проблемы идентификация генов, вовлеченных в- развитие ТЛ, является важной медико-генетической
(* задачей, решение которой будет способствовать формированию
фундаментальных представлении о патогенезе этого тяжелого, социально-
8 опасного заболевания, а также позволит выявить генетические факторы риска развития тяжелого течения ТЛ;
Поскольку в РБ молекулярно-генетического исследования ТЛ до сих пор не проводилось, актуальным являлось изучение полиморфных вариантов наиболее значимых генов-кандидатов, ассоциированных с данным заболеванием, у больных ТЛ и здоровых доноров.
В связи с вышесказанным были определены цели и задачи исследования.
Цель работы: анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов-кандидатов с туберкулезом легких в Республике Башкортостан
Задачи исследования:
Провести в группах больных туберкулезом легких и здоровых доноров, проживающих в Республике Башкортостан:
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов цитокинов TNFA {-308С>А\ IL1B (-5ПС>Т, 39530Г) и 1L1RA (VNTR).
Исследование I729+55del4 и D543N полиморфизмов.гена NRAMP1, ассоциированного с естественной резистентностью макрофагов.
Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов гена рецептора витамина D -VDR (Fokl, Taqi).
Исследование полиморфных локусов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1AI (Ile462Vaf), CYP2E1 (Jns%) и GSTM1, а также гена индуцибельной синтазы окиси азота NOS2A (STR),
Анализ ассоциаций исследованных полиморфных вариантов генов и
возможных их сочетаний с риском развития туберкулеза легких с учетом этнической принадлежности анализируемых групп и клинической формы заболевания.
9 Научная новизна исследования.
Впервые собрана коллекция ДНК больных ТЛ, проживающих в РБ. Проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов генов цитокинов, генов NRAMPl, VDR, NOS2A и генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков, с заболеванием. Впервые определена частота аллелей исследованных локусов у здоровых доноров русской, татарской и башкирской этнической принадлежности, проживающих на территории РБ. Установлены аллельные варианты генов TNFA, ILIB, JLIRA, NRAMPl, VDR, CYPlAiГи GSTM1, а также комбинации генотипов исследованных ДНК-локусов, детерминирующие повышенный и пониженный риск развития ТЛ.
Научно-практическая значимость работы.
Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к ТЛ. Впервые получены статистические оценки частот аллелей и генотипов исследуемых ДНК-локусов у больных ТЛ. Впервые выявлены генетические маркеры предрасположенности к тяжелому деструктивному и хроническому течению заболевания. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития ТЛ в РБ. Они также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
10 Положения, выносимые на защиту:
Ассоциация полиморфных вариантов генов цитокинов: фактора некроза опухолей a (TNFA), интерлейкина lp (ILIB) и его рецепторного антагониста (IL1RA) с развитием туберкулеза легких в РБ.
Ассоциация гетерозиготных генотипов по 11'29+5'5del4 KD543N полиморфизмам гена NRAMP1 (Natural-Resistance-Associated-Macrophage Protein 1 gene) с туберкулезом легких у лиц русской этнической принадлежности.
3: Генетические маркеры повышенного риска и устойчивости к развитию туберкулеза- легких по Fokl полиморфизму гена рецептора витамина D (VDR) у лиц русской этнической принадлежности.
Ассоциация туберкулеза легких с полиморфными вариантами генов биотрансформации ксенобиотиков (CYP1AI vlGSTMI).
Генотипы риска развития тяжелых деструктивных и хронических форм туберкулеза легких по полиморфным вариантам генов JLIB,IL1RA, VDR, CYPlAlu GSTM1.
Эпидемиология туберкулеза
В последние годы во многих странах, независимо от уровня их экономического развития, отмечается увеличение заболеваемости и распространенности ТЛ. Несмотря на блестящие достижения в терапии, ТЛ и сегодня остается серьезной проблемой для всего мирового сообщества. В современных публикациях это заболевание все чаще упоминается среди, так называемых, «возрождающихся» инфекций [Маянский А. Н., 2001; Блум Б. Р. и соавт., 2002]. Хорошо известно, что примерно треть населения планеты инфицирована микобактериями и подвержена опасности развития этого, заболевания. Ежегодно на земном шаре от ТЛ умирают около 3 миллионов человек, а в развивающихся странах каждый пятый случай смерти связан с ТЛ [Bellamy R., 2003; Selvaraj Р., 2004].
На сегодняшний день в России ТЛ:находится в зоне повышенного внимания. В 1998 г. Правительство РФ утвердило Федеральную целевую программу «Неотложные меры борьбы с туберкулезом в России на 1998-2004 гг.» (http://www.tuberculosis.ru). В 67 из 89 субъектов РФ органы исполнительной власти утвердили региональные целевые программы борьбы с ТЛ, В РБ - это программа «О неотложных мерах по совершенствованию организации противотуберкулезной помощи населению Республики Башкортостан». По данным Госкомстата России с 1976 до 1991 гг.,количество случаев заражения ТЛ уменьшалось в среднем на 2,5% в год, самый низкий уровень наблюдался в 1991 г. - 34 человека на 100 тыс. населения. Однако в последующие годы уровень заболеваемости и смертности от ТЛ начал медленно расти; в 1992 г. - 35,6 иЛ0,3 случаев на 100 тыс.; в 1995 г. - 57,8 и 15,4 случаев на 100 тыс. населения, соответственно (табл. 1). За период 1996-1997 гг. заболеваемость ТЛ в России выросла на 117,4%, достигнув 73,9 на 100 тыс. населения. Пик заболеваемости и смертности ТЛ - пришелся на 2 00 0 г., достигнув 9 0,7 и 20,4 случаев на 100 тыс. населения, соответственно.
Анализ динамики основных показателей дает основание предположить, что на эпидемиологическую ситуацию в России большое влияние оказали политические перемены,; приведшие к локальным конфликтам и росту миграции населения, появлению лиц без определенного места жительства, а также появлению больных: одновременно ТЛ и ВИЧ-инфекцией, алкоголизмом и/или наркоманией. Социально-экономические потрясения, имевшие место в 90-е годы, значительно усугубили и без того сложную эпидемиологическую ситуацию в России.
ТЛ - заболевание, которое, как индикатор, реагирует на социальное благополучие в обществе. В современном мире, с его глобальной взаимозависимостью, быстротой! перемещений, с развитой торговлей и меняющимися социально-культурными условиями, ТЛ в одной стране представляет угрозу для населения; любого другого государства. Естественно, добиться хороших результатов возможно только при международном сотрудничестве в области медицины и охраны здоровья населения.
ТЛ человека вызывают два вида микобактерий (МБ) - Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis. До 80% всех заражений связано с М; tuberculosis [Хоменко А. Г. и соавт., 1996; Маянский А. Н., 2001]. Риск заражения МБ бычьего типа происходит только при употреблении молока больных коров, однако ветеринарный контроль над животными в сочетании с пастеризацией молока практически исключает опасность заражения для человека.
Микобактерий ТЛ представляют собой тонкие, прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1-4 мкм и шириной около 0,3 мкм [Перельман М. И., 1990; Хоменко А. Г. и соавт., 1996]. Они неподвижны, не образуют спор и капсул, кислотоустойчивы, плохо окрашиваются по Граму, но, восприняв окраску, не обесцвечиваются этанолом. М. tuberculosis -строгие аэробы и мезофиллы, т.е. растут в диапазоне температур 30-42С (лучше всего - при 37С). Размножаются МБ очень медленно: период генерации составляет 14-16 часов.
В последние годы появление и широкое распространение полирезистентных к противотуберкулезным препаратам штаммов МБ способствовало интенсивному изучению генома М. tuberculosis [Перельман М. И. и соавт;, 2001]. В 1998 г. интернациональной группой ученых завершена расшифровка генома микобактерии ТЛ (более 4000 индивидуальных генов) [Cole S.T. et al;, 1998], Оказалось, что возбудитель ТЛ обладает рядом уникальных особенностей. В частности, было обнаружено достаточное число генов, способных воспроизводить белковые продукты, а также системы ферментов, ответственные за проникновение МБ внутрь клетки хозяина и его внутриклеточное существование. Например, МБ способны синтезировать ферменты ацил-СоА-синтазу и ацил-СоА-дегидрогеназу [Хоменко А.Г. и соавт., 1990; Перельман М. И. и соавт., 2001]. Кроме того, у МБ обнаружен гомолог гена NRAMP1 человека (предварительно названный Мгагар), ответственного за транспорт двухвалентных катионов металлов [Forbes J.L., and Gros Ph., 2001]. Исследования клинических изолятов МБ позволили обнаружить мутации генов, ответственных за формирование лекарственной устойчивости. Например, устойчивость к рифампицину, который блокирует синтез мРНК посредством связывания с РНК-полимеразой, в большинстве случаев, связана с мутациями в гене [3-субъединицы РНК-полимеразы (ген гроВ). При мутациях в кодонах 5 26 и 531 наблюдается высокий, а в кодонах 511, 516, 518, 522 - низкий уровень устойчивости к препарату.
Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК.
В работе использованы образцы ДНК больных туберкулезом легких, находящихся на стационарном лечении в противотуберкулезном диспансере г. Уфы, а также здоровых доноров, проживающих на территории РБ.
Выборку больных составили неродственные между собой пациенты в возрасте от 17 до 78 лет (40,65±2,22) с диагнозом туберкулез легких. Диагноз был поставлен на основании данных клинического обследования, анализа микроскопии мазков мокроты (бактериоскопия) и проведения флюорографического исследования. Численность выборки составила 195 человек. Соотношение количества женщин и мужчин среди больных ТЛ составило 1:2,61 (54 женщины : 141 мужчине). Состав данной выборки по этнической принадлежности был следующим: русские — 91, татары — 62, башкиры - 17. Кроме того, в группу больных были включены 25 человек, происходивших из межнациональных браков.
Согласно диагнозам больные распределились следующим образом: 61 человек с инфильтративным туберкулезом легких, 67 человек с инфильтративным туберкулезом легких в фазе распада и обсеменения, 38 человек с фиброзно-кавернозным туберкулезом, 15 человек с казеозной пневмонией, 2 человека с очаговым туберкулезом легких, 9 человек с туберкулемой, 1 человек с кавернозным туберкулезом и 2 человека с диссеминированным туберкулезом легких.
Контрольная группа была сформирована из здоровых неродственных жителей РБ, не состоящих на учете в тубдиспансере, соответствующих выборке больных по возрасту, полу и этнической принадлежности (русские - 60 человек, татары — 59 человек, башкиры - 35 человек). Численность группы составила 151 человек.
ДНК выделяли из периферической крови методом фенол ьно-хлороформной экстракции (Mathew С.С, 1984). Кровь набирали в пробирки, в качестве консерванта использовали глюгицир в соотношении 8:2 (кровь:глюгицир), тщательно перемешивали и хранили при температуре 4С не более одной недели. Для получения фракции клеточных ядер к 8 мл крови добавляли 40 мл лизирующего буфера (320 мМ сахароза; 5 мМ MgCb; 1% тритон Х-100; 10 мМ трис-HCl, рН=7,6) и центрифугировали 20 мин при температуре 4С и 4000 об ./мин. Надосадочную жидкость сливали, к осадку повторно приливали 20 мл лизирующего буфера и центрифугировали при тех же условиях в течение 10 мин. К полученному осадку добавляли 400 мкл буфера Soline ЭДТА (25 мМ ЭДТА, рН 8,0 и 75 мМ NaCl), 40 мкл 10% SDS, 30-40 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубировали при 37С в течение 16 часов. Из полученного лизата выделяли ДНК. Экстракцию ДНК проводили в три этапа: забуференным фенолом (200 мкл меркаптоэтанола на 50 мл фенола - Трис-HCI, рН 7,8), смесью фенол-хлороформа (1:1) и хлороформом (2 мл изоамилового спирта на 48 мл хлороформа) в равных объемах. Выделение ДНК проводили, смешивая лизат и растворитель до образования однородной эмульсии, разделение фаз осуществляли центрифугированием при 10000-12000 об/мин в течение 10 мин. ДНК осаждали двумя объемами 96% этанола. Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали на воздухе, затем растворяли в дистиллированной воде и хранили при -20С. Выход ДНК составлял около 50-100 мкг на 1 мл образца крови.
Амплификацию изученных локусов проводили с помощью метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК на амплификаторе "Терцик" производства компании «ДНК-технология» (г. Москва).
Для амплификации использовали реакционную смесь объёмом 25 мкл, которая содержала 2,5 мкл lOxTaq-буфера (67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4 2 S04,, 1,5мМ MgCl2, 0,01% Tween-20), 0,1 мкг геномной ДНК, смесь dNTP (dATP, dGTP, dCTP, dTTP no 200 мкМ каждого), 1 ед. ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Силекс», г. Москва) и 5-10 пМ локусспецифичных олигонуклеотидных праймеров. Перечень исследуемых локусов, последовательности праймеров, размеры амплифицируемых фрагментов представлены в табл. 2. Типирование TaqJ полиморфизма гена VDR проводили, используя праймеры, самостоятельно подобранные с помощью пакета программ DNAStar и секвенированные фирмой Syntol (Москва). Определение «нулевого» генотипа гена GSTM1 осуществляли методом мультиплексной ПЦР, где в качестве внутреннего контроля был представлен ген CYP1A1. Для проведения амплификации использовали программы амплификатора, запрограммированные на объем 25 мкл в режиме активного, быстрого ("fast") регулирования. Условия амплификации представлены в табл. 3. Размеры аллелей определяли путем одновременного электрофореза с ДНК фага X, гидролизированного рестриктазой PstI или плазмиды pUC19, рестрицированной Mspi или НраП. Для детекции пятинуклеотидных повторов (ССТТТ)„ гена NOS2 в качестве маркера также использовали образцы ДНК с аллелями известной длины.
Исследование полиморфизма генов цитокинов у больных туберкулезом легких и здоровых доноров из Республики Башкортостан
Принимая во внимание неоднородность населения Республики Башкортостан в этническом отношении, в исследуемые выборки были включены три наиболее распространенные популяции Башкортостана: русские, татары и башкиры. Исходя из этого, помимо сравнения распределения частот аллелей и генотипов между контрольной выборкой и выборкой больных ТЛ, нами проводилось сравнение полученных данных между различными этническими группами анализируемых выборок.
Распределение частот аллелей и генотипов -308G A полиморфизма гена TNFA в трех этнических группах контрольной выборки, а также частоты аллелей и генотипов данного полиморфного локуса в некоторых популяциях мира представлены в табл. 4. Анализ распределения частот генотипов промоторного -308G A полиморфизма гена TNFA показал преобладание генотипа TNFA G/ G в популяциях РБ, частота которого колебалась от 78,0% у русских до 81,0% у татар. Вторым по частоте встречаемости был гетерозиготный генотип TNFA G/ A, в то время как генотип TNFA А/ А был определен только в популяции татар (3,4%).
Анализ гетерогенности по частотам генотипов и аллелей -308G A полиморфизма гена TNFA не выявил статистически достоверных отличий между этническими группами РБ (р 0,05) (табл. 5 и 6). Сравнение полученных результатов с литературными данными обнаружило сходство в распределении частот аллелей и генотипов -308G A полиморфизма гена TNFA между популяциями Башкортостана и популяциями итальянцев [Poli F. et al,, 2002], африканцев (р 0,05) [Poli F. et al., 2002] и достоверное отличие популяции татар от англичан (%2=5,11; Р 0,05 и "=Ь,92\ Р 0,05, соответственно) [Reynard М.Р. et al., 2000] и японцев (% =37,21; Р 0,0001 и Х2=32,23; Р 0,0001, соответственно) [Higuchi Т. et al., 1998] (табл. 5 и 6). Частота генотипа TNFA G/ A у англичан (35,5%) превышает частоту данного генотипа у татар (15,5%) в 2 раза за счет более низкой встречаемости гомозигот TNFA G/ G (60,5% и 81,0%, соответственно). В японской популяции частота аллеля TNFA G (98,3%) - самая высокая среди всех представленных популяций мира (табл. 5,6).
Результаты анализа распределения частот аллелей и генотипов -308G A полиморфизма гена TNFA у здоровых доноров и у больных ТЛ представлены в табл. 7. При сравнении выборок больных ТЛ и контрольной группы в целом обнаружены статистически значимые различия по распределению частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -308G A гена TNFA (Х2=Ю,90; Р 0,001 и х2=12,49; Р 0,001, соответственно). Преобладающими в обеих группах были аллель TNFA G (79,5% и 89,1%, соответственно) и генотип TNFA G/ G (61,5% и 79,7%, соответственно). В группе больных ТЛ отмечено статистически достоверное увеличение частоты гетерозиготного генотипа TNFA G/ A, на долю которого приходилось 35,9% по сравнению с контрольной группой, где частота данного генотипа достигала лишь 18,8%. (X =10,64; Р 0,01). Для оценки риска развития заболевания использовалась таблица сопряженности 2x2 с вычислением статистик связи (с поправкой Йэйтса). Риск развития ТЛ у индивидов с генотипом TNFA G/ A был повышен более чем в 2 раза (Р 0,01; OR=2,41; 95%С1 1,39-4,19), тогда как у носителей генотипа TNFA G/ G риск формирования ТЛ оказался снижен (OR=0,41; 95%С1 0,24-0,69) (рис. 15). Анализ распределения частот аллелей показал, что в группе больных ТЛ частота аллеля TNFA А в 2 раза выше контрольной частоты (20,5% и 10,9%, соответственно) (Р 0,01; OR=2,12; 95%СТ 1,32-3,41) (рис.15). Полученные нами результаты согласуются с работой Scola L. и соавт., в которой обнаружено достоверное повышение частоты гетерозиготного генотипа TNFA G/ A (38,7%) у больных ТЛ из Сицилии по сравнению с контрольной выборкой (21%) [Scola L. et al., 2003]. Вместе с тем, анализ ассоциаций данного полиморфного локуса гена TNFA с развитием ТЛ, проведенный в Камбоджи, не выявил статистически значимых различий между больными ТЛ и здоровыми индивидами [Deldago J.C. et al., 2002].
При попарном сравнении частот аллелей и генотипов -308G A полиморфизма гена TNFA между выборками здоровых лиц различной этнической принадлежности и соответствующими им группами больных ТЛ статистически значимых отличий не выявлено (р 0,05) (табл. 7). Однако в группе больных татарской этнической принадлежности наблюдалось существенное повышение частоты генотипа TNFA G/ A (33,9%) и аллеля TNFA A (20,2%) по сравнению с татарами контрольной группы (15,5% и 11,2%, соответственно, Р 0,05; OR=2,79; 95%С1 1,1-7,4).
Сравнительный анализ распределения частот генотипов -308G A полиморфизма гена TNFA между больными ТЛ русской, татарской и башкирской этнической принадлежности достоверных отличий не обнаружил (Р 0,05) (табл. 1 приложения).
Поскольку исследуемая выборка больных ТЛ включала пациентов с различными диагнозами и количество больных в некоторых группах не превышало одного - двух человек, больные были объединены в три группы в зависимости от клинико-рентгенологических данных и патогенеза заболевания (в соответствии с Приказом №109 «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации» от 21.03.03г.). Первая группа - малые формы ТЛ (МТЛ) включала больных с диагнозами инфильтративный туберкулез легких (61 человек), очаговый туберкулез легких (2 человека) и туберкулема легких (9 человек). Общий объем выборки составил 72 человека. Вторая группа — деструктивные формы ТЛ (ДТЛ) включала пациентов с диагнозами инфильтративный туберкулез легких в фазе распада и обсеменения (69 человек) и казеозная пневмония (15 человек). Общий объем выборки составил 84 человека. И третья группа - хронические формы ТЛ (XTЛ) включала больных с фиброзно-кавернозным (38 человек) и кавернозным туберкулезом легких (1 человек), с общим количеством больных 39 человек.
Сравнение распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -308G A гена TNFA у больных различными формами ТЛ с группой здоровых доноров выявило достоверные отличия между всеми анализируемыми выборками (табл. 8 и рис. 16). Во всех группах больных преобладал генотип TNFA G/ G, частота которого у больных МТЛ составила 62,5%, у больных ДТЛ - 59,5% и у больных ХТЛ - 64,1%. Частоты генотипов TNFA G/ A в группах больных МТЛ, ДТЛ и ХТЛ были значительно выше частоты данного генотипа в контрольной выборке. Обнаружено статистически достоверное увеличение частоты гетерозиготного генотипа TNFA G/ A у больных МТЛ (34,7%) и ДТЛ (40,5%) по сравнению с контрольной группой, где частота данного генотипа достигала лишь 18,8%.
Анализ ассоциаций сочетаний полиморфных локусов 511 ОТ и 39530Тгена IL1B с туберкулезом легких
Нами проведен анализ сочетаний генотипов 511С Т и 3953С Т полиморфных ДНК-локусов с целью выявления возможного сцепления с ТЛ. Комбинации генотипов по полиморфизмам -511С Т и 3953С Т в контрольной группе и общей выборке больных ТЛ представлены в табл. 17. Наиболее часто встречающимся сочетанием генотипов по локусам -5НОТ и. 3953С Т гена IL1B у больных ТЛ было С/С-С/Т (27,22%), тогда как в контрольной выборке - С/Т-С/С (33,8%). Второй по частоте у больных ТЛ была комбинация С/Т-С/Т (24,4%), а в группе контроля - С/С-С/С (16,5%). Анализ распределения частот комбинаций; генотипов выявил значимые отличия между исследуемыми выборками (х2=35,22; Р 0,0001). Установлено достоверное повышение частоты комбинации С/С-С/Т в группе больных ТЛ (27,2%) по сравнению с контролем, где частота данной комбинации была почти в 2 раза ниже (14,3%). Относительный риск заболевания составил 2,24 (Р 0,01; 95%С1 1,2-4,2) (рис. 18). Напротив, комбинации генотипов С/Т-С/С и Т/Т-С/С чаще наблюдались у здоровых доноров (33,8% и 12%), чем в группе больных (15% и 2,8%, соответственно). Риск развития ТЛ у носителей данных комбинаций был существенно снижен (OR=0,35; 95%С1 0,19-0,62 и; OR=0,21; 95%GI 0,07-0,63).
В табл. 18 представлены результаты распределения частот комбинаций исследуемых ДНК-локусов при разделении анализируемых нами групп согласно их этнической принадлежности. Достоверных отличий по распределению частот комбинаций генотипов -5110Т - 3953С Т гена ILJB между больными различной этнической принадлежности и соответствующим им группам контроля не выявлено (Р 0,05) (табл. 18). Частоты комбинаций: генотипов у больных русской этнической принадлежности приблизительно сходны с частотами у русских контроля .В обеих группах одинаково часто встречалось сочетание генотипов С/Т-С/С (27,9% у больных и 28,2% в контроле). Аналогичная картина наблюдалась у татар, где данная комбинация определялась с частотой 31,6% и 32,7%, соответственно. В группе больных башкирской этнической принадлежности преобладали две комбинации С/С-С/Т и С/Т-СС, частота которых составляла 28,6%. Третьей по распространенности комбинацией у больных ТЛ башкирского происхождения была С/Т-С/Т (21,4%). В контрольной группе башкир существенно чаще встречалась комбинация генотипов С/Т-С/С (52,6%). Однако наблюдаемые различия в частоте комбинаций генотипов оказались недостоверны, вероятно, вследствие того, что исследуемые выборки башкир имели небольшие объемы (Р 0,05).
При сравнении распределения частот комбинаций полиморфных локусов -5]]С Ти 39530Т гена IL1B у больных различными формами туберкулеза легких с контрольной группой, а также попарном сравнении частот комбинаций между больными и здоровыми донорами достоверных отличий не обнаружено (Р 0,05) (табл. 19).
Сравнительный анализ частот комбинаций генотипов полиморфных локусов -511С Т и 3953С Т гена IL1B между больными различными формами ТЛ обнаружил достоверное отличие больных ДТЛ от больных ХТЛ (Х2=13,2; Р 0,05) и не выявил различий между больными МТЛ И; ДТЛ, а также МТЛ и ХТЛ (табл. 7 приложения). У больных ДТЛ наблюдалось статистически значимое увеличение частоты комбинации С/С-С/С (25,6%, Р 0,05) по сравнению; с больными ХТЛ (8,11%), в то же время в группе больных ХТЛ более чем в 2 раза была повышена частота комбинации С/ТС/С (48,6% и 20,5%, Р 0,05).
Таким образом, согласно полученным нами результатам можно заключить, что комбинация генотипов С/С-С/Т по локусам -511С Т и 3953С Т гена IL1B является маркером повышенного риска развития туберкулеза легких (OR=2,24; 95%С1 1,2-4,2). Напротив, комбинации генотипов С/Т-С/С и Т/Т-С/С можно рассматривать в качестве маркеров пониженного риска развития туберкулеза легких (OR=0,35; 95%С1 0,19-0,62 и OR=0,21; 95%С10,07-0,63).
При исследовании минисателлитного полиморфизма гена 1L1RA, локализованного во 2 интроне, из пяти.; ранее выявленных Tarlow J.K. с соавт. аллелей, в нашем исследовании были обнаружены три: IL1RA !, 1L1RA IIи 1L1RA I11и из шести возможных генотипов найдены только пять: IL1RA I/ I, IL1RA 1/ П, IL1RA 1I/ I1, IL1RA 1/ Шм 1ЫКА Ш/ Ш [Tarlow J.K.etal.,1993].
В табл. 20 представлено распределение частот аллелей и генотипов VNTR полиморфизма гена IL1RA в трех этнических группах контрольной выборки, а также частоты аллелей и генотипов данного полиморфного локуса в некоторых популяциях мира. Как видно из таблицы, наибольшее распространение как среди популяций Башкортостана, так и среди других популяций мира имеют аллели ILRA 1 и ILRA П, содержащие четыре и два 86-членных повтора, соответственно. Обзор литературных данных показал, что аллель /L&4 /встречается у 74% европейского населения, аллель ILRA II - у 21% населения, оставшиеся же аллели встречаются менее чем в 5% случаев.[Arend W.P., 2003]. Исследование частот аллелей в трех этнических группах РБ также продемонстрировало высокую частоту аллеля ILRA /, которая составляла у русских 66,7%, у татар - 79,8%, у башкир - 92,2%. Частота аллеля ILRA II в популяциях РБ достигала лишь 31,7%, 17,5% и 7,8%, соответственно. Частота ашіепяІЬКАЧІІ была еще ниже и составляла у русских - 1,7%, у татар - 2,6%, а у башкир этот аллель вообще не был определен. При сравнения с литературными данными было обнаружено, что аллель JLRA I встречался примерно с одинаковой частотой у русских (66,7%) и чехов (67,3%) [Hutyrova В., 2002], тогда; как у башкир (92,2%) частота данного аллеля приближалась к таковой у китайцев (93,1%) [Tseng L.-H.et al., 2001], а у татар (79,8%) немного превышала частоту у американцев европейского происхождения (74,0%) [Tseng L-H.et а]., 2001]; Анализ распределения частот генотипов VNTR полиморфизма гена IL1RA в этнических группах РБ выявил статистически достоверные отличия между русскими и татарами (% =8,35; Р 0,05), русскими и башкирами (% =14,91; Р 0,001) и не обнаружил между татарами и башкирами (р 0,05) (табл. 21). Сравнение частот наиболее распространенных генотипов lLlRA I/ lwILlRA f/ II показало, что их частота у русских составляла 43,3% и 46,7%, тогда как у татар достигала 66,7%) и 24,6%, а у башкир - 84,4% и 15,6%.
