Содержание к диссертации
Список сокращений и обозначений 7
ВВЕДЕНИЕ 10
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 19
1.1. Концепция факторов риска заболеваний 19
1.2. Липидный и липопротеидный состав крови, и риск развития сердечно-сосудистых заболеваний 29
1.2.1. Особенности липидного и липопротеидного состава крови как отражение процесса адаптации 29
1.2.2. Дислипопротеидемии и риск развития сердечно-сосудистых заболеваний 38
1.3. Генетические факторы риска сердечно-сосудистых заболеваний 49
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 71
2.1. Материалы исследования 71
2.2. Методы исследования 74
2.2.1. Методы определения концентраций липидов в сыворотке крови... 74
2.2.2. Электрофорез липопротеинов 75
2.2.3. Фенотипирование дислипопротеидемии 77
2.2.4. Определение титров регуляторных Р-белков 78
2.2.5. Выделение ДНК из венозной крови человека 79
2.2.6. Амплификация полиморфных ДНК-локусов 79
2.2.7. Электрофорез амплифицированных фрагментов ДНК 84
2.3. Статистическая обработка результатов исследования 84
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 86
3.1. Анализ параметров гомеостатической системы метаболизма и транспорта липидов в крови у городского населения 86
3.1.1. Анализ особенностей липидного спектра крови у городского населения 86
3.1.1.1. Характеристика липидного спектра крови у городского населения 86
3.1.1.2. Характеристика липидного спектра крови у сельского населения 99
3.1.1.3. Сравнительный анализ липидных спектров крови у городского и сельского населения 109
3.1.2. Анализ спектра липопротеинов крови у городского и сельского населения 118
3.1.3. Сравнительный анализ спектров фенотипов дислипопротеидемий у городского и сельского населения 123
3.1.4. Оценка состояния гомеостаза у городских жителей по титру регуляторных Р-белков 126
3.2. Исследование молекулярно-генетических основ предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям 128
3.2.1. Общая характеристика полиморфизма маркеров некоторых генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний в популяциях русских и татар 128
3.2.1.1. саЯ1-полиморфизм длин рестрикционных фрагментов в экзоне 29 гена аполипопротеина В 128
3.2.1.2. Полиморфизм микросателлита в экзоне 18 гена рецептора липопротеинов низкой плотности 132
3.2.1.3. Полиморфизм кодонов 112 (Cys—>Arg) и 158 (Arg-^Cys) гена аполипопротеина Е 134
3.2.1.4. Я/гаЛИ-полиморфизм длин рестрикционных фрагментов в интроне 8 гена липопротеинлипазы 140
3.2.1.5. Полиморфизм кодона 192 (Gin —>Arg) гена параоксоназы 1.. 144
3.2.1.6. Полиморфизм кодона 421 (Val —>lle) гена белка-переносчика эфиров холестерина 147
3.2.1.7. Полиморфизм кодона 174 (Thr—>Mei) гена ангиотензиногена 149
3.2.1.8. Mbol - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов в интроне 9 гена ренина 151
3.2.1.9. Инсерционно-делеционный полиморфизм в интроне 16
гена ангиотензин-превращающего фермента 154
3.2.1.10. Полиморфизм в области промотора (-1903G—+A) гена химазы 157
3.2.1.11. Полиморфизм 1166А/С гена рецептора ангиотензина II первого типа 159
3.2.1.12. Полиморфизм в области промотора (-344Т—+С) гена альдостеронсинтазы 162
3.2.1.13. Полиморфизм минисателлита в интроне 4 гена эндотелиальной синтазы оксида азота 165
3.2.2. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров некоторых генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний с ишемической болезнью сердца 167
3.2.2.1. Анализ ассоциаций "со/?1-полиморфного маркера гена аполипопротеина В с ишемической болезнью сердца 167
3.2.2.2. Анализ ассоциаций полиморфного маркера гена рецептора липопротеинов низкой плотности (микросателлита в экзоне 18) с ишемической болезнью сердца 169
3.2.2.3. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров Argl58Cys, Cysl 12Arg гена аполипопротеина Е с ишемической болезнью сердца 172
3.2.2А. Анализ ассоциаций ЯшсЛИ-полиморфного маркера гена липопротеинлипазы с ишемической болезнью сердца 180
3.2.2.5. Анализ ассоциаций полиморфного маркера Glnl92Arg гена параоксоназы 1 с ишемической болезнью сердца 185
3.2.2.6. Анализ ассоциаций полиморфного маркера Val421Ile гена белка-переносчика эфиров холестерина с ишемической болезнью сердца 188
3.2.2.7. Анализ ассоциаций полиморфного маркера Т174М гена ангиотензиногена с ишемической болезнью сердца 191
3.2.2.8. Анализ ассоциаций полиморфного маркера I/D гена ангиотензин-превращающего фермента с ишемической болезнью сердца 195
3.2.2.9. Анализ ассоциаций полиморфного маркера 1166А/С гена рецептора ангиотензина II первого типа с ишемической болезнью сердца 198
3.2.2.10. Анализ ассоциаций полиморфного маркера гена эндотелиальной синтазы оксида азота (минисателлита в интроне 4) с ишемической болезнью сердца 199
3.2.3. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров некоторых генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний с эссенциальной гипертензией 204
3.2.3.1. Анализ ассоциаций "со/?1-полиморфного маркера гена аполипопротеина В с эссенциальной гипертензией 204
3.2.3.2. Анализ ассоциаций полиморфного маркера гена рецептора липопротеинов низкой плотности (микросателлита в экзоне 18) с эссенциальной гипертензией 208
3.2.3.3. Анализ ассоциаций полиморфных маркеров Argl58Cys, Cysll2Arg гена аполипопротеина Е с эссенциальной гипертензией 214
3.2.3.4. Анализ ассоциаций #/тШ1-полиморфного маркера гена липопротеинлипазы с эссенциальной гипертензией 217
3.2.3.5. Анализ ассоциаций полиморфного маркера Glnl92Arg гена параоксоназы 1 с эссенциальной гипертензией 222
3.2.3.6. Анализ ассоциаций полиморфного маркера Va\42llle гена белка-переносчика эфиров холестерина с эссенциальной гипертензией 225
3.2.3.7. Анализ ассоциаций полиморфного маркера ТІ 74М гена ангиотензиногена с эссенциальной гипертензией 227
3.2.3.8. Анализ ассоциаций М>о1-полиморфного маркера гена ренина с эссенциальной гипертензией 231
3.2.3.9. Анализ ассоциаций полиморфного маркера I/D гена ангиотензин-превращающего фермента с эссенциальной гипертензией 234
3.2.3.10. Анализ ассоциаций полиморфного маркера -1903G/A гена химазы с эссенциальной гипертензией 242
3.2.3.11. Анализ ассоциаций полиморфного маркера 1166А/С гена рецептора ангиотензина II первого типа с эссенциальной гипертензией 248
3.2.3.12. Анализ ассоциаций полиморфного маркера -344Т/С гена альдостеронсинтазы с эссенциальной гипертензией 254
3.2.3.13. Анализ ассоциаций полиморфного маркера гена эндотелиальной синтазы оксида азота (минисателлита в интроне 4) с эссенциальной гипертензией 262
3.2.4. Анализ ассоциаций с ишемической болезнью сердца и эссенциальной гипертензией по сочетаниям генотипов полиморфных маркеров некоторых генов-кандидатов 267
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 271
ВЫВОДЫ 372
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 375
ПРИЛОЖЕНИЕ 440
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди населения индустриально развитых регионов мира на протяжении нескольких последних десятилетий наблюдается значительный рост заболеваемости и смертности в связи с патологией сердечно-сосудистой системы. Развитие общих представлений о природе наблюдаемого феномена происходит на основе синтеза известных концепций адаптации, гомеостаза, общей патологии, факторов риска муль-тифакториальных заболеваний, которые в целом представляют обширную теоретическую базу, позволяющую анализировать сопряженность роста заболеваемости и смертности населения с антропогенными модификациями окружающей среды. Рабочая гипотеза заключается в следующем. Патогенетические механизмы заболевания запускаются в связи с влиянием соответствующих средовых факторов риска при снижении адаптационных возможностей организма и при наличии наследственной предрасположенности.
Значительный рост промышленности и чрезмерная урбанизация способствовали изменению условий среды обитания человека и образа его жизни за период времени, сравнительно малый в масштабах эволюции вида. Среди факторов среды появилось множество таких, с которыми человечество прежде не контактировало, интенсивность ряда факторов среды возросла, распространенными особенностями образа жизни стали гиподинамия, несбалансированное питание, нервно-эмоциональное напряжение. В связи с сочетанным и пролонгированным воздействием множества разнообразных по природе факторов антропогенной урбанизированной среды создаются условия для трансформации реакций адаптации в патологические изменения, в болезнь. Вследствие широкого распространения факторов риска реализуется также наследственная предрасположенность к заболеваниям. "Платой за адаптацию", "вынужденной формой жизнедеятель пости в особых условиях существования" — так образно называют изменение здоровья населения. Однако, общие теоретические построения не подтверждены конкретными знаниями о том, в чем именно заключаются реакции адаптации к условиям антропогенной урбанизированной среды и каковы условия их трансформации в патогенетические, способствующие развитию сердечно-сосудистой патологии, в связи с какими особенностями генотипа возрастает риск заболевания. Получение таких знаний представляется сложной задачей. Поскольку невозможно создать адекватную экспериментальную модель рациональным подходом является оценка и сравнительный анализ параметров гомеостатических систем в выборках из населения, проживающего в разных условиях. Поиск генов предрасположенности основан на проведении анализа ассоциаций в исследованиях типа контроль - случай.
В плане изучения природы роста заболеваемости сердечнососудистой патологией у населения индустриально развитых регионов актуальной является оценка параметров липидного гомеостаза крови. Метаболизм и транспорт липидов в крови осуществляется в рамках сложной гомеостатической системы с элементами саморегуляции и соподчинения нейрогуморальной регуляции. Она является очень гибкой гомеостатической системой; ее параметры варьируют в широких пределах, т.е. наблюдается значительная норма реакции. Традиционно внимание к изучению липидного гомеостаза крови обусловлено в значительной мере тем, что с его нарушениями сопряжен атерогенез. Однако не принимается во внимание то, что именно на уровне липидного гомеостаза сыворотки крови реализуются в целом регуляторные, пластические, энергетические и неспецифические стороны адаптации. Изменение концентраций липидов и липо-протеинов (ЛП) в крови является показателем реактивности всего организма при воздействии средовых факторов разной природы. С целью оценки риска сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) проводятся меж дународные программы по скринингу концентраций липидов в крови [Константинов В.В. и др., 1993; Оганов Р.Г., 1990; Шестов Д.Е., 1983; А1-Mahroos F. et al., 2000; Bobak M. et al., 1999; Chadha S. et al., 1997; Namekata T. et al.; 1996; Iso H. et al., 2001; North K. et al., 2003; Pajak A. et al., 1997; Zoratti R., 2002]. В то же время работ, в которых изучается влияние техногенных факторов на липидный гомеостаз, немного, а работы, в которых сравниваются параметры липидного гомеостаза населения, проживающего в разных условиях, в частности, городского и сельского населения, единичны [Campos Н. et al., 1992, Celentano Е. et al., 1999; Chadha S. et al., 1997].
В процессе адаптации реакции отдельных гомеостатических систем и всего организма в целом формируется в связи с особенностями генотипа. Полиморфизм генов может лежать в основе формирования фенотипа с повышенной чувствительностью к факторам среды и, как следствие, с повышенным риском заболевания. Поэтому отдельная сторона проблемы заключается в распознавании особенностей генотипа, в связи с которыми формируется предрасположенность к ССЗ, т.е. по сути, в поиске генотипов "адаптивной уязвимости".
Современные знания о нормальной физиологии сердечно-сосудистой системы и представления об этиологии и патогенетических механизмах ССЗ позволяют отнести к потенциальным генам-кандидатам ССЗ несколько десятков генов. Это гены аполипопротеинов, гены ренин-ангиотензиновой системы, гены калликреин-кининового пути, гены ионных каналов, гены эндотелинов, гены молекул адгезии, гены метаболизма липидов и углеводов, гены факторов роста и гормонов, тромбоксанов и простагландинов, гены симпатической нервной системы и другие. Многие из этих генов локализованы и секвенированы. Собраны обширные базы данных о полиморфизме генов-кандидатов ССЗ, в популяциях разных народов мира проведен анализ ассоциаций полиморфных маркеров некото рых генов с риском ишемической болезни сердца (ИБС) и эссенциальной гипертензии (ЭГ). В то же время показано, что у населения разных клима-то-географических регионов, в популяциях разных народов мира "констелляции" полиморфных ДНК-локусов, предрасполагающих к патологии, могут иметь различную конфигурацию. Поэтому необходимо проводить молекулярно-генетические исследования многофакторных заболеваний в разных регионах мира и с учетом этнической принадлежности. В настоящее время сведения о полиморфизме генов-кандидатов в популяциях России весьма ограничены, ассоциативные исследования проведены по немногим полиморфным маркерам генов-кандидатов ССЗ в отдельных популяциях. Нами проводятся такого рода исследования в этнических группах в Республике Башкортостан. Принимая во внимание высокий уровень ССЗ и обусловленный ими уровень смертности, нельзя не признать важность этих исследований для населения нашей страны. В связи с изучением мо-лекулярно-генетических основ ССЗ будет связан дальнейший успех в раскрытии их природы, в понимании причин пандемии, и в разработке эффективных основ профилактики с учетом генетической конституции и особенностей образа жизни отдельного индивида.
В последние годы, как острое проявление ИБС, все чаще встречается инфаркт миокарда (ИМ) в молодом возрасте. Причем, в возрасте от 35 до 50 лет ИМ развивается в 50 раз чаще у мужчин, чем у женщин [Сыр-кинА.Л., 1998]. Именно вследствие преждевременной ИБС, отягощенной развитием ИМ в возрасте до 56 лет наблюдается прогрессивный рост смертности среди мужчин. Одним из принципиально важных факторов риска ИБС является ЭГ. Патогенез ЭГ до конца не понятен. Очевидно, что исследование природы этих ССЗ у мужского населения является актуальной самостоятельной задачей.
В связи со сказанным выше были определены цели и задачи исследования.
Цель настоящего исследования заключалась в следующем.
Провести анализ предрасположенности к сердечно-сосудистым заболеваниям у жителей крупного индустриального города: выявить особенности липидного гомеостаза крови у городских жителей (мужчин) в сравнении с сельскими, провести анализ полиморфизма генов-кандидатов сердечно-сосудистых заболеваний, обозначить полиморфные маркеры, ассоциированные с эссенциальной гипертензией и ишемической болезнью сердца с развитием инфаркта миокарда в возрасте до 56 лет у мужчин.
Для достижения цели были поставлены такие задачи:
1. В выборках из городского (г.Уфа) и сельского (сельские районы Республики Башкортостан) мужского населения:
1.1. провести скрининг концентраций липидов (ТГ, общего ХС и ХС в составе липопротеинов) в сыворотке крови;
1.2. изучить фракционный и субфракционный состав липопротеинов сыворотки крови;
1.3. оценить частоту и разнообразие фенотипов дислипопротеидемий.
2. Охарактеризовать особенности липидного гомеостаза у городских жителей по сравнению с сельскими жителями.
3. Провести:
3.1. типирование по полиморфным маркерам генов аполипопротеинов В и Е (АРОВ, АРОЕ), липопротеинлипазы (LPL), рецептора липопротеинов низкой плотности (LDLR), белка-переносчика эфиров холестерина (СЕТР), параоксоназы 1 (PON/), ренина (REN), ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ), ангиотензиногена (AGT), рецептора ангиотензина II первого типа (ATIR), химазы (СМА), альдостеронсин-тазы (CYP11В2), эндотелиальной синтазы оксида азота (eNOS) в популяциях русских и татар (г. Уфа);
3.2. сравнительный анализ популяций русских и татар с популяциями других народов мира по полиморфным маркерам перечисленных генов;
3.3. анализ ассоциаций полиморфных маркеров перечисленных генов с ишемической болезнью сердца с развитием инфаркта миокарда в возрасте до 56 лет у мужчин;
3.4. анализ ассоциаций полиморфных маркеров перечисленных генов с эссенциальной гипертензией у мужчин.
Научная новизна работы. Впервые проведено комплексное исследование метаболических и молекулярно-генетических основ предрасположенности к сердечно-сосудистой патологии у населения крупного индустриального города (г. Уфа, Республика Башкортостан).
Результаты исследования расширяют представления о влиянии среды крупного индустриального города на липидный гомеостаз и позволяют охарактеризовать одну из сторон такого сложного явления, как адаптация к условиям антропогенной урбанизированной среды.
В выборках из городского и сельского мужского населения определены статистические параметры вариационных рядов концентраций общего ХС и ХС во фракциях ЛП, ТГ и коэффициента атерогенности (КА). Показано, что у жителей (мужчин) крупного индустриального города (г. Уфа) по сравнению с сельскими жителями, проживающими в том же регионе (Республика Башкортостан), наблюдается в рамках нормолипидемии повышение концентраций ТГ, ХС ЛОНП и ХС ЛВП. Установлено, что у мужчин-горожан выше частота нарушений липидного гомеостаза в целом и частоты фенотипов дислипопротеидемий (ДЛП), характеризующихся низким содержанием ХС и ТГ в сыворотке крови.
На основании результатов исследования выдвинута гипотеза об адаптивной значимости увеличения содержания ТГ, ХС ЛВП у населения крупного индустриального города.
Полученные в результате данного исследования оценки параметров липидного гомеостаза (концентрации ТГ, общего ХС, ХС во фракциях ЛП, особенности фракционного и субфракционного состава ЛП сыворотки крови), частот и фенотипического разнообразия ДЛП у городского (г. Уфа) и сельского населения Республики Башкортостан являются новыми фактическими данными, дополняющими результаты исследований по скринингу концентраций липидов у населения России и других стран мира, они вносят вклад в сумму знаний по "биохимической" эпидемиологии мирового народонаселения.
В популяциях русских и татар (г. Уфа) получены статистические оценки частот генотипов и аллелей по полиморфным маркерам генов-кандидатов ССЗ: АРОВ, АРОЕ, LPL, LDLR, СЕТР, PON 1, REN, АСЕ, AGT, AT1R, СМА, CYP11B2, eNOS. Эти сведения служат существенным пополнением знаний о полиморфизме генов-кандидатов ССЗ в различных этнических группах и вносят вклад в "геногеографию" народов мира.
В результате анализа ассоциаций полиморфных маркеров генов-кандидатов с ЭГ и ИБС с развитием ИМ в возрасте до 56 лет обнаружены генотипы риска этих заболеваний у городских жителей, мужчин, русских и татар по этнической принадлежности.
Научно-практическая значимость работы. Результаты исследования могут быть использованы в различных областях науки: в биохимии, в генетике, медицине. В целом они имеют значение для развития общетеоретических представлений о механизмах адаптации к условиям среды крупного индустриального города и о формировании в связи с ними предпосылок к развитию ССЗ.
Полученные в данном исследовании результаты представляют собой новую информацию, которая имеет значение для разработки программ по профилактики ССЗ, общей заболеваемости и смертности. Важен тот факт, что среди жителей индустриального города, по сравнению с сельскими жителями прослеживается тенденция к понижению содержания ХС ЛНП в возрасте 20-29 лет и обнаружены фенотипы ДЛП, для которых характерно низкое содержание ХС и (или) ТГ, что необходимо учитывать при разработке мероприятий по профилактике ССЗ у горожан. Сведения об ассоциациях полиморфных маркеров генов-кандидатов с ЭГ и ИБС, осложненной ИМ в возрасте до 56 лет, можно рекомендовать для использования в системе медико-генетического консультирования с целью определения шансов развития этих заболеваний и их осложнений с учетом этнической принадлежности (русские, татары) и факторов риска (избыточная масса тела, курение, возрастные особенности, особенности профессиональной деятельности). Типирование по полиморфному маркеру гена eNOS может иметь значение для оценки риска ССЗ при профессиональном отборе на нефтеперерабатывающих заводах.
Материалы исследования могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах.
Реализация результатов исследования
Работа входит в программу научных исследований Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН. Материалы исследования использовались в учебном процессе в Башкирском государственном университете и в Башкирском государственном медицинском университете.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Статистические оценки концентраций общего ХС, ХС во фракциях ЛП, ТГ, характеризующие липидный гомеостаз крови мужского населения крупного индустриального города (г. Уфа) и мужского сельского населения (Республика Башкортостан).
2. Между мужским населением крупного индустриального города (г. Уфа) и мужским сельским населением (Республика Башкортостан) по концентрациям липидов, соотношению фракций и субфракций ЛП, частоте и фенотипическому разнообразию ДЛП существуют различия.
3. В связи с адаптацией к комплексу условий урбанизированной антропо- геной среды у мужчин-горожан изменяются параметры липидного го- меостаза: на протяжении длительного периода онтогенеза возрастают концентрации ХС ЛВП (20-39 лет), ТГ (20-49 лет), в возрасте 20-29 лет понижается, а в возрасте 50-59 лет повышается содержание ХС ЛНП; у значительной части городского населения развиваются ДЛП, что свидетельствует о дестабилизации гомеостатической системы метаболизма и транспорта липидов в крови.
4. Статистические оценки частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов АРОВ (соД1-ПДРФ в экзоне 29), АРОЕ (Argl58Cys, Cysll2Arg), LDLR (микросателлит в экзоне 18), LPL (//ш ////-ПДРФ в интроне 8), PON1 (Glnl92Arg), СЕТР (Val4211le), AGT {ТІ74М), АСЕ (I/D в интроне 16), СМА (-1903G/A), REN (МбоІ-ПДРФ в интроне 9), ATIR (I166A/Q, CYP11B2 {-344Т/С), гМЩминисателлит в интроне 4) в популяциях русских и татар (г. Уфа).
5. В популяции татар г. Уфы у мужчин с ИБС, осложненной ИМ в возрасте до 56 лет, ассоциированы полиморфные маркеры генов АРОЕ, LPL, LDLR, СЕТР, PON1, AT1R, с ЭГ — полиморфные маркеры генов АРОВ, СЕТР, PON1, AGT, REN, ATIR, CYP11B2, СМА, АСЕ.
6. В популяции русских г. Уфы у мужчин с ИБС, осложненной ИМ в возрасте до 56 лет, ассоциированы полиморфные маркеры генов АРОЕ, АРОВ, LPL, СЕТР, PON1, AGT, eNOS, АСЕ, с ЭГ — полиморфные маркеры генов АРОВ, LPL, LDLR, PON1, eNOS, AGT, REN, ATIR, CYP11B2, СМА, АСЕ.
