Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9-39
1.1. Молекулярные механизмы этиопатогенеза хронического гломерулонефрита 9-17
1.2. Генетические исследования хронического гломерулонефрита 17-24
1.3. Вазоактивные гормоны, их молекулярно-генетическая характеристика и медико-биологическое значение 25-39
Глава 2. Материалы и методы исследования 40-59
2.1. Характеристика обследованных групп 40-42
2.2. Молекулярно-генетические методы 42-56
2.3. Генетико-статистические методы 56-59
Глава 3. Полиморфизм генов вазоактивных гормонов и особенности формирования и прогрессирования хронического гломерулонефрита 60-108
3.1. Изучение ассоциаций полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов с развитием хронического гломерулонефрита 60-65
3.2. Исследование взаимосвязей генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов с качественными и количественными патогенетически значимыми для хронического гломерулонефрита признаками 66-92
3.3. Изучение взаимосвязей полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов со скоростью прогрессирования хронического гломерулонефрита 92-108
Обсуждение 109-124
Выводы 125
Список литературы 126-154
- Молекулярные механизмы этиопатогенеза хронического гломерулонефрита
- Молекулярно-генетические методы
- Исследование взаимосвязей генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов с качественными и количественными патогенетически значимыми для хронического гломерулонефрита признаками
- Изучение взаимосвязей полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов со скоростью прогрессирования хронического гломерулонефрита
Введение к работе
Актуальность темы. Среди болезней почек хронический гломерулонефрит (ХГН) является одним из самых серьезных заболеваний по своей медицинской и социальной значимости, из-за высокой распространенности и прогрессирующего течения, приводящего к развитию хронической почечной недостаточности, требующей проведения програмного гемодиализа или трансплантации почки (Корякова Н.Н. и др., 2006; Макарова Ю.А. и др., 2006; Мовчан Е.А, 2008). Хронический гломерулонефрит занимает доминирующее место в группе хронических болезней почек, ежегодно приводящих к смертности примерно 850000 человек и обуславливающих более 1,5 млн. случаев утраты трудоспособности (Смирнов А.В. и др., 2006). Прогрессирование хронического гломерулонефрита неуклонно ведёт к терминальной стадии хронической почечной недостаточности, а также к увеличению числа пациентов, получающих заместительную почечную терапию, что требует дополнительных экономических расходов на её проведение (Бадаева С.В. и др., 2006; Ткалич Л.М. и др., 2006; Rutkowski B. et al., 2006; Бикбов Б.Т. и др., 2007).
Хронический гломерулонефрит – это хроническое диффузное заболевание почек, развивающееся преимущественно на иммунной основе, характеризуется первичным поражением клубочкового аппарата с последующим вовлечением остальных структур почки и прогрессирующим течением, исходом которого являются нефросклероз и почечная недостаточность (Сметанникова Т.С. и др., 2006). Важное значение в развитии и прогрессировании ХГН отводится вазоактивным гормонам, активация которых происходит после запуска цепи иммуно-воспалительных реакций (Камышова Е.С. и др., 2005; Карабаева А.Ж. и др., 2006; Buraczynska М. et al., 2006). Вазоактивные гормоны регулируют почечную гемодинамику, пролиферацию мезангиальных клеток, а также процессы синтеза и деградации межклеточного матрикса, влияют на скорость развития гломерулосклероза (Шестаков А. Е., 2006).
Изучению генетических основ хронического гломерулонефрита посвящен ряд работ (Белянская Т.В. и др., 2005; Shu K.H. et al., 2005; Шестаков А. Е. и др., 2006; Buraczynska М. et al., 2006; Babel N. et al., 2006; Шишкин А.И. и др., 2007). В России такие исследования затрагивают лишь узкий набор локусов: интегральных мембранных белков (Шестаков А.Е., 2006), факторов некроза опухоли (Некипелова Е.В. и др., 2006), интерлейкинов (Петросян Э. К. и др., 2006а; Калмыкова Е.В., 2009). В некоторых исследованиях показаны ассоциации полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов с хроническим гломерулонефритом (Камышова Е.С. и др., 2005; Калиев Р.Р. и др., 2005; Buraczynska М. et al., 2006;. Шарнова Ж.П. и др., 2006б; Шарнова Ж.П. 2007). Следует отметить, что результаты исследований разных авторов не дают однозначного ответа о патогенетической роли отдельных полиморфизмов генов вазоактивных гормонов при хроническом гломерулонефрите. Это диктует необходимость проведения дальнейших исследований в данной области.
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт № 02.740.11.0496 «Генетические факторы мультифакториальных заболеваний человека»).
Цель исследования: Изучить полиморфизмы генов вазоактивных гормонов и оценить их патогенетическую значимость для хронического гломерулонефрита.
Задачи исследования:
1. Изучить распределение полиморфизмов десяти генов вазоактивных гормонов (I/D ACE, 4а/4b eNOS, S311C PON2, -6A/G AGT, -1166A/С ATIIR1, G/A GNB3 (rs2301339), G460W ADD1, +46G/A ADRB2, K198N ET-1, +6986G/A CYP3A5) у больных хроническим гломерулонефритом и в популяционном контроле.
2. Исследовать влияние генетических полиморфизмов на форми-рование хронического гломерулонефрита.
3. Рассмотреть ассоциации генов-кандидатов с качественными и количественными патогенетически значимыми признаками хронического гломерулонефрита.
4. Проанализировать генетические и средовые факторы почечной выживаемости.
5. Выявить молекулярно-генетические маркеры ускоренного прогрессирования хронического гломерулонефрита.
Научная новизна. Впервые комплексно изучен полиморфизм генов вазоактивных гормонов – ангиотензин-превращающего фермента (I/D ACE), эндотелиальной синтазы окиси азота (4а/4b eNOS), параоксоназы-2 (S311C PON2), ангиотензиногена (-6A/G AGT), рецептора ангиотензина-II первого типа (-1166A/С ATIIR1), 3-субъединицы гуанин связывающего белка (G/A GNB3 rs2301339), -аддуцина (G460W ADD1),
2-адренорецептора (+46G/A ADRB2), эндотелина-1 (K198N ET-1), цитохрома 3A5 (+6986G/A CYP3A5) у больных хроническим гломерулонефритом русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ.
Выявлены ассоциации полиморфных генетических маркеров с особенностями дебюта хронического гломерулонефрита. Установлены взаимосвязи генов вазоактивных гормонов с клинически значимыми качественными и количественными признаками при обострении хронического гломерулонефрита. Показано значимое влияние генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов на почечную выживаемость и характер прогрессирования ХГН.
Научно-практическое значение. Результаты работы вносят вклад в расшифровку генетических механизмов развития и прогрессирования хронического гломерулонефрита, формирование представлений о молекулярно-генетических основах заболевания.
Выделены генетические факторы риска развития неблагоприятных качественных и количественных клинически значимых признаков ХГН. Определены генетические маркеры раннего развития хронической почечной недостаточности. Установлены прогностические значимые факторы, снижающие почечную выживаемость – аллели 311S PON2, -1166C ATIIR1 и наличие артериальной гипертонии. Проведение молекулярно-генетического тестирования больных ХГН позволит формировать группы риска неблагоприятного течения заболевания и уже в этих группах пациентов более эффективно проводить лечебно-профилактические мероприятия.
Положения, выносимые на защиту:
1. Полиморфные варианты генов вазоактивных гормонов взаимосвя-заны с клиническими особенностями дебюта хронического гломерулонефрита.
2. Молекулярно-генетические маркеры ассоциированы с клинически значимыми качественными и количественными признаками при обострении ХГН.
3.Факторами риска развития хронической почечной недостаточности служат генетические полиморфизмы +6986G/A CYP3A5 и S311C PON2.
4. Генетическими факторами ускоренного падения функции почек являются 311SC и 311SS PON2, -1166AC и -1166CC ATIIR1, +46AA ADRB2, 198KK и 198KN ET-1.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине» (Москва, 2009), Съезде кардиологов и терапевтов ЦФО России «Традиции, современность, будущее» (Тверь, 2009), 43-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых учёных «Актуальные проблемы теоретической, эспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2009), Всероссийском школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых учёных «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009), Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения заболеваний внутренних органов» (Белгород, 2009), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвящённом 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009), 63-й итоговой научной конференции молодых учёных с международным участием (Ростов-на-Дону, 2009), 64-й Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2009), IX Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых учёных по медицине (Тула, 2010), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы полиморбидной патологии в клинике внутренних болезней» (Белгород, 2010), V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2010), третьей международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения – 2010» (Белгород, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 4 в журналах из списка ВАК.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включает в себя 20 таблиц, 28 рисунков. Состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов. Библиографический список включает 231 источник, из них 113 отечественных и 118 иностранных.
Молекулярные механизмы этиопатогенеза хронического гломерулонефрита
Механизмы формирования хронического гломерулонефрита имеют достаточно сложный характер, поэтому требуют более детального изучения в нефрологии [Mozes М.М. et al., 1999; Lokatelli F. et al., 2000; Шилов E.M. и др., 2000].
Общепринято, что в основе развития и прогрессирования ХГН лежат иммунопатологические процессы. Отмечают два возможных механизма развития гломерулонефрита: иммунокомплексный и антительный [Segerer S. et al., 2000; Нефрология, 2000; Шулутко Б.И., 2001]. Первая стадия заключается в том, что в ответ на попадание в организм инфекций к антигенам появляются антитела, которые, соединяясь с анигеном, образуют иммунные комплексы, активирующие комплимент [Шилов Е.М. и др., 2000]. Эти комплексы вначале циркулируют в сосудистом русле, а затем откладываются на наружной поверхности базальной мембраны клубочковых капилляров (БМК), а также в мезангии клубочков. К местам отложения иммунных комплексов и комплимента устремляются нейтрофилы, ферменты которых усиливают повреждение эндотелия и базальной мембраны, отделяя их друг от друга. ХГН развивается в тех случаях, когда гиперплазия эндотелия и мезангиальных клеток оказывается недостаточной и иммунные комплексы не удаляются из почки, что приводит к хроническому течению воспалительного процесса [Маколкин В.И., 1999].
Развитие хронического гломерулонефрита обуславливается также и антительным механизмом: в ответ на внедрение в организм различных антигенов имммунокомпетентная система вырабатывает антитела, тропные к базальной мембране капилляров, которые фиксируются на её поверхности. [Тареева И.Е. и др., 2000; Шилов Е.М., 2000]. Происходит повреждение мембраны, и её антигены становятся чужеродными для организма, в результате чего вырабатываются аутоантитела, которые также фиксируются на базальной мембране. Комплимент оседает на мембране в зоне локализации комплекса аутоантиген - аутоантитело [Тареева И .Е. и др., 2000]. Далее происходит миграция нейтрофилов к базальной мембране. При разрушении нейтрофилов выделяется ферменты, усиливающие повреждение мембраны. Выделение тромбоцитами, фиксированными в месте повреждения мембраны, вазоактивных веществ усиливает процессы воспаления. Хроническое течение процесса обуславливается постоянной выработкой аутоантител к антигенам базальной мембраны капилляров [Шулутко Б.И., 2003; Паунова С.С, 2005].
Схематично патогенез гломерулонефрита может быть представлен следующим образом (рис. 1).
Следует отметить, что ведущим фактором прогрессирования хронических заболеваний почек является склероз гломерул и интерстиция. Развитие прогрессирующего почечного фиброза представляется сегодня сложной цепью событий, включающей в себя [Нефрология, 2000]:
Межклеточные взаимодействия гломерулярных и инфильтрующих клубочки клеток крови, которые обеспечиваются выделением широкого ряда медиаторов, включая цитокины и факторы роста [Паунова С.С, 2005; Верткин А.Л. и др., 2006];
Последующее изменение функционального состояния гломерулярных клеток с развитием их пролиферации и избыточного накопления матрикса [Тареева И.Е., 1996];
Развитие гломерулосклероза из-за недостаточной утилизации избытка матрикса [Пальцев М.А. и др., 1994].
Кроме иммунных механизмов в развитии и прогрессировании ХГН принимают участие и неиммунные механизмы, среди которых следует упомянуть повреждающее действие протеинурии на клубочки и канальцы, повышение внутрисосудистого свёртывания крови, выпадение фибрина и продуктов его распада в клубочковых капиллярах, а также повышение в крови концентрации кининов, серотонина, ренина, простагландинов, артериальную гипертензию, ускоряющую развитие почечной недостаточности [Locatelli F. et al., 1996; Шейман Д.А., 1999; Кутырина И. М. и др., 1999; Рябов СИ., 2000; Шишкин А.Н. и др., 2005]. Патологические изменения в почках при ХГН касаются всех их структурных элементов — клубочков, канальцев, стромы, а также сосудов [Чеботарёва Н.В. и др., 2006]. Сосудистая реакция почечной ткани отличается большим разнообразием по характеру и степени выраженности патологических изменений. Так в мелких артериях и артериолах развивается пролиферативный эндартериит с исходом в склероз интимы, сужением или полной облитерацией просвета сосудов. [Алексееа В.Г., 1996; Чиж А.С. и др., 1998; Кутырина И.М., 1999]. При гипертонической форме хронического гломерулонефрита обнаруживается артериологиалиноз и реже артериолосклероз. Возможна и гиперплазия интимы средних и крупных сосудов почки. В результате этих изменений происходит прогрессивно нарастающее снижение почечного кровотока, а затем вторично наступающее запустевание лимфатических сосудов и нарушение лимфообращения. Среди неиммунных механизмов развития и прогрессирования клубочковых поражений в первую очередь выделяют гемодинамические, т.е. системную и внутреннюю гипертензию. [Нефрология, 2000; Мартынов С.А. и др., 2006]. Было установлено, что повышенное давление внутри клубочковых капилляров передаётся на мезангий, что приводит к пролиферации мезангиальных клеток и гиперпродукции мезангиального матрикса [Кутырина И.М. и др., 2005; Мартынов С.А. и др., 2006]. Длительно существующая внутриклубочковая гипертензия сопровождается нарушением порозности базальной мембраны капилляров клубочков, что делает их проницаемыми для макромолекул белков, липидов и других компонентов плазмы [Чупрасов В.Б., 2001]. Проникая через БМК, макромолекулы откладываются- в мезангий, стимулируя его расширение, пролиферацию мезангиальных клеток и гиперпродукцию мезангиального матрикса, что заканчивается склерозированием клубочка [Джаналиев Б.Р. и др., 2001; Шишкин А.Н. и др., 2005]. Считается, что таким же путём повреждает почки и системная гипертензия. Повреждение почек традиционно объясняли развитием ишемии клубочков вследствие сужения просвета прегломерулярных артерий и артириол [Алексеев В.Г. и др., 1996; ТарееваИ.Е., 1996]. Связь между состоянием почек и артериальной гипертонией (АГ) достаточно сложна и при этом образуется замкнутый круг, в котором почки являются одновременно и причиной АГ, и органом-мишенью [Шулутко Б.И., 2001; Кузьмин О.Б., 2007]. Хронический гломерулонефрит чаще, чем другие заболевания почек, приводит к развитию АГ. Среди больных с почечной формой АГ эта патология выявляется более чем у 40% больных. По мере снижения функций почек частота АГ резко возрастает, достигая 85-90% в стадии почечной недостаточности независимо от нозологии почечного процесса [Боровкова Н.Ю., 2009]. Заболевания почек могут быть причиной нарушения в регуляции артериального давления и развития артериальной гипертензии путём различных механизмов, главными из которых являются [Нефрология, 2000]:
нарушение водно-электролитного баланса (задержка натрия и воды) что обусловлено дисфункцией противоточно-множительной системы почечных канальцев и снижением фильтрационной способности почек при развитии гломерулосклероза;
активация прессорных гормональных систем (ренин-ангиотензиновой, симпатоадреналовой, констрикторных гормонов эндотелия — эндотелинов);
угнетение депрессорных гормональных систем (почечных простагландинов, калликреин-кининовой системы и гормона эндотелия - оксида азота).
Накопление натрия в организме приводит к развитию гиперволемии с последующим увеличением сердечного выброса [Рябов СИ. и др., 1997; Кузьмин О.Б. и др., 2008]. Одновременно увеличивается объём внеклеточной жидкости, повышается содержание натрия в сосудистой стенке, что приводит к её набуханию и повышению чувствительности к прессорным влияниям вазоконстрикторных гормонов (ангиотензина, вазопрессина, сосудосуживающих гормонов эндотелия) [Лифшиц Н.Л. и др., 1999; Шулутко Б.И., 2003; Карабаева А.Ж. и др., 2006]. Повышение уровня внутрисосудистого натрия сопровождается одновременным накоплением ионов кальция в цитозоле, что создаёт основу высокого общего периферического сопротивления и общего почечного сосудистого сопротивления [Кутырина И.М., 2002; Кутырина И.М. и др., 2004; Кузьмин О.Б. идр.,2005].
Молекулярно-генетические методы
Материалом для исследования послужила венозная кровь в объеме 8-9 мл, взятая из локтевой вены пробанда. Забор венозной крови производили в пробирки с консервантом, содержащим 0,5М раствор ЭДТА (рН=8.0), тщательно перемешивали и хранили при температуре 4С не более одной недели.
Выделение геномной ДНК из периферической крови осуществлялось методом фенольно-хлороформной экстракции [Mathew C.C, 1984] в два этапа. На первом этапе к 4 мл крови добавляли 25 мл лизирующего буфера, содержащего 320мМ сахарозы, 1% тритон Х-100, 5мМ MgCl2, ЮмМ трис-НС1 (рН=7,6). Полученную смесь перемешивали и центрифугировали при 4С, 4000 об./мин. в течение 20 минут. После центрифугирования надосадочную жидкость сливали, к осадку добавляли 4 мл раствора, содержащего 25 мМ ЭДТА (рН=8,0) и 75 мМ NaCl, ресуспензировали. Затем прибавляли 0,4 мл 10% SDS, 35 мкл протеиназы К (10мг/мл) и инкубировали образец при 37С в течение 16 часов.
На втором этапе из полученного лизата последовательно проводили экстракцию ДНК равными объемами фенола, фенол-хлороформа (1:1) и хлороформа с центрифугированием при 4000 об./мин. в течение 10 минут. После каждого центрифугирования производили отбор водной фазы. ДНК осаждали из раствора двумя объемами охлажденного 96% этанола. Сформированную ДНК растворяли в бидистиллированной, деионизованнои воде и хранили при -20С. Выделенную ДНК использовали для проведения полимеразной цепной реакции синтеза ДНК.
Анализ всех локусов осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПНР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на амплификаторах «Терцик-МС4» производства компании "ДНК-технология" и Bio-Rad IQ5 (Multicolor Realime PCR Detection System) с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы "Силекс-М" и олигонуклеотидных праймеров и зондов (для детекции методом Tag Man), синтезированных фирмой «Синтол» (таблица 1).
Генотипирование ДНК-маркеров производилось следующими методами:
1) анализ полиморфизма длин амплифицируемых фрагментов (ПДАФ) (Alu полиморфизм АСЕ , VNTR eNOS)). Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводили в 2% агарозном геле, предварительно окрашенным бромистым этидием. В качестве электрофорезного буфера использовали IxTAE (трис-ацетатный буфер). Результаты анализировали в проходящем ультрафиолетовом свете в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP (Швеция).
2) анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (локусы. S311С PON2, -6A/G AGT, -1166A/G ATIIR1). После инкубации рестрикционной смеси с соответствующей рестриктазой в течение 16 часовv при температуре 37С проводили разделение фрагментов ДНК с помощью горизонтального электрофореза на электрофоретических ячейках, производства фирмы «Хеликон» (Россия). В зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК использовали агарозный гель 2-3% концентрации, приготовленный на основе ТВЕ-буфера, окрашенный раствором бромистого этидия (0,01%). Визуализация фореграмм осуществлялась в темном боксе с трансиллюминатором фирмы UVP.
3) анализ дискриминации аллелей методом Tag Man зондов (локусы K198N ЕТ-1, +6986G/A CYP3A5, G/A GNB3 (rs2301339), G460W ADD1, +46G/A ADRB2). При проведении ПНР в амплификаторе Bio-Rad; IQ5 с флюоресцентной детекцией генотипирование осуществлялось методом Tag Mans зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда. Результаты генотипирования выводились на экран персонального компьютера. Для анализа данных использовалась программа «Bio-Rad IQ5-Standart Edition».
Инсерционно-делеционный полиморфизм гена ангиотензин-превращающего фермента (I/D АСЕ). Ген AGE расположен на хромосоме 17q23, состоит из 26 экзонов общей длиной 4,3 тпн. В интроне 16 гена расположен участок, полиморфизм которого обусловлен наличием; или отсутствием (инсерция или делецией) участка длиной 287 пар нуклеотидов.
Анализ локуса АСЕ проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК с использованием стандартных олигонуклеотидных праймеров (табл. 1). Реакция осуществлялась в 12,5 мкл общего объема смеси, содержащей 33 мМ трис-HCl (рН=8,8), 1,25 мМ MgCl2, 0,1 мкг геномной ДНК, по 5 пМ каждого праймера, по 100 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной Taq-полимеразы. После денатурации (5 мин при 95С) выполняли 33 цикла амплификации по схеме: денатурация -40 сек при 94С; отжиг праймеров - 40 сек при 57С; элонгация - 30 сек при 72С. Затем пробы выдерживали 6 мин при 72С и охлаждали. Продукты амплификации разделяли в 2%-ном агарозном геле, окрашенным бромистым этидием, в течение 20 минут при 200V. В качестве электрофорезного буфера использовали ІхТАЕ (трис-ацетатный буфер). Затем пробы идентифицировали в проходящем УФ-свете. При анализе амплифицируемых фрагментов применяли следующую номенклатуру аллелей: аллель I (490 пн) - наличие (инсерция) Alu-повтора, аллель D (190 пн) - его отсутствие (делеция) [Agerholm-Larsen В. et al., 2000]
Исследование взаимосвязей генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов с качественными и количественными патогенетически значимыми для хронического гломерулонефрита признаками
Вданном разделе работы мы изучили взаимосвязи рассматриваемых генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов как с качественными, так и с количественными признаками, характеризующими хронический гломерулонефрит с клинических позиций (клинические синдромы, зарегистрированные при возникновении заболевания, наличие нарушения функции почек при формировании заболевания, развитие гематурии, протеинурии, повышенного артериального давления, частота обострения заболевания, клинические варианты ХГН).
Для оценки функции почек в дебюте заболевания нами были сформированы две группы: первую группу составили пациенты с сохранной функцией (п=107 человек), вторую - больные со сниженной функцией почек (п=55человек). При изучении распределения полиморфных генетических маркеров среди больных ХГН с сохранной и сниженной функцией почек, а также в контрольной группе выявлены статистически достоверные различия в частотах генотипов и аллелей по локусу S3 ПС параоксоназы-2 (таб.4, рис. 13). Установлено, что среди больных ХГН со сниженной функцией почек, концентрация генотипа 311SS составила 72,72% и была наибольшей по сравнению как с контролем, где данный показатель составил 50,66% (х2=8,27, р=0,005, с учётом поправки Бонферрони рсог =0,015, OR=2,60, 95%С1 1,32-5,15), так и с пациентами с ХГН с сохранной функцией почек (52,83%, %2=5,16, р=0,02, Рсог =0,06). Выявлены различия в распространённости генотипа 311SC PON2 между больными со сниженной функцией почек и контрольной группой: среди больных концентрация данного маркера была более чем в 1,7 раза ниже, чем в контрольной группе (х2=6,12, р=0,01, рсог=0,03, OR=0,42, 95%С1 0,21-0,85).
Следует отметить, что в отечественной и зарубежной литературе сведения о взаимосвязях полиморфизма S3 ПС PON2 с функцией почек у больных с нефропатиями малочисленны. В настоящее время накоплено значительное количество фактов, свидетельствующих о том, что важным патогенетическим звеном в развитии гломерулонефрита является дисбаланс функционирования системы перекисного окисления липидов и антиоксидантнои защиты [Брциева З.С. и др., 2005]. Повреждение почечных структур может начинаться с образования активных форм кислорода, стимулированых нейтрофилами, макрофагами и мезангиальными клетками почечных клубочков. Если при этом система антиоксидантной защиты оказывается несостоятельной, то это может привести к усилению перекисного окисления липидов и повреждению мембран клеток нефротелия [Смирнов А.В, 2000; Biasioli S. et al., 2003]. Одним из основных ферментов, предотвращающих перекисное окисление липидов, является параоксоназа. Уменьшение продукции данного фермента способствует снижению резервов антиоксидантной защиты, прогрессированию гломерулосклероза, а также снижению почечной функции [Нефрология, 2000].
По л оку су -1166 А/С ATIIR1 также получены достоверные различия в концентрациях генотипов среди больных ХГН с сохранной и сниженной функцией почек (таб.4). Так у больных со сниженной функцией почек частота генотипа -1166АС равнялась 28,85%, что значительно ниже (в 1,7 раз) по сравнению с концентрацией данного генотипа среди пациентов с сохранной функцией почек (50,47%, х2=5,81, р=0,017, рсог=0,05).
Таким образом, генетические маркеры 31 IS и 311SS PON2 являются факторами риска снижения почечной функции у больных ХГН в дебюте заболевания (OR=2,14 и 2,60 соответственно), аллель 311С PON2 и генотипы 311SC PON2, -1166AC ATIIR1 можно считать протективными факторами развития нарушений функций почек при возникновении заболевания (OR=0,47; 0,42 и 0,17 соответственно).
Изучение клинических синдромов при возникновении ХГН показало, что у 26,7% больных заболевание начиналось остронефритическим синдромом, у 30,4% - нефротическим синдромом, у 24,4% - мочевым синдромом, гематурический синдром наблюдался у 18,5% больных ХГН.
Анализ распределения полиморфизмов генов вазоактивных гормонов у больных ХГН в зависимости от клинических синдромов дебюта (таб.5) выявил достоверные различия в концентрации генотипов по локусу -6A/G AGT в сравнении с популяционным контролем.
Получено, что у больных ХГН, имеющих остронефритический синдром при возникновении заболевания, концентрация генотипа -6AG AGT составила 67,24%, что значительно превысило частоту данного генотипа как в контроле (43,89%, у?=9,12, р=0,003, pcor=0,009, OR=2,62, 95%С1 1,40-4,96), так и среди больных ХГН с другими синдромами в дебюте заболевания: мочевой (43,40%, =5,46, р=0,020, рсог=0,060), нефротический (44,62%о, -=5,41, р=0,019, рсог=0,057), гематурический (47,50%, х2=3,05, р=0,08).
Наряду с этим выявлена ассоциация аллеля 460W гена ADD1 с мочевым синдромом при формировании ХГН (рис.14): частота данного аллеля у больных с мочевым синдромом составила 23,58%, что достоверно выше чем в группе контроля - 15,13% (х2=4,П, р=0,04, OR=l,73, 95%С1 1,02-2,93). Следует отметить, что концентрация аллеля 460W ADD1 у больных с мочевым синдромом ХГН (23,58%) является наибольшей по сравнению с пациентами с ХГН с другими клиническими синдромами (9,48-17,19%).
Таким образом, в результате исследования были выявлены аллели и генотипы изучаемых генов вазоактивных гормонов, которые могут служить маркерами формирования того или иного синдрома при возникновении хронического гломерулонефрита. Так, маркером развития остронефритического синдрома в дебюте ХГН следует считать генотип -6AG гена AGT (OR=2,62), а аллель 460W гена ADD1 является маркером формирования мочевого синдрома (OR=l,73).
При оценке уровня АД в течение заболевания больные были условно разделены на три группы согласно Рекомендациям Всероссийского научного общества кардиологов (ВНОК, 2004г.): больные с АД 140/90 мм рт ст, АД от 140/90 до 159/100 мм рт ст, АД 160/110 мм рт ст.
Изучение взаимосвязей полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов со скоростью прогрессирования хронического гломерулонефрита
Ассоциации полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов с прогрессированием ХГН исследованы в двух группах больных. В первой группе больных ХГН (п=71), достигших терминальной стадии почечной недостаточности (ТХПН), оценивали распределение генотипов и аллелей полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов по сравнению с контрольной группой, а также ассоциацию данных локусов с длительностью ХГН до развития ТХПН.
Во второй группе, включающей 104 пациента без удвоения креатинина и 34 больных с удвоением исходного уровня креатинина, проводился анализ влияния различных факторов на скорость прогрессирования почечной недостаточности.
Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов у больных ХГН с ТХПН и в контроле достоверных различий не выявил (таб. 13).
При исследовании длительности ХГН до развития ТХПН в зависимости от генотипов рассматриваемых полиморфизмов генов вазоактивных гормонов статистически значимых взаимосвязей выявлено не было (таб. 14).
Проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов в группах больных ХГН в зависимости от уровня креатинина: без удвоения креатинина и с удвоением креатинина (таб.15). Установлены статистически достоверные различия в частотах генотипов и аллелей по локусу +6986G/A цитохрома ЗА5 среди рассматриваемых групп больных ХГН, а также в контрольной группе (таб. 15). Обнаружено, что среди больных с удвоением креатинина концентрация генотипа +6986GG CYP3A составила 72,73% и была наименьшей по сравнению с группой больных без удвоения креатинина (87,38%, х "2,9s, р=0,09) и контрольной группой, где данный показатель составил 88,81% (х2=5,55, р=0,019, pcor=0,057, OR=0,34, 95%С1 0,14-0,85). Выявлены различия и в распространённости генотипа +6986GA CYP3A5 между больными с удвоением креатинина и популяционным контролем: среди больных концентрация данного маркера (27,27%) была более чем в 2,5 раза выше, чем в контроле (10,53%), х2=6,32, р=0,013, рсог=0,039, OR=3,19, 95%С1 1,25-7,99).
Аналогичной направленности результаты получены и по распределению аллелей локуса +6986G/A CYP3A5 (рис. 16). Выявлена более высокая частота аллеля +6986А (в 2 раза) в группе пациентов с удвоенным креатинином (13,64%) по сравнению с контрольной группой (5,92%, х2=4,52, р=0,034, OR=2,51, 95%С1 1,06-5,76).
Достоверные различия в концентрациях аллелей между больными ХГН с удвоением креатинина и контролем были установлены и по гену S3 ПС параоксоназы-2 (рис. 17). Частота аллеля 31 IS PON2 составила 83,82% среди пациентов с удвоением креатинина, что выше чем в контрольной группе (71,88%, х2=3,85, р=0,05, OR=2,03, 95%С1 1,01-4,20).
Таким образом, можно отметить, что протективным фактором удвоения креатинина у больных ХГН следует считать аллель +6986G и генотип +6986GG локуса CYP3A5 (отношения шансов равны 0,40 и 0,34 соответственно), в то время как генетические маркеры 31 IS PON2, +6986А CYP3A5 и +6986GA CYP3A5 являются факторами риска развития хронической почечной недостаточности (OR равны 2,03; 2,51 и 3,19 соответственно).
При оценке почечной выживаемости у больных ХГН в зависимости от генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов, проведённой с использованием метода множительных оценок Каплан-Майера [Боровиков В., 2003], найдены статистически значимые взаимосвязи со скоростью прогрессирования заболевания по четырём из десяти рассматриваемых генетических маркеров (рис. 18-27): это генетические полиморфизмы S311C PON2, -1166А/С ATIIR1, +46G/A ADRB2, K198N ЕТ-1. Нами установлено, что с ускоренным падением функции почек ассоциированы следующие молекулярно-генетические маркеры:
1) 311SC и 311SS PON2 (р=0,05) (рис. 20).
2) -1166АС и -1166СС ATIIR1 (р=0,008) (рис. 22).
3) +46АА ADRB2 (р=0,05) (рис. 25).
4) 198КК и 198KN ЕТ-1 (р=0,05) (рис. 26).
Таким образом, генопипы 311SC и 311SS PON2, -1166АС и -1166СС ATIIR1, +46АА ADRB2, 198КК и 198KN ЕТ-1 можно считать неблагоприятными факторами почечной выживаемости у больных ХГН.
Следует отметить, что по локусу -1166А/С ATIIR1 аналогичной направленности результаты были получены Buraczynska М. и соавт. (2006) при исследовании генов ренин-ангиотензиновой системы у больных ХГН. В данной работе установлено, что у пациентов, имеющих генотипы -1166АС и -1166СС, среднее время развития заболевания до ТХПН было значительно меньше, чем у лиц с генотипом -1166АА локуса ATIIRl. Шарнова Ж.П. и соавт. (2006а) выявили, что генотип -1166АС гена ATIIRl является предрасполагающим фактором к развитию хронической почечной недостаточности в исходе нефротического синдрома у детей.
С помощью монофакторного анализа почечной выживаемости (регрессионная модель Кокса) были выделены факторы, имеющие неблагоприятное прогностическое значение. Установлено, что наличие аллеля 31 IS гена PON2, аллеля -1166С гена ATIIR1 и артериальной гипертензии на протяжении ХГН ухудшают почечную выживаемость (таб. 16).
Значимая роль гемодинамических нарушений (в том числе проявляющихся артериальной гипертензией) в прогрессировании хронического гломерулонефрита подтверждается и результатами других исследований [Полещук Л.А., 2006; Чихладзе Н.М. и др., 2006; Боровкова Н.Ю., 2009]. Связь между состоянием почек и артериальной гипертензией сложна: с одной стороны патология почек является причиной АГ, а с другой стороны их функционирование зависит от уровня артериального давления. Если говорить о системной гипертензии, то повреждение почек
традиционно объясняется развитием ишемии клубочков вследствие сужения просвета прегломерулярных артерий и артериол [Алексеев В.Г. и др., 1996; Тареева И.Е., 1996]. При гломерулонефритах почечные клубочки, сохранившиеся после первоначального повреждения, подвергаются адаптивным изменениям для компенсации потери функционирующей почечной массы. Повышение функции почечных клубочков сопряжено со значительным изменением внутрипочечной гемодинамики, а именно с усилением перфузии оставшихся нефронов и развитием при этом внутриклубочковой гипертензии и гиперфильтрации [Нефрология, 2000].
