Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 10-42
1.1. Молекулярные механизмы патогенеза хронического лимфолейкоза 10-20
1.2. Интерлейкины, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение 20-32
1.3. Генетические исследования В-клеточного хронического лимфолейкоза 33-42
ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования 43-61
2.1. Характеристика обследованных групп 43-45
2.2. Молекулярно-генетические методы 46-58
2.3. Генетико-статистические методы 58-61
ГЛАВА 3. Исследование патогенетического значения генетических полиморфизмов интерлейкинов при хроническом лимфолейкозе 62-111
3.1. Изучение ассоциаций полиморфных маркеров генов интерлейкинов с развитием хронического лимфолейкоза 62-74
3.2. Исследование связей генетических полиморфизмов интерлейкинов с качественными патогенетически значимыми для хронического лимфолейкоза признаками 75-93
3.3. Анализ вклада сочетаний генов интерлейкинов в генетическую предрасположенность к хроническому лимфолейкозу и формирование качественных патогенетически значимых для ХЛЛ признаков 93-97
3.4 Генетические полиморфизмы и клинико-лабораторные показатели больных хроническим лимфолейкозом 97-105
3.5. Исследование общей выживаемости пациентов с хроническим лимфолейкозом в зависимости от генотипов полиморфных маркеров интерлейкинов 105-111
Обсуждение 112-126
Выводы 127
Список литературы
- Интерлейкины, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение
- Молекулярно-генетические методы
- Генетико-статистические методы
- Исследование связей генетических полиморфизмов интерлейкинов с качественными патогенетически значимыми для хронического лимфолейкоза признаками
Введение к работе
Актуальность проблемы. Проблема лейкозов является одной из важных в современной медицине. В мире наблюдается непрерывный рост заболеваемости лейкозами [Hamblin T.J. et al., 2002; Никитин Е.А.и др., 2010]. При этом одной из наиболее распространенных форм лейкоза является хронический лимфолейкоз (ХЛЛ). Хронический лимфолейкоз — опухолевое заболевание лимфатической ткани, в основе развития которого лежит моноклоновая пролиферация патологических лимфоидных элементов [Морозова В.Т. и др., 2002, Воробьев А.И. и др., 2003, Никитин Е.А. и др., 2003]. Ежегодная заболеваемость ХЛЛ составляет 2,5-3 на 100 тыс. населения, а для лиц старше 60 лет - до 10 на 100 тысяч населения [Kini A. et al, 2000; Морозова В.Т. и др., 2002, Воробьев А.И. и др., 2003, Quiney С. et al., 2007]. Течение хронического лимфолейкоза характеризуется развитием различных осложнений: инфекционных (у 85% пациентов), цитопенических — анемия (15-30%) и тромбоцитопения (5-15%), снижающих продолжительность жизни больных [Доронин В.А. и др., 2003; Алексеева Ю.А. и др., 2008; Damle RN., et al, 2010].
Изучение факторов, определяющих формирование хронического лимфолейкоза, продолжает оставаться в центре внимания отечественных и зарубежных ученых [Caporaso N., et al, 2004; Eichhorst В. et al, 2008 Bianchi S. et al, 2010; Lee B.N. et al, 2011; Войцеховский B.B., 2007; Бидерман Б.В., 2008; Данилова Н.В. и др., 2009]. Как свидетельствуют результаты ряда исследований [Hjalmar V., 2002; Stevenson F.K., Caligaris-Cappio F., 2004; Клинков А.А. и др., 2004; Гра О.А. и др., 2008;], значимую роль в развитии ХЛЛ играют генетические факторы. Среди генов-кандидатов, регулирующих, преимущественно, процессы неспецифической защиты организма, гемопоэза, апоптоза, и опухолевой прогрессии, важное значение для хронического лимфолейкоза имеют гены интерлейкинов [Ntickel Н., 2004; Tomic J. et al., 2006; Ddhner H. et al., 2011; Антонеева И.И. и др., 2007]. Интерлейкины -полипотентные вещества белковой природы, обладающие множественными биологическими эффектами [Корякина Л.А., 2004]. Являясь начальным звеном активации иммунного ответа, они определяют эффективность и тип иммунного реагирования, принимают непосредственное участие в регуляции апоптотических и аутоиммунных процессов [Ana М. Peiro, 2008, Кетлинский С.А.,2008].
Клинико-генетические работы, посвященные молекулярно-генетическим аспектам хронического лимфолейкоза в России немногочислены и затрагивают преимущественно гены факторов некроза опухолей и детоксикации [Клинков А.А. и др., 2004; Бакиров Б.А., и др., 2005;2010; Гра О.А. и др., 2008; Овсепян В.А. и др., 2010, Тикунова Т.С., 2011]. Комплексные исследования роли полиморфных генетических маркеров интерлейкинов в отношении хронического лимфолейкоза в нашей стране до сих пор не проведены. Это диктует необходимость выполнения настоящего исследования.
Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (госконтракт № 14-740-11-0627)
Цель исследования:
Изучить генетические полиморфизмы интерлеикинов и оценить их патогенетическую значимость для хронического лимфолейкоза.
Задачи исследования:
Изучить ассоциации генетических вариантов интерлеикинов (VNTR IL-IRa, -889С/Т IL-1A, -511С/Т IL-1B, -590С/Т IL-4, -703С/Т IL-5, -174 G/C IL-6, -251A/T IL-8, T113M IL-9, -592C/A IL-10) с формированием хронического лимфолейкоза.
Рассмотреть вклад сочетаний генов интерлеикинов в генетическую предрасположенность к хроническому лимфолейкозу.
Провести анализ ассоциаций полиморфизмов генов интерлеикинов с качественными патогенетически значимыми фенотипами ХЛЛ.
Определить связи генов-кандидатов с клинико-лабораторными показателями больных ХЛЛ.
Выявить влияние генетических полиморфизмов на общую выживаемость больных хроническим лимфолейкозом.
Научная новизна.
Впервые установлено важное патогенетическое значение генетических полиморфизмов интерлеикинов (-511С/Т IL-1B, -889С/Т IL-1, -590С/Т IL-4, -703С/Т IL-5, -174G/C IL-6, -251 А/Т IL-8, Т113М IL-9, -592С/А IL-10, VNTR IL-IRa) при хроническом лимфолейкозе среди населения Центрального Черноземья РФ.
Выявлены ассоциации полиморфных генетических маркеров с формированием хронического лимфолейкоза. Показан вклад сочетаний генов интерлеикинов в генетическую предрасположенность к хроническому лимфолейкозу. Установлены связи генетических вариантов интерлеикинов с патогенетически значимыми качественными и количественными признаками хронического лимфолейкоза. Выявлены генетические факторы, снижающие общую выживаемость больных ХЛЛ.
Научно-практическое значение.
Результаты работы вносят вклад в расшифровку генетических механизмов предрасположенности к хроническому лимфолейкозу, формирование представлений о молекулярно-генетических основах заболевания. Генотипирование больных ХЛЛ по генам интерлеикинов позволит формировать группы риска тяжелого течения болезни, с целью более эффективной реализации среди этих пациентов комплекса лечебно-профилактических мероприятий, направленных на предотвращение неблагоприятного исхода ХЛЛ. Результаты исследования используются в учебном процессе при преподавании медицинской генетики в ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет».
Положения, выносимые на защиту:
1. Генетические варианты интерлейкинов и их сочетания определяют
предрасположенность к хроническому лимфолейкозу.
Полиморфизмы генов интерлейкинов проявляют плейотропное действие при формировании ХЛЛ .
Гены-кандидаты ассоциированы с патогенетически значимыми качественными и количественными признаками ХЛЛ.
4. Факторами, снижающими общую выживаемость больных
хроническим лимфолейкозом, являются -590Т IL-4, -174G IL-6 и наличие
цитопенических осложнений в течении заболевания.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и
обсуждены на: X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI
веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине» (Москва, 2009),
Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы
диагностики и лечения заболеваний внутренних органов» (Белгород, 2009),
IX Всероссийской университетской научно-практической конференции
молодых учёных по медицине (Тула, 2010), Международной научно-
практической конференции «Актуальные вопросы полиморбидной патологии
в клинике внутренних болезней» (Белгород, 2010), IV Международной
научной конференции молодых ученых-медиков (Курск, 2010), V
Международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской
конференции (Москва, 2010), третьей международной научно-практической
конференции «Геронтологические чтения - 2010» (Белгород, 2010), VI
Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону,
2010), VI Международной Пироговской научной медицинской конференции
(Москва, 2011), II Всероссийской научно-практической конференции с
международным участием «Медико-биологические аспекты
мультифакториальной патологии» (Курск, 2011), VII Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2012), пятой международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения - 2012» (Белгород, 2012).
Личный вклад автора. Автором лично определены цель и задачи исследования, разработаны методические подходы для их решения. Автор лично выполнил молекулярно-генетическое исследование, провел обработку, анализ и обобщение полученных результатов, подготовил основные публикации по выполненной работе, написал и оформил рукопись.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 5 в журналах из списка ВАК.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных материалов и методов, результаты и их обсуждение, а также выводы и список литературы. Материалы диссертации изложены на 155 страницах машинописного текста и содержат 12 таблиц и 45 рисунков.
Интерлейкины, их молекулярно-генетические характеристики и медико-биологическое значение
Среди интерлейкинов, как свидетельствуют данные литературы, важное значение в развитии хронического лимфолейкоза имеют интерлейкины 1А, 1В, антагонист рецептора интерлейкина 1, интерлейкин 4, интерлейкин 5, интерлейкин 6, интерлейкин 8, интерлейкин 9, интерлейкин 10 и др. [Сазонов А.Э. и др., 2005; Liu Н.М. et al.„ 2005; Acharya В. et al.„ 2005; Шабалдин A.B. и др., 2007, Лысенко О.В. и др., 2008]. Данные интерлейкины обладают множеством биологических эффектов и действуют как системно, так и локально [Корякина Л.А. и др., 2004; Oscier D., et al., 2010]. Семейство интерлейкина 1 (IL-1).
Семейство IL-1 включает два агониста - IL-1A, состоящий из 271 аминокислотного остатка с молекулярной массой 17 кДа, и IL-1B, содержащий 269 аминокислотных остатков и имеющий такую же молекулярную массу -17 кДа, и их специфический антагонист IL-lRa [Титов В. Н. и др., 2003; Имангулова М.М. и др., 2005; Arman A. et al.„ 2006]. Это семейство - член суперсемейства, в которое также входят гены, связывающие гепарин ростовых факторов (HBGF), ингибиторов трипсина (STI) и гистактофилина. Кластер генов IL-1 (430 Kb) находится на 2ql3 хромосоме и содержит гены IL-1A, IL-1B, рецептора IL-IRe и IL-lRa, строение которых достаточно консервативно [Alpizar W. et al., 2005]. Равновесие между продукцией, экспрессией и ингибицией синтеза белков этого семейства играет одну из ключевых ролей в развитии иммунных реакций [Шаимова В.А. и др., 2004; Рябичева Т.Г. и др., 2007]. Установлена ассоциация носительства отдельных аллелей генов семейства IL-1 с рядом опухолевых, аутоиммунных, инфекционных и воспалительных заболеваний [Громова А.Ю. и др., 2005; Rogus J. et al.„ 2008].
IL-1 - цитокин с широким диапазоном биологических и физиологических эффектов. Этот цитокин полифункционален и выполняет не менее 50 различных функций, мишенями которых служат клетки практически всех органов и тканей [Dinarello С.A. et al., 2011; Цейликман О. Б. и др., 2011]. Интерлеикин 1 участвует в формировании местной воспалительной реакции, острофазного ответа при инфекционном поражении. Индуцирует синтез IL -2, IL -4, осуществляет стимуляцию продукции ИЛ-6, фактора некроза опухоли.
Рецепторы для IL-1 имеются практически на всех типах кроветворных клеток, включая ранние предшественники, что обеспечивает широкий спектр гемопоэтических эффектов данного цитокина. Установлено, что IL-1 способствует вступлению в S-фазу ранних гемопоэтических предшественников и дозозависимым образом повышает КОЕ-с в культуре костного мозга. Оказывая ростостимулирующее действие на В-клетки, активирует АРС и CD4 лимфоциты. Кроме того, этот интерлеикин стимулирует миелопоэз и ранние этапы эритропоэза [Hutyrova В. et al., 2002; Hefler L.A. et al., 2002]. Netea, M. G. et al. (2011) продемонстрировал центральную роль IL-1 в гемопоэзе, рассматривая его как ростовой фактор, непосредственно воздействующий на мультипотентную стволовую клетку.
Наряду со стимулирующими гемопоэтическими эффектами, IL-1 может оказывать и ингибирующие действие. Данный цитокин способен угнетать поздние стадии эритропоэза, снижая до 60% продукцию ЕПО в культуре клеток [Fandrey J. et al., 2005]. По этой причине, некоторые авторы относят IL-1 к категории негативных регуляторов гемопоэза [Орловская И.А. и др., 2006]. Считается также, что IL-1 способен индуцировать апоптоз [Бойчук СВ. и др., 2001]. Однако множество положительных гемопоэтических эффектов, а также то обстоятельство, что IL-1 поддерживает пролиферацию стволовых кроветворных клеток, оказывает стимулирующее действие на остеобласты, способствуя кроветворению на самых ранних этапах, а также известен как химико- и радио-протективный цитокин, препараты которого используются для восстановления гемопоэза [Rozhdestvenskn L. М. et al., 2002], позволяет отнести IL-1 к позитивным гемопоэтическим факторам.
Ген IL-1A содержит 7 экзонов и 6 интронов [Song J.S. et al., 2008]. Ген IL-1 В содержит 22 экзона, 20 из которых альтернативные (т. е. имеют структурные варианты) и 9 интронов, из которых альтернативных 8. Оба гена имеют нетранслируемые области на 3 и 5 концах. Более того, для них характерна высокая степень гомологии интронных последовательностей, что, как предполагается, играет важную регуляторную роль в экспрессии этих генов. Так, например, интрон 5 содержит последовательность, "чувствительную" к действию глюкокортикоидов, которые являются одними из самых мощных ингибиторов транскрипции IL-1. С другой стороны, в регуляторыой области гена IL-1B содержится последовательность ТАТА-Ьох, характерная для многих индуцибельных белков. Однако ее нет у гена ILIA [Имангулова М.М. и др., 2005, Netea, М. G. et al., 2011]. Показано, что аллель Т гена IL-1A, несущий точечную замену в области промотора в позиции (-889), ассоциируется с повышенной продукцией этого цитокина [Trevilatto Р.С. et al, 2003, Netea, М. G. et al, 2011].
Молекулярно-генетические методы
Исследование генетических основ формирования и течения В-клеточного хронического лимфолейкоза является актуальной проблемой для современных отечественных [Клинков А.А. и др., 2004; Гра О.А. и др., 2008; Бакиров Б.А. и др., 2005, 2010; Овсепян В.А. и др., 2010] и зарубежных [Thunberg U., 2002; Hjalmar V. et al., 2002; Stevenson F.K., et al., 2004; Nuckel H. et al., 2004a; Ana M. Peiro et al., 2008, и др.] ученых, вплотную занимающихся данным вопросом. Основной концепцией молекулярной генетики заболеваний является представление об ассоциации полиморфного маркера гена с предрасположенностью или устойчивостью к развитию патологии. Более высокая достоверная частота маркера у больных по сравнению со здоровыми указывает на повышенный риск (предрасположенность) возникновения данного заболевания, а более низкая частота - на пониженный риск развития патологии (устойчивость) [Баранов B.C. и др., 2000; Иващенко Т.Э. и др., 2001; Гинтер Е.К., 2003].
Следует отметить, что подавляющее число молекулярно-генетических работ, посвященных изучению роли генетических факторов В-ХЛЛ проводится зарубежными учеными.
Rameshwar Р. и др. (2002) показали, что SNP С 1513А гена Р2Х7 связан с полным выживанием пациетов с ХЛЛ. В частности пациенты, несущие аллель 1513С характеризовались значительно более длительным полным выживанием по сравнению с гомозиготами по аллелю 1513А.
Saxena А. и др. (2002) сообщили об ассоциации полиморфизма (-248) G/A в 5 -UTR гена ВАХ с развитием хронического лимфолейкоза.
Sellick G.S. и соавт. (2004) рассмотрели полиморфизм А1513С гена Р2Х7, предположив, что Р2Х7 рецептор плазматической мембраны АТФ-закрытого ионного канала, который играет роль в апоптозе лимфоцитов, может принимать участие в развитии хронического лимфолейкоза. Была произведена оценка значения Р2Х7-А1513С полиморфизма в формировании ХЛЛ методом ПЦР. Анализ 424 пациентов, больных ХЛЛ (106 семейных случаев) и 428 здоровых индивидуумов показал, что частоты аллелей были одинаковыми в обеих группах независимо от того, были ли случаи семейные или спорадические (частота аллеля С была 0,17 и 0,17, соответственно). Отношение шансов для аллеля С составило 1,03 (0,80-1,31). Результаты данного исследования не дают никаких доказательств связи между полиморфизмом А1513С гена Р2Х7 и риском формирования ХЛЛ (OR = 0,99, (0,74-1,32)).
Niickel Н. и соавт. (2004) рассмотрели влияние полиморфного маркера 1513А/С Р2Х7 на формирование ХЛЛ в неблагоприятной CD38 подгруппе и не нашли значимого эффекта полиморфизма 1513А/С Р2Х7. Исследованием показано, что эффекты полиморфизма Р2Х7 проявляются только в группе пациентов с более агрессивной формой хронического лимфолейкоза.
В другой работе Niickel Н. и Frey Н. (2004а) была показана связь генетических полиморфизмов MTHFR (677С Т и 1298А С) с риском развития хронического лимфолейкоза. Кроме того авторы измерили потенциальные эффекты генотипов в апоптозе клеток при хроническом лимфолейкозе. Распределение частот аллелей и генотипов по обоим полиморфизмам среди больных и контроля не отличалось. В то время как выживаемость больных, имеющих генетические маркеры 677СС MTHFR (Р=0.043) и 1298 СС MTHFR (Р=0.019) была лучше. При многомерном анализе показано, что гаплотип 677СС и 1298СС MTHFR является независимым прогностическим фактором для оценки выживаемости больных ХЛЛ. В результате проведенных исследований авторы заключили, что в то время как полиморфизмы MTHFR не влияют на риск развития хронического лимфолейкоза, они могут быть независимыми маркерами, которые ассоциированы с выживаемостью пациентов на ранних стадиях заболевания.
Riemann К. и соавт. (2006) изучили роль полиморфизма -94ins/delATTG гена NFKB1, который имеет большое значение в регуляции генов, участвующих в апоптозе и пролиферации, иммунных и воспалительных реакциях, в патогенезе хронического лимфолейкоза. Была исследована ДНК 72 больных ХЛЛ и 307 человек популяционного контроля методом пиросеквенирования. Статистически значимых различий в распределении молекулярно-генетических маркеров среди больных и здоровых индивидуумов не выявлено.
Sellick G.S. и соавт. (2006) исследовали ассоциации вариантов гена ARLTS1 с формированием хронического лимфолейкоза. Ими рассмотрено шесть полиморфизмов вышеуказанного гена - W149X, S99S, P131L, L132L, 148R и Е164К. Было проанализировано ДНК 413 больных ХЛЛ и 471 здоровых людей. В результате проведенного исследования ни один из изученных полиморфизмов не был связан с риском формирования ХЛЛ.
Jamroziak К. и соавт. (2006) оценили значение полиморфизма С3435Т в 26 экзоне гена MDR1 (АВСВ1), кодирующего транспортер ксенобиотиков, в формировании предрасположенности к хроническому лимфолейкозу. В этом исследовании был проведен анализ ПО пациентов, больных В-ХЛЛ и 201 человек контрольной группы методом ПЦР. Авторами выявлена высокая частота носителей аллеля 3435Т (генотипы 3435СТ и 3435ТТ) в группе больных В-ХЛЛ по сравнению с контролем (76% против 63%, р=0,027). Генотипы 3435СТ и 3435ТТ определяли повышенный риск формирования хронического лимфолейкоза (OR = 1,8, 95%С1 1,1-3,0). Наряду с этим установлено, что P-GP активность в клетках В-ХЛЛ зависит от генотипов MDR1.
Генетико-статистические методы
Таким образом, в результате исследования выявлены аллели и генотипы изучаемых генов интерлейкинов, которые могут служить маркерами определенных групп риска и стадий заболевания. Так, факторами риска развития 0-1 стадии ХЛЛ следует считать аллель -590Т IL-4 (OR=2,46) и генотип -590ТТ IL-4 (OR=6,65). Факторами риска развития II стадии заболевания являются аллели -889Т IL-1A (OR=l,51), -703Т IL-5 (OR=l,52) и генотип -590ТТ IL-4 (OR=5,57). Маркером развития III-IV стадии хронического лимфолейкоза можно считать аллель -703Т гена IL-5 (OR=l,95). Следует отметить, что низкая группа риска маркируется -590Т IL-4 (OR=2,49) и -590ТТ IL-4 (OR=6,22), а промежуточная группа риска -генотипом -590ТТ гена IL-4 (OR=5,47) и аллелем -703Т гена IL-5 (OR=l,47).
Итак, резюмируя, полученные результаты, можно заключить, что генетические полиморфизмы -889С/Т IL-1A, -590С/Т IL-4 и -703С/Т IL-5 имеют важное этиопатогенетическое значение при определении групп риска и стадий заболевания по классификации К. Rai у больных хроническим лимфолейкозом.
На следующем этапе нашей работы проведено изучение ассоциаций исследуемых молекулярно-генетических маркеров с наличием осложнений ХЛЛ в дебюте заболевания и на момент обследования.
Выборка больных с известным дебютом заболевания составила 201 человек. Установлено, что среди 201 больных различные осложнения при возникновении заболевания были зарегистрированы у 51 пациентов (25,36%), в том числе цитопенические осложнения (анемия, тромбоцитопения) наблюдались у 29 больных (14,42%), септические осложнения - у 7 пациентов (3,48%о) и сочетание осложнений было выявлено у 15 индивидуумов (7,46%о). Среди цитопенических осложнений анемии встречались у 6,96% больных, а тромбоцитопения - у 7,46%о пациентов.
При изучении распределения полиморфных генетических маркеров интерлейкинов среди больных ХЛЛ в зависимости от наличия осложнений в дебюте заболевания, а также в контрольной группе выявлены статистически достоверные различия в частотах генотипов и аллелей по локусу -703С/Т IL-5. Так, установлена набольшая концентрация аллеля -703Т IL-5 (37,25%) среди больных ХЛЛ, имеющих осложнения в дебюте заболевания в сравнении как с популяционным контролем (26,41%, х2=4,56, р=0,03, OR=T,65, 95%С1 1,04-2,62), так и с пациентами без осложнений в дебюте заболевания (29,14%, /2=1,92, р=0,16,) (рис. 20).
Частота аллеля -703Т IL-5 среди больных ХЛЛ в зависимости от наличия осложнений в дебюте заболевания и в контрольной группе, % Наряду с этим выявлена низкая концентрация генотипа -703СС IL-5 (35,29%) (рис. 21) в группе больных ХЛЛ, имеющих осложнения в дебюте заболевания в сравнении как с контрольной группой (54,48%, %2=5,68, р=0,01, pcor=0,03, OR=0,45, 95%С1 0,23-0,87), так и с группой пациентов без осложнений в дебюте заболевания (50,35%, %2=2,82, р=0,09). контрольная группа больные ХЛЛ бе 5 больные ХЛЛ с осложнений осложнениями
Далее нами проведено изучение взаимосвязей генетических полиморфизмов интерлейкинов с наличием осложнений у больных ХЛЛ на момент обследования.
Детальное изучение частот аллелей и генотипов генов интерлейкинов среди пациентов с различными цитопеническими осложнениями на момент обследования (тромбоцитопения и анемия) показало, что пациенты с развившейся тромбоцитопенией на момент обследования отличаются максимальной концентрацией молекулярно-генетических маркеров -889Т ILIA (36,54%) (рис. 23) и -889ТТ IL-1A (19,24%) (рис. 24), что статистически достоверно превышает показатели контрольной группы (22,77%, 2-4,26, р=0,03, OR=l,95, 95%С1 1,03-3,67; и 3,63%, х2=9,44, р=0,003, рсог=0,009 OR=6,32, 95%С1 1,72-22,28, соответственно). цитопенических осложнений на момент обследования и в контрольной группе, %
Частота генотипа -889ТТ IL-1A среди больных ХЛЛ в зависимости от наличия цитопенических осложнений на момент обследования и в контрольной группе, % Аналогичной направленности данные получены и при изучении распределения аллеля IL-lRa l у пациентов с развившейся тромбоцитопенией на момент обследования (84,62%) по сравнению как с контролем (70,31%, х2=4,11, р=0,04, OR=2,32, 95%С1 1,02-5,46) так и с группой больных с анемией (67,86%, у2=2,13, р=0,14) (рис.25).
Обнаружены различия в распределении аллелей по локусу VNTR IL-lRa среди больных с септическими осложнениями на момент обследования и контрольной группой (рис. 26). У пациентов с септическими осложнениями концентрация аллеля IL-lRa 4 имеет максимальный уровень и равна 20,00%, что статистически значимо выше, чем в контрольной группе (2,78%, х2=4,86, р=0,02, OR=8,75 95%С1 1,17-15,53) и в группе больных с различными цитопеническими осложнениями (1,25%, х2=4,75, р=0,02, OR=9,75 95%С1 1,18-21,71). коні рольная группа
Итак, в результате проведенного исследования выявлены генетические полиморфизмы интерлейкинов, ассоциированные с развитием осложнений в дебюте хронического лимфолейкоза - это -703С/Т IL-5 и -590С/Т IL-4. Наряду с этим, выявлена важная роль молекулярно-генетических маркеров -889С/Т IL-1A и VNTR IL-IRa в развитии осложнений хронического лимфолейкоза в течении заболевания.
На следующем этапе нашей работы мы изучили взаимосвязи рассматриваемых генетических полиморфизмов интерлейкинов с такими клинически значимыми качественными признаками ХЛЛ как симптомы интоксикации. К группе данных симптомов (В-симптомы), согласно литературным данным [Воробьев А. И., 2002], относятся слабость, потливость, а также снижение массы тела.
Результаты сравнительного анализа частот аллелей и генотипов полиморфных локусов интерлейкинов среди больных ХЛЛ в зависимости от наличия или отсутствия симптомов интоксикации и в контроле представлены в таблице 8.
Анализ различий в генетических характеристиках между больными хроническим лимфолейкозом с наличием или отсутствием токсических симптомов в дебюте заболевания и контрольной группой выявил более высокую частоту генотипа -889ТТ IL-1A (в 2,2 раза) у больных без токсических симптомов (17,25%) в сравнении с контрольной группой (3,63%, Х2=7,92, р=0,005, pcor=0,015, OR=5,53, 95%С1 1,52-19,22). Наряду с этим выявлена более высокая концентрация аллеля -590Т IL-4 (27,01%) и генотипа -590ТТ IL-4 (20,08%) у пациентов с наличием токсических симптомов в сравнении с контрольной группой (18,24%, 2-9,63, р=0,002, OR=l,65, 95%С1 1,19-2,29, и 2,61%, 5(2=15,92, р=0,0006, pcor=0,0018, OR=5,13, 95%С1 2,09-12,93, соответственно).
Таким образом, в результате исследования выявлены молекулярно-генетические маркеры интерлейкинов, которые ассоциированы с развитием цитопенических осложнений (анемия, тромбоцитопения), септических осложнений (лихорадка), токсических симптомов при манифестации и в течении хронического лимфолейкоза. Так, фактором риска возникновения осложнений ХЛЛ в дебюте заболевания является -703Т IL-5 (OR=l,65), а протективными факторами являются маркеры -703С IL-5(OR=0,60) и -703СС IL-5 (OR=0,69). Отсутствие осложнений в дебюте хронического лимфолейкоза связано с маркером -590ТТ IL-4 (OR=2,61). Факторами риска возникновения тромбоцитопении являются -889Т IL-1A (OR=l,95), -889ТТ IL-1A (OR=6,32) и IL-lRa l(OR=2,32), а развитие септических осложнений связано с IL-lRa 4(OR=8,75). Фактором риска появления симптомов интоксикации в дебюте ХЛЛ, следует считать аллель-590Т IL-4 (OR= 1,65) и генотип - 590ТТ IL-4 (OR=5,13), а фактором риска отсутствия токсических симптомов при возникновении ХЛЛ является маркер -889ТТ IL-1A (OR=5,53).
Исследование связей генетических полиморфизмов интерлейкинов с качественными патогенетически значимыми для хронического лимфолейкоза признаками
Сшивка CD23-рецепторов человеческих моноцитов соответствующим лигандом индуцирует одновременно усиленную продукцию нитроксидных радикалов и IL-10, который ингибирует активность iNOS и продукцию нитроксидных радикалов. Нитроксидные радикалы и IL-10 в свою очередь обладают антимикробной и противоопухолевой активностью [Тотолян А.А. и др., 2000], что может иметь важное значение в этиопатогенезе хронического лимфолейкоза. Согласно литературным данным, среди индивидуумов с повышенным уровнем продукции цитокина преобладает генотип СС промоторного региона -590С/Т гена IL-4 [Чайковский А.В., и др., 2009]. Таким образом, полученные нами данные демонстрируют важное значение генетических детерминант в формировании ХЛЛ.
Установлено, что ассоциированные с хроническим лимфолейкозом генетические маркеры -889С/Т IL-1A, VNTR IL-IRa, -590С/Т IL-4, -703С/Т IL-5 оказывают плейотропное влияние на формирование ряда патогенетически важных для ХЛЛ показателей.
Так, VNTR полиморфизм гена антагониста рецептора интерлейкина 1 ассоциирован с особенностями клинического проявления хронического лимфолейкоза при его течении (наличие тромбоцитопении и септических осложнений). Вопрос о функциональной значимости данного полиморфизма остается открытым. Предполагается, что увеличение числа повторов ведет к повышению транскрипционной активности IL-IRa. Однако большинство исследований показало, что макрофаги, стимулированные гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (GM-CSF) in vitro, продуцируют избыточное количество рецепторного антагониста IL-IRa и сниженное количество IL-1B, если являются носителями аллеля IL-IRa 2, и наоборот, недостаточное количество рецепторного антагониста IL-IRa и повышенное количество IL-1B, если являются носителями аллеля IL-IRa 1 и аллеля IL-lRa 4 [Hurme М. et al., 1998, Syrjanen J. et al., 2002; Имангулова M.M. и др., 2005]. Недавно проведенные исследования показали, что in vivo баланс между IL -1 и IL -1 Ra играет важную роль в защите организма от инфекции и ограничении дальнейшего повреждения пораженных тканей. Для инфекционных заболеваний максимальное повышение уровня IL -1 Ra наблюдается при сепсисе. При этом повышенные концентрации IL -1 Ra коррелируют с благоприятным прогнозом. Недостаточная продукция IL -1 Ra значительно ухудшает тяжесть поражения тканей при болезни Лайма, туберкулезе, саркоидозе [Santtila S. et al., 1998; Conti F. et al., 2000, Zhang W. et al., 2005]. Этот факт объясняет установленные нами ассоциации: наличие тромбоцитопении ассоциировано с аллелем IL-lRa l, наличие септических осложнений - с аллелем IL-lRa 4 гена IL-lRa.
Полиморфизм -889С/Т IL-1A связан с формированием II стадии ХЛЛ и наличием тромбоцитопении в течении заболевания. Поскольку исследованный полиморфизм лежит в кодирующей последовательности гена, он может затрагивать уровень белковой экспрессии. Из работы Hutyrova (2002) следует, что у здоровых индивидуумов, гомозиготных по аллелю -889Т IL-1A, плазменные уровни IL-1A увеличены по сравнению с носителями других генотипов. При этом согласно литературным данным, интерлейкин 1А, способен активно ингибировать последовательность экспрессии на клетках антигенов гистосовместимости II класса, причем способностью продуцировать IL-1A обладает ряд опухолевых клеток, в связи с чем полагают, что продукция IL-1A может способствовать пролиферации последних, что может приводить (при повышенной продукции IL-1A) к нарушению реализации противоопухолевого ответа, и обуславливать в конечном итоге более тяжелое течение заболевания [Кадагидзе З.Г., 2003].
Полиморфный маркер -590Т IL-4 оказывает плейотропное влияние на формирование токсических симптомов в течении заболевания, развитие 0-1 и II стадий ХЛЛ и, как следствие, детерминирует низкую и промежуточную группы риска по классификации К. Rai. Известно, что полиморфизм -590С/Т в промоторном регионе гена IL-4 определяет уровень продукции IL-4, промотор с заменой -590Т является более активным, менее прочно связывается с транскрипционными факторами, а генетический вариант -590С IL-4 чаще подвергается транскрипции, то есть является высокопродуктивным [Чайковский А.В., и др., 2009]. IL-4 относится к группе противовоспалительных цитокинов, оказывает действие на регуляцию образования других цитокинов посредством участия в многочисленных биологических процессах, таких как иммунный ответ и воспалительные реакции [Шабалдин А.В. и др., 2005]. Установлено, что клетки большинства опухолей человека продуцируют IL-4 и его рецепторы, которые отличаются высокой афинностью. Связывание IL-4 с соответствующим рецептором активирует лимфокин-активированные клетки (ЛАК), которые подавляют рост опухоли [Кадагидзе З.Г., 2003]. Наряду с этим известна способность IL -4 участвовать в механизмах защиты клеток от апоптоза. Полагают, что это может быть прямое антипролиферативное действие, обусловленное блокадой клеточного цикла, или обусловлено его способностью снижать экспрессию некоторых цитокинов [Liu Н.М. et al., 2005; Бойчук СВ. и др., 2001] и, следовательно, IL -4 имеет важное значение в патогенезе хронического лимфолейкоза.
Аллель -703Т IL-5 ассоциирован с формированием II и III-IV стадий заболевания и промежуточной группой риска ХЛЛ, а также с наличием осложнений в дебюте заболевания. IL-5 усиливает пролиферацию активированных В-лимфоцитов, индуцирует синтез белков острой фазы, в связи с чем может быть отнесен к цитокинам воспаления. IL-5 индуцирует переключение синтеза иммуноглобулинов на класс IgA и способствует секреции IgA и IgM В-клетками. Наблюдалось также опосредованное IL-5 увеличение синтеза IgE и экспрессирование молекул IgE-рецептора CD23 с низким сродством [Diraimondo, F. et al., 2002; Огородова Л.М. и др., 2003; Коненков В.И. и др., 2006а].
