Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11-31
1.1. Молекулярные основы этиопатогенеза гиперпластических процессов эндометрия .11-18
1.2. Медико-биологические характеристики цитокинов18-26
1.3. Генетические исследования гиперпластических процессов эндометрия26-31
Глава 2. Материалы и методы исследования .32-41
2.1.Общая характеристика обследованных групп .32-35
2.2. Молекулярно-генетические методы. 36-39
2.3. Биометрические и генетико-статистические методы 40-41
Глава 3. Изучение ассоциаций генетических полиморфизмов цитокинов с формированием гиперпластических процессов эндометрия42-117
3.1. Популяционно-генетический анализ молекулярно-генетических маркеров .42-49
3.2. Генетические факторы развития гиперплазии эндометрия и полипов эндометрия 49-64
3.3. Исследование роли полиморфных генетических маркеров в развитии гиперпластических процессов эндометрия, сочетающихся с миомой матки и аденомиозом 64-73
3.4. Исследование роли наследственной отягощенности в характере связей молекулярно-генетических маркеров с возникновением гиперпластических процессов эндометрия.. 74-97
3.5. Анализ распределения полиморфных маркеров генов цитокинов у женщин с гиперпластическими процессами эндометрия разных возрастных групп 97-107
3.6. Анализ распределения молекулярно-генетических маркеров среди женщин с гиперпластическими процессами эндометрия в зависимости от значения индекса массы тела .108-116
Обсуждение .117-135
Выводы 136-137
Список литературы 138-170
- Медико-биологические характеристики цитокинов
- Генетические исследования гиперпластических процессов эндометрия
- Молекулярно-генетические методы
- Генетические факторы развития гиперплазии эндометрия и полипов эндометрия
Введение к работе
Актуальность проблемы. Гиперпластические процессы эндометрия (ГПЭ) представляют собой патологическую диффузную или очаговую пролиферацию железистого и стромального компонентов слизистой оболочки матки с преимущественным поражением железистых структур [Киселев В.И. и др., 2011]. Среди всех гинекологических заболеваний на долю гиперпластических процессов эндометрия приходится 15 - 50% [Lacey J.V. et al., 2010; Giuntoli R.L. et al., 2012; Truskinovsky A.M. et al., 2014; Бреусенко В.Г. и др., 2009; Прилепская В.Н. и др., 2009; Ткаченко Л. В. и др., 2011; Шешукова Н.А. и др., 2011]. В последние годы отмечен рост патологии эндометрия среди женщин всех возрастных групп [Juhi S. et al., 2013; et al., 2013; Acmaz G. et al., 2014; Клещев М.А. и др., 2010; Антоненко В.С., 2011; Мартиросян К.А. и др., 2011]. Причем до 40% женщин молодого возраста с гиперпластическими процессами эндометрия подвергаются хирургическому лечению, что зачастую приводит к потере репродуктивной функции [Munro M.G. et al., 2011; Trimble C.L. et al., 2012; Goncharenko V.M. et al., 2013; Киселев В.И.и др., 2011]. Гиперплазия эндометрия в 20-25% случаев является основой для формирования злокачественных опухолей эндометрия [Pennant S. et al., 2008; Daya D., 2014; Давыдов А.И. и др., 2009; Кулаков В.И. и др., 2009; Доброхотова Ю.Э. и др., 2011; Запорожан В.Н. и др., 2012].
Согласно данным литературы, ведущее значение в этиопатогенезе
гиперпластических процессов эндометрия отводится избыточной
эстрогенной стимуляции, сочетающейся с недостаточностью прогестерона [Peng X. et al., 2009; Takreem A, et al., 2009; Свиридова Н.И., 2009; Татарчук Т.Ф. и др., 2011; Сидорова И.С. и др., 2011], гормон-независимой пролиферации [Киселев В.И. и др., 2011], воспалению [Wang T. et al., 2011; Стрижаков А.Н. и др., 2011], сниженному апоптозу [Chandra V. et al., 2011; Чернуха Г.Е. и др., 2013; Слукина Т.В. и др., 2008], патологическому неоангиогенезу [Hvingel B. et al., 2012; Шешукова Н.А. и др., 2012], а также нарушениям иммунного статуса в эндометрии [Witkiewicz A.K. et al., 2010; Задонская Ю.Н., 2009; Шешукова Н.А. и др., 2012]. Ключевыми звеньями реализации каскада данных механизмов являются процессы взаимодействия широкого спектра цитокинов: факторов некроза опухолей, хемокинов, интерферонов, факторов роста и др. [Wang C. et al., 2011; Eritja N. et al., 2013; Лысенко О.В. и др., 2011; Коваленко Е.П. и др., 2011]. Эти цитокины, обладая рядом медико-биологических эффектов (регуляция иммунного ответа, участие в воспалительных реакциях, контроль апоптоза, пролиферации и ангиогенеза), могут быть вовлечены в этиопатогенез гиперпластических процессов эндометрия [Kusakabe K. et al., 2009; Dobrzycka B. et al., 2011; Xuebing P. et al., 2011; Колесникова Н. В. и др., 2010; Коваленко Е.П. и др., 2012].
В настоящее время известно, что полиморфизмы ряда генов имеют важное значение в развитии гиперпластических процессов эндометрия [Abdel Aziz A.F. et al, 2009; Ashton K. A. et al, 2009; Пушкарев В.А. и др., 2009; Кипич Н.В. и др., 2012; Азарова А.З., 2012]. При этом, следует отметить, что большинство работ, по изучению генетических механизмов формирования гиперплазии эндометрия проведено за рубежом [Aban M. et al, 2006; Esinler I. et al, 2006; Fang F. et al, 2010; Okuda T. et al, 2010; Sergentanis T.N. et al, 2011; Jiang D.K. et al., 2011; O'Hara A.J. et al., 2012]. Клинико-генетические исследования, которые посвящены молекулярно-генетическим аспектам гиперплазии эндометрия, в России немногочислены и затрагивают в основном гены интегринов [Серегина А.Е., 2009], каталитической субъединицы теломеразы [Адамян Л.В. и др., 2009], факторов роста и пролиферации [Чернуха Г.Е. и др., 2013], ферментов метаболизма эстрогенов [Клочкова Н.Е. и др., 2009; Харенкова Е.Л. и др., 2009; Артымук Н.В.и др., 2009]. Вовлеченность генетических полиморфизмов цитокинов в этиопатогенез гиперпластических процессов эндометрия среди населения России изучена крайне слабо.
Работа выполнена в рамках государственного задания Министерства образования и науки РФ «Изучение генетических факторов риска развития мультифакториальных заболеваний человека» (№ 511/2014).
Цель: Изучить роль полиморфных вариантов генов цитокинов в формировании гиперпластических процессов эндометрия у населения Центрального Черноземья России.
Задачи:
-
Провести анализ распределения генетических вариантов цитокинов (-308 G/A TNFa, +252 A/G Lta, +36 A/G TNFR1, +1663G/A TNFR2, -403A/G RANTES, A/G I-TAC (rs4512021), +1931A/T MIPlp, C/G MCP1 (rs2857657), -801G/A SDF1) среди больных гиперпластическими процессами эндометрия и в контрольной группе.
-
Изучить вовлеченность генов-кандидатов и их сочетаний в формирование гиперпластических процессов эндометрия.
-
Рассмотреть вклад генетических факторов в подверженность к развитию гиперплазии эндометрия и полипов эндометрия.
-
Выявить связи генетических полиморфизмов с формированием гиперпластических процессов эндометрия, сочетающихся с миомой матки и аденомиозом.
-
Проанализировать роль наследственной отягощенности в характере связей молекулярно-генетических маркеров с возникновением гиперпластических процессов эндометрия.
Научная новизна.
Впервые установлены ассоциации генетических полиморфизмов -308 G/A TNFa, +252 A/G Lta, +36 A/G TNFR1, +1663G/A TNFR2, A/G FTAC (rs4512021), C/G MCP1 (rs2857657), +193ЧА/Т МІРІp, -801G/A SDF1 и их
комбинаций с формированием гиперпластических процессов эндометрия у населения Центрального Черноземья России.
Выявлены различия в вовлеченности генов-кандидатов в развитие
гиперпластических процессов эндометрия в зависимости от их сочетания с
другими гиперпластическими процессами матки (миома матки,
аденомиоз). Определены отличия в характере ассоциаций генетических вариантов цитокинов с формированием гиперплазии эндометрия и полипов эндометрия. Показаны особенности вклада генетических полиморфизмов цитокинов в подверженность к гиперпластическим процессам эндометрия в зависимости от отягощенного семейного анамнеза.
По результатам работы получен патент на изобретение № 2468367 от 27.11.2012 «Способ прогнозирования риска развития гиперплазии эндометрия у женщин с генитальным эндометриозом».
Научно-практическое значение. Результаты проведенного
исследования вносят вклад в развитие представлений о молекулярно-
генетических основах формирования гиперпластических процессов
эндометрия. Полученные данные могут быть использованы в
предиктивной медицине для формирования среди женщин групп
повышенного риска развития гиперпластических процессов эндометрия.
Результаты работы используются в учебном процессе в ФГАОУ ВПО
«Белгородский государственный национальный исследовательский
университет» и в практической деятельности врачей женской консультации МБУЗ «Городская поликлиника №2» г. Белгорода и перинатального центра Белгородской областной клинической больницы Святителя Иоасафа.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и
обсуждены на: III Международной конференции молодых ученых
«Современные вопросы акушерства и гинекологии» (Москва, 2009), V
Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009),
Всероссийской школе-семинаре «Нанобиотехнологии: проблемы и
перспективы» (Белгород, 2009), Всероссийской конференции с элементами
научной школы для молодежи «Репродуктология: новые технологии,
проблемы перспективы» (Белгород, 2010), II Всероссийской научно-
практической конференции с международным участием «Медико-
биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2011),
VI Международной (XV Всероссийской) Пироговской научной
медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2011), V
Международной конференции молодых ученых «Современные вопросы
акушерства, гинекологии и перинатологии» (Москва, 2011), XIV
Всероссийской медико-биологическая конференция молодых
исследователей (с международным участием): Фундаментальная наука и клиническая медицина – человек и его здоровье (Санкт-Петербург, 2011),
VII Международной (XVI Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2012), 4th's International Symposium on Сlinical and Applied Anatomy (Ankara, 2012), VI конгрессе патофизиологов Украины «От экспериментальных исследований к клинической патофизиологии» (Мисхор, 2012), V Международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения-2012» (Белгород, 2012), III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012), 77-й Российской научной конференции студентов и молодых ученых, посвященной 80-летию БГМУ (Уфа, 2012), VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых (Москва, 2013), VI Международной конференции молодых ученых «Современные вопросы акушерства, гинекологии и перинатологии» (Москва, 2013), XII Congress of the European Association of Сlinical Anatomy (Lisbon, 2013), VI Межрегиональной научно-практической конференции с международным участием для врачей акушеров-гинекологов «Здоровье женщины -здоровье нации» (Белгород, 2013), Международной конференции «Актуальные вопросы акушерства и гинекологии» (Харьков, 2013).
Личный вклад автора. Автор принимал участие в выполнении всех подготовительных и основных этапов работы, включая анализ и обобщение сведений литературы по изучаемой проблеме, постановку цели и задач исследования, разработку методических подходов для их решения, выполнение молекулярно-генетического исследования, обработку, анализ и обобщение полученных результатов. Автор принимал личное участие в апробации полученных результатов исследования. Соискателем самостоятельно проведена подготовка основных публикаций по выполненной работе, написана и оформлена рукопись.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 печатных работ, в том числе 5 в журналах из списка ВАК. Получен патент на изобретение.
Положения, выносимые на защиту:
-
Генетические полиморфизмы -308 G/A TNFa, +252 A/G Lta, +36 A/G TNFR1, A/G I-TAC (rs4512021), +1931A/T MPip, C/G MCP1 (rs2857657), -801 G/A SDF1 ассоциированы с развитием гиперпластических процессов эндометрия у населения Центрального Черноземья России.
-
Связи молекулярно-генетических маркеров с формированием гиперплазии эндометрия и полипов эндометрия различны.
-
Сочетания генетических вариантов рецепторов факторов некроза опухолей и хемокинов вовлечены в подверженность к возникновению гиперпластических процессов эндометрия без миомы матки и/или аденомиоза.
4. Характер ассоциаций генов-кандидатов цитокинов с
формированием гиперпластических процессов эндометрия в группах женщин в зависимости от наличия наследственной отягощенности различается.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа включает в себя следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и их обсуждение, а также выводы, список литературы и приложения.
Медико-биологические характеристики цитокинов
Цитокины – это продуцируемые клетками белково-пептидные факторы, осуществляющие короткодистантную регуляцию межклеточных и межсистемных взаимодействий. Их рассматривают как гормоноподобные молекулы, действие которых на клетки-мишени опосредуется высокоспецифичными мембранными рецепторами [Симбирцев А.С., 2005; Новиков Д.К. и др., 2006]. Рецепторы цитокинов представляют собой трансмембранные гликопротеины, состоящие, как правило, из нескольких субъединиц. После взаимодействия цитокинов с комплементарными рецепторами на поверхности клеток, сигнал через элементы внутриклеточной трансдукции передается в ядро, где активируются соответствующие гены [Кнорринг Г.Ю., 2005]. В свою очередь, белки (продукты активированных цитокинами генов) продуцируются клетками и регулируют рост, дифференцировку, функциональную активацию и апоптоз клеток. В настоящее время наиболее изученной группой регуляторных факторов являются цитокины иммунной системы, которые обладают рядом общих свойств [Фрейдлин И.С, 2001]: 1) синтезируются в процессе реализации механизмов естественного или специфического иммунитета; 2) проявляют свою активность при низких концентрациях; 3) являются медиаторами иммунной и воспалительной реакций; 4) образуют регуляторную сеть; 5) обладают плейотропной активностью. К цитокинам иммунной системы относят суперсемейство факторов некроза опухолей (TNF). Яркими представителями этой группы являются TNFa (кахексин) и TNFp (лимфотоксин - Ltd). TNFa и Lta представляют собой два близких белка (гомологичны около 30% аминокислотных остатков) с молекулярной массой около 17 kDа. TNFa является продуктом моноцитов/макрофагов, эндотелиальных, миелоидных и тучных клеток, клеток нейроглии, в особых случаях - активированных Т-лимфоцитов [Hollegaard M.V., et al, 2008], которые являются основными продуцентами Lta. А Lta образуется при воздействии на Т-клетки антигенов и митогенов значительно позже, чем TNFa [Лысенко О.В., 2008]. Гены TNFa и Lta локализованы на 6-й хромосоме (6р21.3) [Nedwin G.E. et al, 1985].
Выделяют следующие биологические эффекты при действии факторов некроза опухолей: 1) цитотоксическое действие, направленное на клетки опухоли или клетки, пораженные вирусами; 2) иммуномодулирующее и противовоспалительное (вызывается активацией макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и эндотелиальных клеток); 3) метаболические влияния через стимулирование катаболических процессов [Пальцев М.А. и др.,2003]; 4) супрессивное действие на эритро, миело- и лимфопоэз; 5) экспрессивное действие на гены, контролирующие клеточный цикл [Осташкин А.С. и др.,2008]. Факторы некроза опухолей реализуют свои эффекты при взаимодействии с определенными рецепторами [Elkind M.S., et al, 2002]. Выделяют два основных типа рецепторов факторов некроза опухолей – 1 типа (ТNFR1 или ТNF-R, TNFAR, TNFR60, TNF-R-I, CD120a, p55) и 2 типа (TNFR2 или TNFBR, TNFR80, TNF-R75, TNF-R-II, p75, CD120b) [Чухриенко Н.Д., 2005]. TNFR1 является белком с молекулярным весом 55 kDа, ген ТNFR1 у человека расположен на хромосоме 12 (12р13.2) [Cаrоll M.C. et al., 1987]. TNFR1 экспрессируется клетками большинства типов тканей, что объясняет плейотропность действия TNF. TNFR2 – белок с молекулярным весом 75 kDa, его ген локализован на хромосоме 1 (1р36.22). Внеклеточные части обоих рецепторов содержат четыре высококонсервативных цистеин-домена, внутриклеточные аминокислотные последовательности этих рецепторов совершенно различны и лишены какой-либо ферментативной активности. Характерной особенностью TNFR1 (47.5 kDa) является наличие на С-конце так называемого «домена гибели» (death domain (DD)), вовлеченного в TNF опосредованный апоптоз [Elmore S., 2007; Kavurma M. et al., 2008]. ТNFR2, в отличие от ТNFR1, не содержит «доменов смерти» и, поэтому, он осуществляет регуляцию экспрессии генов, ответственных за дифференцировку клеток и их рост [Schneider-Brachert W. et al., 2004]. Важный класс провоспалительных цитокинов, необходимых для активации нейтрофилов и моноцитов и привлечения этих клеток в очаг воспаления, составляют хемокины (хемоаттрактивные цитокины) [Wada et al., 2000]. Хемокины могут продуцироваться всеми ядросодержащими клетками как конституционально, так и после стимуляции, а также нелимфоидными клетками [Baggiolini M., 2001]. Хемокины осуществляют свое действие через рецепторы, состоящие из трансмембранных доменов и сопряженные с G-белками. Рассмотрение таких систем клеточных сигналов доказывает, что перекрестная информация между рецепторами может обеспечить клетке способность выбора надлежащего сигнала из массы конкурирующих сигналов со стороны других хемоаттрактантов, обеспечивая, таким образом, избирательность мобилизации лейкоцитов [Greaves D.R. et al, 1997].
В соответствии с порядком расположения консервированных цистеинов, хемокины разделяют на четыре семейства СХС, СС, С, и СХЗС (а, Д у и д, соответственно) [Bаggiоlini M. еt al., 1997; Cаmpbеll J.J. et al., 1998; Brаdlеy L.M. et al, 1999; Аtkinson M.A. еt al, 2002; Зак К.П. и др., 2006]. СХС, СС и СХЗС хемокины имеют четыре таких цистеина, а хемокины семейства С - только два, которые локализованы в позициях, соответствующих второму и четвертому цистеинам в других семействах [Murphy P.M. et al, 2000]. Самыми немногочисленными семействами хемокинов считаются группы С и СХЗС В группу С входят, так называемые, лимфотактины XCL1 и XCL2, а единственным представителем СХЗС семейства является фракталкин - CX3CL1 [Белоцкий СМ. и др., 2008]. Хемокины семейства СХС представлены несколькими подгруппами, включающими в себя более 15 представителей. Данное семейство разделяют на две подгруппы (ELR+ и ELK) в зависимости от наличия или отсутствия трипептида ELR TV-концевого отдела (глутаминовая кислота-лейцин-аргинин) первого цистеина. Такое деление имеет функциональный смысл: ELK хемокины являются антагонистами ELR+ факторов, которые проявляют специфическую активность по отношению к нейтрофилам [Bagginiolini et al, 1997; Campbel et al, 1998; Белоцкий СМ., 2008]. Хемокины подгруппы ELR+, как правило, являются стимуляторами миграции и пролиферации кератиноцитов, а также активаторами ангиогенеза, а ELK ,напротив, подавляют ангиогенез и дифференцировку моноцитов [Scheuerer B. et al., 2000]. Среди хемокинов, принадлежащих семейству СХС, ключевую роль в обеспечении иммунного ответа играют фактор-1, продуцируемый стромальными клетками (SDF-1 - stromal cell-derived factor-1) и интерферон индуцибельный -хемоаттрактант Т-клеток (IAC - /TVF-inducible T cell -chemoattractant) [Белоцкий СМ. и др, 2008].
SDF-1 обладает необычными характеристиками, его гомология с остальными СХС факторами и с хемокинами семейства СС очень низкая [Rankin S.M., 2012]. В отличие от других генов хемокинов, локализованных на 4 или 17 хромосомах, ген SDF-1 находится на 10 хромосоме. [Shirozu M. et al, 1995]. При активации CXCL12 (рецептора SDF-1) происходит димеризация, взаимодействие с Ош (а-субъединицей ингибиторного белка G), фосфорилирование JAK2/JAK3 (янус-киназа) и STAT. SDF-1 конститутивно экспрессируется, приемущественно, стромальными клетками костного мозга и присутствует во многих других тканях [Ratajczak M. et.al., 2004; Balabanian К. et.al, 2005; Petit I. et.al, 2007]. Так, в исследованиях Li Х.Р. и др. [2005] при иммуногистохимическом исследовании выявлено статистически значимое различие в экспрессии SDF-1 в ткани нормального эндометрия и при карциноме эндометрия. Установлено, что содержание SDF-1 в ткани нормального эндометрия было достоверно ниже аналогичного показателя при карциноме.
FT АС также как и SDF-1, представляет собой небольшой хемокин, принадлежащий семейству СХС Наряду с другими членами семьи СХС, ген этого хемокина расположен на 4 хромосоме. FTAC является важным хемотаксическим фактором для Т-лимфоцитов, также активирует TMCD4 Т-клетки, NK клетки, моноциты в очаге воспаления. Стимуляция продукции I-ТАС осуществляется интерферонами в сочетании с факторами некроза опухолей и бактериальными липосахаридами. К увеличению продукции I-ТАС также приводит сочетанное действие интерферонов гамма и интерлейкина-1 (IL-1) [Gasperini S. et al, 1999]. Семейство хемокинов СС состоит из 27 представителей, которые, в своем большинстве, представлены на миелоидных клетках, лимфоцитах, дендритных клетках и естественных киллерах. СС хемокины контролируют такие клетки иммунного процесса и воспаления, как моноциты, активированные Т-клетки, эозинофилы, базофилы и дендритные клетки [Wilson S., 2000].
Анализ литературных данных показывает, что в патогенезе доброкачественных заболеваний женской репродуктивной системы особое место принадлежит следующим представителям семейства СС: хемоаттрактанту моноцитов -1 (МСР-1 - monocyte chemoattractant protein-1), регулируемому в процессе активации хемокину, экспрессированному и секретируемому нормальными Т-клетками (RANTES - regulated on activation normal T-cell expressed and secreted) и макрофагальному воспалительному белку -1 (МР-1 - macrophage inflammatory protein-1) [Кондратьева П.Г. и др., 2006; Марченко Л.А. и др., 2011; Чухловин А.Б. и др., 2011].
Генетические исследования гиперпластических процессов эндометрия
Изучению молекулярно-генетических детерминант, связанных с формированием ГПЭ посвящено значительное количество исследований, выполненных как зарубежными [Miyazaki M. et al, 1996; Nordstrom B. et al, 1996; Lax S. et al., 1997; Miller B. et al, 1997; Morsi H.M. et al., 2000; Elhafey A.S. et al., 2001; Zhdanov A.V. et al., 2003; Sukhikh G.T. et al., 2005], так и отечественными [Адамян Л.В. и др., 1999; Сухих Г.Т. и др., 2000; Гигани О.О. и др., 2003; Войташевский К.В. и др., 2004; Прудникова Н.Ю. и др., 2005; Ордиянц И.М. и др., 2007; Степанова Н.Р., 2007; Иленко Е.В., 2007; Ахметова Е.С. и др., 2008; Задонская Ю.Н. и др., 2008; Лысенко О.В., 2008; Серегина П.Е., 2009; Чернуха Г.Е. и др., 2009; Пушкарев В.А. и др., 2009; Мустафаева А.С., 2010; Кипич Н.В. и др., 2012] авторами. В последнее время накапливается данные, свидетельствующие о том, что полиморфизм единичных нуклеотидов (SNP) за счет формирования специфических аллелей генов вносит важный вклад в предрасположенность к ряду заболеваний. В отношении гиперпластических процессов эндометрия идентифицировано несколько генов, полиморфизм которых ассоциирован с повышенным риском развития заболевания [Cohen.J.J., 2004]. В работе Мустафаевой А.С. [2010], посвященной оптимизации тактики ведения ГПЭ у женщин репродуктивного возраста, установлены «неблагоприятные» генотипы (А/А и Р/А) гена онкосупрессора P53, достоверно чаще встречающиеся у пациенток с ГПЭ. Достаточно много работ посвящено изучению клинического значения полиморфизма гена GРIIIa (гликопротеин IIIa) при гиперпластических процессах матки [Гигани О.О. и др., 2003; Прудникова Н.Ю., и др.. 2005; Вайташевский К.В. и др., 2004; Степанова Н.Р., 2007; Мустафаева А.С., 2010]. Ген GРIIIa осуществляет регуляцию синтеза b3 интегриновых рецепторов, которые вовлечены в процесс реализации матрикс-клеточных взаимодействий при межклеточных контактах. В работе Гигани О.О. и соавт. [2003], рассматриваются вопросы прогностической значимости отдельных генетических факторов в патогенезе ГПЭ у женщин в постменопаузе (изучаются генетические варианты GРIIIa). Полученные результаты показали, что генетические варианты GР-III, ассоциированы с развитием ГПЭ. Авторами установлено, что присутствие в генотипе аллеля PL-AII в 10 раз снижает риск развития гиперплазии эндометрия, в то время как пациентки, гомозиготные по аллелю AI гена GP III, являются группой риска по развитию его гиперпластической трансформации у женщин в постменопаузе. Аналогичные данные были получены в работе Вайташевского К.В. «Генетические аспекты гиперпластических процессов эндометрия у женщин в постменопаузе» [2004].
В свою очередь в исследовании Прудниковой Н.Ю. и соавт. [2005] отражено влияние гена GРIIIa на патогенез рецидивирующих ГПЭ. Было установлено, что женщины, являющиеся носителями аллеля PL-AII гена GPIIIa представляют группу риска по развитию рецидивирующих полипов эндометрия.
Степанова Н.Р. [2007] представила результаты о вовлеченности генетических вариантов GРIIIa в патогенезе гиперпластических процессов матки у женщин Якутии. Автором установлено, что наличие аллеля PLAII гена GРIIIa у коренных жительниц Якутии является генетическим предиктором развития аденомиоза и сочетанной гиперпластической патологии. Фактором риска развития миомы матки и гиперпластических процессов эндометрия является гомозиготный генотип по аллелю PLAI гена GPIIIa. А носительство аллеля PLAII гена GPIIIa в 3 раза увеличивает риск развития аденомиоза; в 2 раза - риск развития миомы матки в сочетании с аденомиозом и в 2,5 раза - вероятность развития миомы матки в сочетании с аденомиозом и ГПЭ. Изучение генетических детерминант среди здоровых и больных раком эндометрия женщин Кемеровской области выполнено в работе Иленко Е.В. и др. [2006]. Автором проведено исследование частот встречаемости аллельных и генотипических вариантов генов, кодирующих ферменты синтеза и катаболизма эстрогенов цитохромов Р450 (CYP1A1, CYP1A2 и CYP19) и сульфотрансферазы 1А1 (SULT1A1). Показано, что женщины с диким аллелем С и генотипом С/С гена CYP1A2 имеют повышенный риск развития рака эндометрия. Кроме того, установлено, что для женщин, страдающих ожирением, дикий аллель Т и генотип Т/Т гена CYP1A1, а также для женщин без ожирения мутантный аллель А и генотипы G/A и А/A являются факторами риска развития рака эндометрия. При изучении идентичных полиморфизмов в отношении гиперплазии эндометрия среди женщин перименопаузального периода установлено, что эти пациентки при наличии дикого аллеля С гена CYP1А2 и/или гетерозиготного генотипа G/A гена SULT1A1 имеют повышенный риск развития гиперпластических процессов эндометрия [Харенкова Е.Л. и др., 2009]. Адамян Л.В. и соавт. [2007] при исследовании экспрессии гена каталитической субъединицы теломеразы (hTЕRТ) при сочетанных гиперпластических процессах матки не выявили значимых различий между пациентками с различными формами внутриматочной патологии. При экспериментальном изучении эпидермального (EGF) и трансформирующего (TGF) факторов роста у больных с ГПЭ выявлено увеличение экспрессии EGF [Shaarawy M, 1992; Waksmanski B. et al.,2001]. По другим данным [Чернуха Г.Е. и др., 2004], экспрессия гена ЕGF при ГПЭ снижена.
Молекулярно-генетические методы
Генотипирование ДНК-маркеров проводилось в лаборатории «Молекулярной генетики человека» медицинского института НИУ «БелГУ». В качестве материала для исследования использовали венозную кровь в объеме 5-6 мл. Забор крови осуществлялся в вакутейнеры с 0,5М раствор ЭДTА (рН=8,0). Выделение геномной ДНК из периферической крови производили стандартным методом фенол-хлороформной экстракции из замороженной венозной крови [Mathew С.С, 1984]. Полученную ДНК применяли для проведения полимеразной цепной реакции (ПНР) синтеза ДНК. Анализ всех локусов осуществлялся методом ПНР синтеза ДНК, которая проводилась на амплификаторе с возможностью проведения анализа флуоресценции по конечной точке «IQ 5» («Bio-Rad», США) с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы «Силекс - М», олигонуклеотидных праймеров и зондов, синтезированных фирмой «Синтол». Структура праймеров и зондов, условия ПНР для каждого исследуемого ДНК-полиморфизма индивидуальны и приведены в таблице 3. Генотипирование ДНК-маркеров производили с помощью метода детекции TaqMan зондов по данным величин RFU (уровень относительной флуоресценции) каждого зонда на амплификаторе «IQ5» с детектирующей системой в режиме реального времени (рис. 2). Для дискриминации аллелей использовали программу «Bio-Rad IQ5-Standart Edition». В качестве примера стандартного распределения облаков генотипов может послужить дискриминация аллелей по локусу -308 G/A TNFa (рис. 3). Зонд с флуоресцентным красителем ROX соответствует аллелю G, зонд с красителем FAM -аллелю А. Таблица 3 Структура праймеров и зондов, использованных для генотипирования ДНК-маркеров методами ПЦР с температурой и временем отжига праймеров и зондов (начало) Полиморфизм иеголокализация вгене 5 -3 последовательность праймеров и зондов Tемпература отжига, С Время отжига, мин: сек Литературный источник -308G/A TNFa (rs 1800629) F: 5 -GAAATGGAGGCAATAGGTTTTGAG-3 R: 5 -GGCCACTGACTGATTTGTGTGTAG-3 5 -FAM-CCGTCCTCATGCC- RTQ1-3 5 -R0X-CCGTCCCCATGCC - RTQ1-3 52,0 1:00 [Hulkkonen J., 2002] +252A/G Lta (rs 909253) F: 5 -C AGTCTC ATTGTCTCTGTC ACACATT-3 R: 5 -ACAGAGAGAGACAGG AAGGGAACA-3 5 -FAM:CC ATGGTTCCTCTC-RTQ1 -3 5 -ROX:CTGCC ATGATTCC-RTQ1 -3 50,0 1:00 [Mirjam M. de Jong et al., 2003] +36A/G TNFR1(rs 767455) F: 5 - AGCCCACTCTTCCCTTTGTC-3 R: 5 -CCACCGTGCCTGACCTG-3 5 - FAM: CTGCTGCCACTGGT-RTQ1 -3 5 - ROX: CTGCTGCCGCTGGT-BHQ2 -3 62,0 1:00 [Soo Jin Chae et al., 2008] +1663A/GTNFR2 (rs 1061624) F: 5 - TGACCTGCAGGCCAAGAG-3 F: 5 - CCATGGCAGCAGAGGCTTT-3 5 -FAM: CACAACCCGCTGCC - RTQ1-3 5 -ROX: CCACAACTCGCTGCC - BHQ2-3 59,0 1:00 [Lynnette R. Ferguson et al., 2009]
При сравнении концентраций генетических вариантов цитокинов между исследуемыми группами женщин использовали таблицу сопряженности 2х2, с учетом критерия 2 с поправкой Йетса на непрерывность. Об ассоциации генетических вариантов цитокинов с качественными признаками, характеризующими гиперпластические процессы эндометрия (наличие гиперплазии эндометрия, вид гиперпластических процессов эндометрия, их сочетания с гинекологической патологией и др.), судили по значению отношения шансов (ОR), который рассчитывали по формуле [Реброва О.Ю., 2006]: OR=(A/B)/(C/D), где А и В - численность пациентов с полиморфным аллелем (генотипом) и без него, соответственно; D и C - число индивидуумов в контрольной группе с данным генетическим вариантом и без него. ОR 1 оценивали как положительную ассоциацию признака с исследуемым генетическим вариантом (фактор риска) и ОR 1 - как отрицательную ассоциацию (протективный фактор). Границы 95% доверительного интервала (СI) для ОR определяли по формулам [Реброва О.Ю., 2006]: OR n = OR 96 и ORx = OR (1+1 96 } Изучение вклада комбинаций генетических полиморфизмов цитокинов в развитие ГПЭ проводили с помощью программного обеспечения APSampler (http://sourсes.redhat.сom/сygwin/) [Favorov A. V., et al, 2011]. При проведении множественных сравнений использовали поправку Бонферрони. За статистически значимый уровень принимали рcor 0,05. ГЛАВА 3. Изучение ассоциаций генетических полиморфизмов цитокинов с формированием гиперпластических процессов эндометрия В данном разделе работы отражены результаты изучения роли полиморфизмов генов цитокинов -308 G/A TNFa, +252 A/G Eta , +36 A/G TNFRI, +1663 A/G TNFR2, -403A/G RANTES, A/G IAC (rs 4512021), +1931A/T MIP1/3, C/G MCP1 (rs 2857657), -801G/A SDF1 в формировании ГПЭ.
Анализ связи полиморфных маркеров генов цитокинов -308 G/A TNFa, +252 A/G Eta, +36 A/G TNFRI, +1663 A/G TNFR2, -403 A/G RANTES, A/G IAC (rs 4512021), +1931A/T MPlp, C/G MCP1 (rs 2857657), -801 G/A SDF1 с формированием ГПЭ проводили на выборке из 502 женщин, из которых 253 пациентки с ГПЭ и 249 человек контрольной группы. Данные генотипирования исследуемых женщин представлены в таблицах 4 и 5. Анализ распределения генетических вариантов изучаемых полиморфных локусов цитокинов показал, что для всех рассмотренных генетических полиморфизмов в контрольной группе и почти для всех маркеров в группе пациенток с ГПЭ фактическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (р 0,05). Только в отношении полиморфизма +36 A/G TNFR1 среди пациенток с ГПЭ зарегистрировано отклонение от равновесия Харди Вайнберга за счет высокого количества гетерозиготных вариантов по сравнению с теоретическим значением (2=14,48, p 0,001), об этом свидетельствуют и положительное значение индекса фиксации (D=+0,24). Одной из причин отклонения в распределении генотипов от равновесия HWE по локусу +36 A/G TNFR1 могут быть ошибки генотипирования. С целью их исключения мы провели повторное генотипирование всех образцов ДНК больных ГПЭ по локусу +36A/G TNFR1.
Генетические факторы развития гиперплазии эндометрия и полипов эндометрия
Проведено исследование особенностей генетических характеристик пациенток с различными гиперпластическими процессами эндометрия по рассматриваемым генам цитокинам. Согласно гистологической классификация ВОЗ [1997] изучены две группы пациенток: с гиперплазией эндометрия (n=69) и с полипами эндометрия (n=174). Группа женщин, у которых имелось сочетание гиперплазии эндометрия и полипов эндометрия (n=10), в связи с малочисленностью, нами была исключена из анализа. Анализ распределения генотипов и аллелей, исследуемых цитокинов, среди больных с различными видами гиперпластических процессов эндометрия, а также, в контрольной группе показал статистически достоверные различия в частотах генетических вариантов по локусам -308 G/A TNFa, +36 A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2 (табл.7, рис. 4, 5). Установлено, что в группе пациенток с полипами эндометрия концентрация генотипа +36 AG TNFR1 составила 64,46%, что больше в 1,4 раза по сравнению с контрольной группой (46,75%, =11,81, р=0,001, рсог =0,003, OR=2,07, 95%, СІ 1,35-3,16). Наряду с этим выявлена ассоциация аллеля -308ATNFa с формированием гиперплазии эндометрия (рис. 4.). Концентрация данного аллеля среди пациенток с гиперплазией эндометрия составила 19,05%, что достоверно выше, чем в контрольной группе (10,08%, х2=7,05, р=0,009, OR=2,07, 95%, СІ 1,20 - 3,58) и в группе пациенток с полипами эндометрия (9,48% =1,26, р=0,008, OR=2,22, 95%, СІ 1,22-4,01). -, 16 12 8 4
Таким образом, полученные в данном разделе работы результаты позволяют заключить, что генетические полиморфизмы -308 G/A TNF а, +36 A/G TNFR1 и +1663A/G TNFR2 ассоциированы с различными морфологическими вариантами гиперплазии эндометрия. При этом молекулярно-генетическими маркерами повышенного риска возникновения гиперплазии эндометрия являются аллели -308 A TNFa (OR=2,07) и +1663 А TNFR2 (ОR=1,63), а формирование полипов эндометрия ассоциировано с генетическим вариантом +36 AG TNFR1 (ОR=2,07).
На следующем этапе исследования мы изучили роль комбинаций молекулярно-генетических маркеров цитокинов в развитии, как гиперплазии эндометрия, так и полипов эндометрия. Для этого использовали программное обеспечение АРSampler [http://sоurces.rеdhаt.соm/сygwin/], использующего метод Монте-Карло марковскими цепями и байесовскую непараметрическую статистику [Favorov A. V. et al, 2011].
В результате проведенного анализа носительства сочетаний аллелей и генотипов исследуемых локусов цитокинов выявлен целый ряд достоверных различий между анализируемыми группами пациенток с ГПЭ и контролем (табл. 8).
В формировании значимых комбинаций генетических вариантов, отличающих пациенток с гиперплазией эндометрия от группы контроля участвуют следующие генетические полиморфизмы: -308 G/A TNFa, +252 A/G Lta,+36 A/G TNFR1, +1663A/G TNFR2, +1931 A/T MPip, C/G MCP1 (rs2857657), -801 G/A SDF1 (табл.8). Выявлена наибольшая частота сочетания аллелей -308 A TNFa,+36 G TNFR1, +1663А TNFR2 и +1931 A MIPlp среди пациенток с гиперплазией эндометрия, которая составила 23,33%, тогда как в контрольной группе этот показатель равен 6,90% (р=0,0006, рcor =0,009). Такая комбинация генетических вариантов цитокинов служит фактором риска развития гиперплазии эндометрия (ОR=4,11, 95%, CI 1,88-9,01). В группе больных с полипами эндометрия это сочетание аллелей встречалось у 5,59% индивидов (р=0,76 при сравнении с контрольной группой и 2=12,92, р=0,001 при сравнении с больными с гиперплазией эндометрия).
Выявлены достоверные различия в концентрациях сочетания трех генетических маркеров +252 G Lta, +36 G TNFR1 и +1931 А МР1/3 между больными с гиперплазией эндометрия (47,69%) и контрольной группой (27,50%). Такое сочетание аллелей является фактором риска развития гиперплазии эндометрия (р=0,0019, pcor=0,015, OR= 2,40, 95% СІ 1,37-4,22). У пациенток с полипами эндометрия частота данной комбинации генетических вариантов составила 30,68%, что соответствует аналогичному показателю контрольной группы (р=0,56) и значительно ниже этого показателя среди больных с гиперплазией эндометрия ( =5,16, р=0,023).
Установлено, что сочетание аллелей -308 A TNFa, +1663 A TNFR2 и -801 G SDF1 встречается у 28,13% пациенток с гиперплазией эндометрия, что в 2,37 раза превышает аналогичный показатель группы контроля (11,86%) и в 2,99 раза больше значения соответствующего показателя группы пациенток с полипами эндометрия (9,41%, =11,65, р=0,001). Следует отметить, что такое сочетание аллелей является фактором риска развития гиперплазии эндометрия (р=0,0021, pcor=0,016, OR= 2,91, 95% СІ 1,48-5,70). Зарегистрированы различия в концентрациях сочетаний аллелей -308 А TNFa, +252 G Lta и +1663 A TNFR2 между группой больных с гиперплазией эндометрия и контрольной группой. Это сочетание наблюдается среди 28,13% пациенток с гиперплазией эндометрия, тогда как в группе контроля частота данной комбинации составила 11,86% (р=0,0021, рсог=0,016). Такая комбинация генетических вариантов цитокинов служит фактором риска развития гиперплазии эндометрия (OR=2,91, 95% СІ 1,48-5,70). Такое сочетание встречается у 9,41% пациенток с полипами эндометрия.
Комбинация генетических факторов, которая наблюдается у 40,30% больных с гиперплазией эндометрия и у 21,72% женщин контрольной группы, включает сочетание двух генетических маркеров: +252 G Lta и +1931 АА МІРІ/З (р=0,0022, рсог =0,012). Данное сочетание является фактором риска развития гиперплазии эндометрия (OR=2,43, 95% СІ 1,27-4,32). Следует отметить, что это сочетание встречается среди 20,00% пациенток с полипами эндометрия, что достоверно меньше показателя группы больных с гиперплазией эндометрия (40,30%, у?=9,ЪЪ, р=0,003) и аналогично данным группы контроля (21,72%, =0,76, р=4,56).
Сочетание аллелей -308 A TNFa,+1663A TNFR2 и +1931 A MIPlp встречается у 25,81% пациенток с гиперплазией эндометрия, что в 2,53 раза превышает аналогичный показатель группы контроля (10,21%, р=0,0023, рсог =0,016) и в 2,87 раз больше значения соответствующего показателя группы пациенток с полипами эндометрия (8,98%, =9,55, р=0,003). Такое сочетание аллелей является фактором риска развития гиперплазии эндометрия (OR=3,06, 95% СІ 1,51-6,21).
Также выявлена «рисковая» комбинация аллелей -308 A TNFa и +166ЗА TNFR2, которая встречалась у 28,13% больных с гиперплазией эндометрия и среди 12,19% женщин контрольной группы (рсог =0,010, OR=2,82, 95% СІ 1,44-5,51). Это сочетание генетических вариантов цитокинов наблюдалось среди 10,00% женщин с полипами эндометрия, что соответствует аналогичному показателю контрольной группы (р=0,60) и значительно ниже данного показателя среди больных с гиперплазией эндометрия ( =10,63, р=0,002).
Выявлена ассоциация сочетания аллелей -308 A TNFa, +36 G TNFR1 и +1931 А МІРІ/] с формированием гиперплазии эндометрия. Эта комбинация встречается среди 26,15% больных с гиперплазией эндометрия и у 11,62% женщин контрольной группы (рсог =0,032). Такая комбинация генетических вариантов цитокинов является фактором риска развития гиперплазии эндометрия (OR=2,69, 95%, СІ 1,37-5,31). Среди пациенток с полипами эндометрия данное сочетание аллелей встречалось у 11,04% индивидов (р=0,99 при сравнении с контрольной группой и хУ7,05, р=0,009 при сравнении с больными с гиперплазией эндометрия).
Установлены различия в частоте сочетания аллеля +36 A TNFR1 с генотипом СС МСР1 между группой больных с гиперплазией эндометрия и контрольной группой. Частота этой комбинации генетических вариантов в контрольной группе составила 42,26%, тогда как среди пациенток с ГПЭ данный показатель равен 60,94% (р=0,006, рсог =0,036). Такое сочетание является фактором риска развития гиперплазии эндометрия (OR=2,13, 95%, СІ 1,21-3,74). Следует отметить, что это сочетание встречается среди 42,35% пациенток с полипами эндометрия, что достоверно меньше показателя группы больных с гиперплазией эндометрия (60,94%, =5,12, р=0,017) и аналогично данным среди женщин контрольной группы (42,26%, р=1,00).
