Введение к работе
Актуальность работы. Выяснение механизмов химического канцерогенеза является одной из серьезных фундаментальных проблем теоретической онкологии и молекулярной патофизиологии. Несмотря на почти столетнюю историю исследований, до настоящего времени не имеют объяснения многие особенности действия химических канцерогенов, такие как видовая, линейная и тканевая специфичность, отсутствие соответствия между канцерогенной и мутагенной активностью многих химических соединений, обратимость ранних стадий канцерогенеза. Выяснение причин этих явлений имеет большое значение как для понимания механизма канцерогенного процесса, так и для виявленій новых кандидатных генов, ответственных за формирование фенотипа, чувствительного или устойчивого к развитию злокачественных опухолей под действием определенных химических веществ.
Ранее при исследовании механизмов видовой специфичности действия
гепатоканцерогенных аминоазокрасителей 3-метил-ї\ї,М-диметил-4-
аминоазобензола (3 -МеДАБ) и 2'-3-диметил-4-аминоазобензола (орто-аминоазотолуол, ОАТ) была выявлена связь между опухолеиндуцирующим эффектом соединения и снижением ДНК-связывающей активности транскрипционных факторов HNF3 (hepatocyte nuclear factor), играющих важную роль в процессах дифференцировки и торможения пролиферации гепатоцитов. Было показано, что снижение ДНК-связывающей активности HNF3 в печени крыс происходит в ответ на введение специфичного для крыс гепатоканцерогена 3'-МеДАБ, но не канцерогенного для мышей ОАТ, и, наоборот, в печени мышей активность HNF3 снижается при введении специфичного для мышей гепатоканцерогена ОАТ, но не З'-МеДАБ, причем это имеет место только у чувствительных к опухолеиндуцирующему действию ОАТ линий [Меркулова и др., 1998; Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003]. Однако каким образом обеспечивается такая избирательность, остается неясным. Дальнейшие исследования показали, что влияние ОАТ и З'-МеДАБ на HNF3 осуществляется, не напрямую, а, по-видимому, посредством некоего ядерного белка (-ов) [Меркулова и др., 2003]. Представляется вероятным, что либо видоспецифичность связана с избирательным действием этого белка-посредника
на HNF3y мыши и HNF3P крысы, либо видоспецифичность обеспечивается избирательной активацией белка-посредника под действием специфичного для данного вида канцерогена. Было выдвинуто предположение, что в качестве такого белка могут выступать рецепторы ксенобиотиков, связывающие многочисленные химические соединения и опосредующие их плеиотропные эффекты на организм.
Цель и задачи исследования. Целью данного исследования было изучение механизмов, обусловливающих видовую специфичность действия гепатоканцерогенных аминоазокрасителей у мышей и крыс, а также поиск ксеносенсорных белков, способных принимать участие в передаче сигнала от ОАТ и З'МеДАБ на HNF3. В ходе работы были поставлены следующие задачи:
-
Выяснить, связана ли видовая специфичность гепатоканцерогенов ОАТ, З'МеДАБ с различным действием белков-посредников на транскрипционные факторы HNF3P крысы и HNF3y мыши или же она обеспечивается избирательной активацией белка-посредника под действием специфичного для данного вида канцерогена.
-
Исследовать участие белка-посредника в действии видонеспецифического гепатоканцерогена ДЭНА на HNF3 белки.
-
Изучить влияние ОАТ, З'МеДАБ И ДЭНА на ДНК-связываюшую активность рецепторов ксенобиотиков: печеночного Х-рецептора (LXR), прегнанового X рецептора (PXR) конститутивного рецептора андростанов (CAR), рецептора активаторов пролиферации пероксисом (PPAR), арилгидрокарбонового рецептора (AhR) в печени мышей и крыс.
-
Выяснить, обусловлено ли увеличение ДНК-связывающей активности AhR и CAR под действием гепатоканцерогенных аминоазокрасителей изменением содержания этих рецепторов в экстрактах ядер печени.
-
Изучить способность ОАТ и З'-МеДАБ специфически связываться с конститутивным рецептором андростанов (CAR).
Научная новизна и практическая значимость. Установлено, что механизмы влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей ОАТ и З'-МеДАБ
и диэтилнитрозоамина (ДЭНА) на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов HNF3 различны. Видоспецифичность действия аминоазокрасителей на HNF3 определяется избирательной активацией ядерного белка (-ов) под влиянием гепатоканцерогенного для данного вида вещества (З'МеДАБ для крыс, ОАТ для мышей). Механизм действия неспецифического гепатоканцерогенного соединения другого класса ДЭНА не включает белка-посредника.
Показана принципиальная возможность того, что арилгидрокарбоновый рецептор (AhR) и конститутивный рецептор апдростанов (CAR) могут выполнять роль белка, опосредующего действие гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на HNF3:
-
Показано, что избирательное увеличение ДНК-связывающей активности рецепторов ксенобиотиков AhR и CAR под действием гепатоканцерогенных аминоазокрасителей ОАТ и З'-МеДАБ как in vivo, так и in vitro соответствует способности этих веществ снижать ДНК-связывающую активность HNF3 белков.
-
Обнаружено, что при действии видонеспецифического гепатоканцерогена ДЭНА, не активирующего белок-посредник, также не активируются CAR и AhR.
-
Показано, что увеличение ДНК-связывающей активности CAR и AhR не обусловлено изменением содержания этих белков в ядрах печени, и в случае CAR связано, по-видимому, с видоспецифическими различиями в связывании этого рецептора с ОАТ и З'-МеДАБ.
Полученные результаты имеют большое значение для установления механизмов видоспецифичности гепатоканцерогенного действия ОАТ и З'МеДАБ, а также способствуют выяснению молекулярно-генетических основ предрасположенности или устойчивости организма к возникновению химически индуцированных злокачественных опухолей печени. Кроме того, результаты проведенного исследования могут быть использованы для разработки новых методов тестирования химических соединений на канцерогенность.
Положения, выносимые на защиту.
-
Видоспецифичность влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на транскрипционные факторы HNF3 определяется избирательной стимуляцией белка(-ов)-посредника(-ов), который активируется у крыс гепатоканцерогенным для них З'МеДАБ, а у мышей гепатоканцерогенным для них ОАТ. Этот белок(-ки)-посредник(-ки) неспецифически снижает ДНК-связывающую активность HNF3y мыши и HNF3P крысы.
-
Избирательная активация рецепторов ксенобиотиков AhR и CAR под действием гепатоканцерогенных аминоазокрасителей (но не их неканцерогенных аналогов) как in vivo, так и in vitro сопряжена со способностью этих соединений снижать ДНК-связывающую активность HNF3 белков.
-
Неспецифический гепатоканцероген ДЭНА снижает ДНК-связываюнгую активность HNF3 в отсутствии белка-посредника и не изменяет активность AhR и CAR.
-
Увеличение ДНК-связывающей активности CAR и AhR не обусловлено изменением содержания этих белков в ядрах клеток печени под влиянием аминоазокрасителей.
-
ОАТ и З'-МеДАБ способны конкурировать с известным лигандом CAR [3Н]-андростенолом за связывание с белками цитозоля печени мышей и крыс. ОАТ является лучшим конкурентом в цитозоле печени мышей, а З'МеДАБ - в цитозоле печени крыс.
-
Арилгидрокарбоновый рецептор (AhR) и конститутивный рецептор андростанов (CAR) могут выполнять роль белков, опосредующих действие гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на HNF3.
Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на II съезде общества клеточной биологии совместно с Юбилейной конференцией, посвященной 50-летию института цитологии РАН (Санкт- Петербург, 2007.), международной конференции «Chemical and biological problems of Proteomics» (Новосибирск, 2004), VIII Дальневосточной школе-конференции по актуальным
проблемам химии и биологии (Владивосток, 2004), всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, заключения, выводов и списка литературы (204 наименования). Работа изложена на 122 страницах машинописного текста и содержит 25 рисунков. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Работа выполнена на самцах крыс весом 200г Wistar и 3-х месячных самцах мышей линии А/Не разведения вивария ИЦиГ СО РАН. В экспериментах in vivo OAT, З'-МеДАБ, 4'-МеДАБ растворяли в оливковом масле, ДЭНА в физиологическом растворе и вводили внутрибрюшинно по 1 мл на 100г массы тела животных до конечной концентрации 1мМ [Каледин, Захарова, 1984]. Контрольным животным вводили растворитель. В опытах in vitro канцерогены добавляли в объеме не более 1% от объема реакционной смеси: до концентрации 0,1мМ ОАТ, З'-МеДАБ, 4'-МеДАБ в виде растворов в ДМСО (диметилсульфоксид), ДЭНА - в физиологическом растворе в гомогенат или ядерный экстракт [Меркулова и др., 2003]. Экстракты ядер получали согласно методу Горски-Шапиро (Gorsky-Shapiro) [Меркулова и др., 2003]. ДНК-связывающую активность факторов транскрипции оценивали методом задержки в геле [Kropachev et al., 2001] во фракции I, осаждаемой при концентрации сульфата аммония 0,32 г/мл, либо в суммарном экстракте ядер, полученном при 0,46 г/мл сульфата аммония. При проведении смешений фракций выделяли фракции I и II ядерного экстракта последовательным осаждением белков при концентрации 0,32 и 0,46 г/мл сульфата аммония. Двуцепочечные олигонуклеотиды, соответствующие известным сайтам связывания факторов транскрипции, и используемые в качестве ДНК-проб, были синтезированы В.Ф. Кобзевым (ИЦиГ СО РАН). Денситометрию радиоавтографов проводили в программе Gel Pro Analyzer 4.0. Содержание транскрипционных факторов в
ядерном экстракте оценивали методом Вестерн-блот-гибридизации. Для визуализации результатов использовали ECL-систему "Amersham". [3Н]-андростенол (5а-андрост-16-ен-За-ол) с удельной активностью 20-30 Кюри/мМ был получен методом тритиевого обмена Романовой И.В. (ИХБиФМ СО РАН). Получение цитозоля клеток печени и изучение связывания [ Н]-андростенола с цитозолем проводили по методу описанному ранее [Kropachev et al., 2001]. Статистическую обработку результатов проводили, используя t-критерий Съюдента в программе STATISTICA 5.5.
