Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 11
1.1. Эпидемиология бронхиальной астмы 12
1.2. Этиология и классификация бронхиальной астмы 14
1.3. Механизмы развития бронхиальной астмы 18
1.4. Генетические факторы развития бронхиальной астмы
1.4.1. Позиционно-клонированные гены бронхиальной астмы 27
1.4.2. Гены цитокинов и их рецепторов
1.5. Бронхиальная астма и окружающая среда 45
1.6. Гены детоксикации ксенобиотиков
1.6.1. Гены I фазы биотрансформации 49
1.6.2. Гены II фазы биотрансформации 53
1.6.3. Ген метилентетрагидрофолатредуктазы (MTHFR) 55
Глава 2. Материалы и методы исследования 58
2.1. Материалы исследования 59
2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 59
2.3. Рестрикционный анализ 60
2.4. Метод электрофореза 62
2.5. Анализ полиморфных вариантов генов системы биотрансформации с помощью биочипа 66
2.5.1. Мультиплексная полимеразная цепная реакция 67
2.5.2. Гибридизация, регистрация изображения и обработка полученных результатов 70
2.6. Статистическая обработка полученных результатов 71
Глава 3. Результаты и обсуждение 75
3.1. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов цитокинов с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан
3.1.1. Анализ полиморфного локуса -590С Т гена IL4 у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе 75
3.1.2. Анализ полиморфного локуса Ile50Val гена IL4RA у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе 84
3.1.3. Анализ полиморфного локуса -308G A гена TNFA у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе 90
3.1.4. Анализ полиморфного локуса -627С А гена 1Ы0 у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе 100
3.1.5. Исследование полиморфного локуса 3953С Т гена IL1B у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе 105
3.1.6. Исследование fWZK-полиморфного локуса гена IL1RA у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе 109
3.2. Анализ ассоциаций полиморфных вариантов генов системы биотрансформации с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан 116
3.2.1. Анализ полиморфных вариантов генов I фазы системы биотрансформации (CYP1A1, CYP2D6, CYP2C9, CYP2C19) у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе 117
3.2.2. Анализ полиморфных локусов генов II фазы системы биотрансформации (GSTT1, GSTM1, NAT2) у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе
3.2.3. Анализ полиморфного варианта 677С Т гена MTHFR у 155 больных бронхиальной астмой и в контрольной группе
3.3. Анализ ассоциации полиморфных вариантов гена ADAM33 с бронхиальной астмой в Республике Башкортостан 160
3.3.1. Анализ полиморфного варианта ST+4 (11434С А) гена ADAM33 у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе 160
3.3.2. Анализ полиморфного варианта D-l (6716G C) гена ADAM33
у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе 169
3.3.3. Анализ ассоциаций гаплотипов гена ADAM33 с риском развития бронхиальной астмы 174
3.4. Исследование роли межгенных взаимодействий в формировании предрасположенности к бронхиальной астме 176
Заключение 187
Выводы 195
Список литературы
- Этиология и классификация бронхиальной астмы
- Анализ полиморфных вариантов генов системы биотрансформации с помощью биочипа
- Анализ полиморфного локуса -590С Т гена IL4 у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе
- Анализ полиморфного варианта 677С Т гена MTHFR у 155 больных бронхиальной астмой и в контрольной группе
Введение к работе
Актуальность проблемы
Бронхиальная астма (БА) - это распространенное воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором принимают участие многие клетки и клеточные элементы. По социально-экономическому ущербу, влиянию на уровень здоровья и качество жизни пациентов, бронхиальная астма входит в число первых трех патологий в структуре заболеваний человека. Хроническое рецидивирующее течение БА, часто проявляющееся в раннем детстве и продолжающееся в течение всей жизни, может быть причиной не только инвалидности, но и смертельных исходов, что определяет необходимость исследования сложных невыясненных механизмов развития данной патологии с целью разработки эффективных методов диагностики и профилактики [Геппе Н.А. и др., 2002; Под ред. Чучалина А.Г., 2005; GINA, 2007].
Бронхиальная астма является классическим примером многофакторной патологии, развивающейся при взаимодействии многочисленных факторов окружающей среды и наследственной предрасположенности. Генетические механизмы БА в последние годы стали областью активных международных исследований. На сегодняшний день более 15 исследовательских групп опубликовали результаты полногеномных анализов сцепления при атопии, атопическом дерматите и астме в различных популяциях [Ober С. et al., 2006; Scirica C.V. et al., 2007; Weiss S.T., 2009]. Согласно выводам этих работ, для 10 хромосомных областей (2р16, 2q32-33, 5q31-33, 6р21-24, llql2-13, 12ql4-24, 13ql4-22, 14q24, 16pl2, 17q21, 20pl3) показана высокая степень сцепления с астмой и сопутствующими с ней признаками [Daniels S.E. et al., 1996; CSGA, 1997; Ober С. et al., 1998; Yokouchi Y. et al, 2000; Haagerup A. et al., 2002; Hakonarson H. et al, 2002; Van Eerdewegh P. et al, 2002; Evans D.M. et al, 2004; Nicolae D. et al, 2005; Postma D.S. et al., 2005; Pillai S.G. et al., 2006; Moffatt M.F. et al., 2007].
Многочисленные ассоциативные исследования свидетельствуют, что в патогенезе БА принимают участие множество функционально взаимосвязанных генов (генных сетей), в том числе главные, ключевые гены и гены-модификаторы, фенотипический эффект которых зависит от факторов окружающей среды [Баранов B.C. и др., 2008]. Существенная часть исследований посвящена генам цитокиновой сети, которые играют решающую роль в развитии аллергического воспаления [Rosenwasser L.J. et al., 1995; Kruse S. et al., 1999; Kips J.C., 2001; Markova S. et al, 2007; Settin A. et al, 2008; Castro-Giner F. et al., 2009]. Большой опыт накоплен и в отношении генов системы детоксикации, отвечающих за
деградацию и выведение из организма ксенобиотиков [Баранов B.C. и др., 2000, 2008; Ляхович В.В. и др., 2002; Niewinski P. et al, 2003; Фрейдин М.Б. и др., 2002, 2006; Polonikov A.V. et al., 2009]. Позиционно-клонированный ген ADAM33 (А Disintegrin and Metalloprotease 33) рассматривается в качестве одного из главных кандидатов тяжести течения БА [Van Eerdewegh P. et al., 2002; Howard T.D. et al., 2003; Cheng E. et al., 2004; Jie Z. et al., 2009]. Взаимосвязь полиморфных вариантов как генов цитокиновой сети, так и генов системы биотрансформации, с бронхиальной астмой у жителей России изучена несколькими группами исследователей [Ляхович В.В. и др., 2002; Фрейдин М.Б. и др., 2002, 2006; Карунас А.С. и др., 2004, 2007; Баранов B.C. и др., 2008; Polonikov A.V. et al., 2009]. Полученные результаты, однако, весьма противоречивы и не дают однозначного ответа на вопрос об их патогенетической роли в развитии астмы. Исследование гена ADAM33 у больных БА в отечественных работах ранее не проводилось. Это свидетельствует о необходимости комплексного исследования генетических механизмов развития данного заболевания для оценки факторов риска развития БА и последующей разработки профилактических мероприятий с учетом индивидуальных особенностей каждого больного.
В связи с вышесказанным были определены цели и задачи исследования.
Цель работы
Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов, генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и гена дизинтегрина и металлопротеазы ADAM33 с развитием бронхиальной астмы в Республике Башкортостан.
Задачи исследования
Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов цитокинов IL4 (-590ОТ), IL4RA (Ile50Val), IL10 (-627 О А), TNFA (-308G>A), IL1B (3953С>Т) nlLlRA (VNTR) у больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов.
Провести исследование полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков CYP1A1 (48870А, 4889A>G, 6235Т>С), CYP2C9 (430ОТ, 1075А>С), CYP2C19 (68Ю>А), CYP2D6 (1934G>A), GSTM1 (деления), GSTT1 (деления), NAT2 (481 ОТ, 590G>A, 857G>A), MTHFR (677С>Т) у больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов.
Провести генотипирование и гаплотипирование полиморфных вариантов гена дизинтегрина и металлопротеазы ADAM33 у больных бронхиальной астмой и здоровых индивидов.
Провести анализ ассоциаций исследованных полиморфных вариантов генов с развитием БА у детей и индивидов старше 18 лет. Проанализировать распределение частот аллелей и генотипов изученных полиморфных локусов с учетом этнической принадлежности индивидов, формы и степени тяжести БА.
Провести анализ роли межгенных взаимодействий полиморфных вариантов генов цитокинов, гена ADAM33 и генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в развитии бронхиальной астмы.
Научная новизна исследования
Впервые с помощью биочипа, разработанного в лаборатории биологических микрочипов Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, в диссертационной работе определены частоты полиморфных вариантов генов системы биотрансформации CYP1A1, CYP2D6, GSTT1, GSTM1, MTHFR, CYP2C9, CYP2C19 и NAT2 у больных Б А и здоровых индивидов из РБ. Впервые проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов гена ADAM33 с бронхиальной астмой. Выявлены генетические маркеры риска развития заболевания у индивидов с учетом их этнической принадлежности, формы и степени тяжести БА. Впервые с помощью программы GMDR исследовано межгенное взаимодействие генов цитокинов, ферментов системы биотрансформации и гена дизинтегрина и металлопротеазы ADAM33, а также изучена их взаимосвязь с учетом возраста индивидов и клинических проявлений БА.
Научно-практическая значимость работы
Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к бронхиальной астме. Данные диссертационной работы могут послужить основой для последующих исследований по определению генетических факторов риска развития БА и разработки адекватных лечебно-профилактических мероприятий. Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов на факультетах биологии, в медицинских ВУЗах, на курсах повышения квалификации медицинских работников.
Апробация работы
Основные положения диссертации были представлены на школе-семинаре «Биомика-наука XXI века» (Уфа, 2007), European Human Genetics Conference (Barcelona, 2008; Vienna, 2009), European Respiratory Society Annual Congress
(Berlin, 2008; Vienna 2009), Congress of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology (Warsaw, 2009), V Съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, и одна монография.
Структура и объем диссертации
Этиология и классификация бронхиальной астмы
Пол. У детей в возрасте младше 14 лет, распространенность Б А почти в два раза выше у мальчиков, чем у девочек [Horwoord L.J. et al., 1985]. По мере взросления половые различия сглаживаются, и у взрослых распространенность Б А у женщин повышается. Повышенный риск развития БА у мальчиков обусловлен более узкими дыхательными путями, повышенным тонусом гладкой мускулатуры бронхиального дерева и более высоким уровнем IgE, чем у девочек [Martinez F.D. et al., 1995; Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы, 2007]. У взрослых наблюдается обратное соотношение. Половые и тендерные различия по заболеваемости астмой во взрослом возрасте по-прежнему остаются сравнительно новой областью в исследованиях, пока еще не существует четкого объяснения причин различий, которые наступают после полового созревания. Предполагается, что? половые гормоны играют важную роль в развитии астмы [Chen W. et al., 2008].
Аллергены. Хорошо известно, что аллергены помещений и внешние аллергены могут вызывать обострения БА. Когортные исследования детей с момента рождения показали, что сенсибилизация к аллергенам клеща домашней пыли, перхоти кошек и собак, а также к грибку рода Aspergillus являются независимым фактором риска симптомов, напоминающих астматические [Wahn U. et al., 1997; Sporic R. et al., 1990; Hogaboam CM. et al., 2005]. Показано, что для некоторых аллергенов, например, аллергенов клещей домашней пыли и тараканов, частота сенсибилизации прямо коррелирует с длительностью контакта [Wahn U. et al., 1997]. У детей, выросших в сельской местности, отмечается сниженная частота развития БА, что может быть связано с наличием- в окружающей среде эндотоксина [Braun-Fahrlander С, 2003]. Инфекции. С формированием астмы связывают различные вирусные инфекции. Например, респираторно-синцитиальныи вирус и вирус парагриппа формируют симптоматику, во многом напоминающую проявления БА у детей [Sigurs N. et al., 2000; Gern J.E. et al., 2002]. Однако, в соответствии с «гипотезой гигиены» развития БА, контакт с инфекциями в раннем детстве, наоборот, способствует развитию иммунной системы по «неаллергическому» пути [Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы, 2007].
Профессиональные сенсибилизаторы. Известно свыше 300 веществ, взаимосвязанных с развитием профессиональной БА, которую определяют как БА, обусловленную контактом с аллергеном на рабочем месте. К профессиональным сенсибилизаторам относятся вещества с низким молекулярным весом и высокой активностью, например изоцианаты -ирританты, способные вызывать бронхиальную гиперреактивность; соли платины, известные своей аллергенностью, а также сложные биологические вещества растительного и животного происхождения, стимулирующие выработку IgE [Chan-Yeung М. et al., 1999; Fabbri L.M. et al., 1997]. Профессиональной БА, главным образом, заболевают взрослые: по оценкам, профессиональные сенсибилизаторы служат причиной примерно каждого десятого случая БА у взрослых трудоспособного возраста [Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы, 2007].
Неоднократно предпринимались попытки классифицировать- БА- на основе этиологии заболевания. В России выделяют традиционно атопическую (аллергическую) и инфекционно-атопическую (неаллергическую) формы бронхиальной астмы, а также смешанный, ее вариант [Под ред. Чучалина А.Г., 2005]. В западной литературе наибольшее распространение получила классификация,. предложенная Rackeman (1944), согласно которой выделяют экзогенную и эндогенную формы БА [Под ред. Чучалина А.Г., 2008]. У подавляющего большинства детей (более 90%) имеет место аллергическая форма бронхиальной астмы [Под ред. Чучалина А.Г., 2008].
В то же время с практической точки зрения наиболее востребована классификация бронхиальной астмы по тяжести, что очень важно, так как определяет современную стратегию ее терапии. Оценка тяжести течения заболевания осуществляется врачом на основании критериев тяжести, с обязательной оценкой функциональных параметров: ФЖЕЛ (форсированная жизненная емкость легких), отношения ОФВ1/ФЖЕЛ (объем форсированного выдоха за 1 секунду/форсированная жизненная емкость легких), суточной вариабельности ПСВ (пиковая скорость выдоха).
Основные критерии тяжести течения бронхиальной астмы: характеристика дневных и ночных симптомов; переносимость физических нагрузок; частота применения Рг-агонистов короткого действия; значения ПСВ или ОФВ1; суточные колебания ПСВ. На основании данных показателей выделяют четыре степени тяжести бронхиальной астмы: 1. легкая интермиттирующая; 2. легкая персистирующая; 3. среднетяжелая персистирующая; 4. тяжелая персистирующая [Под ред. Чучалина А.Г., 2008].
Анализ полиморфных вариантов генов системы биотрансформации с помощью биочипа
Функционально значимыми считаются полиморфные локусы, кодирующие изменения аминокислотной последовательности а-цепи рецептора IL4: во внеклеточном домене (ІІеЗОУаІ) и в цитоплазматическом домене (Pro503Ser и Gln576Arg) [Cui Т. et al., 2003]. Hershey G. К. с соавторами, исследуя генетический вариант Gln576Arg гена IL4RA среди пациентов с аллергическими заболеваниями, установили статистически значимую ассоциацию аллеля IL4RA Arg576 с атопией [Hershey G.K. et al., 1997]. Функциональные исследования показали снижение уровня тирозинфосфатазы SHP1, включающей сигнал терминации транскрицпии гена IL4, и повышенную экспрессию молекул CD23 (FceRII) в мононуклеарных клетках периферической крови у носителей аллеля IL4RA Arg576. Кроме того, полиморфная замена Gln576Arg гена IL4RA приводит к синтезу рецептора с усиленной трансдукцией сигнала [Hershey G.K. etal., 1997]. Противоречивым этому оказался результат в исследованиях Kruse S., в чьих работах была показана ассоциация IL4RA Arg576 аллеля с пониженным уровнем IgE в немецкой популяции. В результате функциональных исследований было выявлено, что однонуклеотидные замены IL4RA Arg576 и IL4RA Pro503 в сочетании могут влиять на конформацию рецептора и менять путь передачи сигнала, что приводит к уменьшению уровня IgE [Kruse S. et al., 1999b].
Mitsuyasu H. с соавторами в 1998 году идентифицировали полиморфный вариант Ile50Val, локализованный во внеклеточном домене а-цепи рецептора IL4. Было показано, что у японцев Пе50 аллель ассоциирован с аллергической астмой и с повышенным уровнем общего и специфичного к аллергенам домашней пыли IgE [Mitsuyasu Н. et al., 1998; Mitsuyasu H. et al., 1999]. Функциональные исследования на В-клеточных линиях мышей и человека, трансфецированных кДНК, выявили, что аллельный вариант IL4RA 50Ile повышает синтез IgE в клетках и усиливает активацию STAT6, который является неотъемлемым компонентом 1Ь4-сигнального пути [Mitsuyasu H. et al., 1998; Mitsuyasu H. et al., 1999]. В то же время не обнаружена ассоциация полиморфных вариантов Ile50Val и Gln576Arg с астмой/атопией у жителей Японии в исследованиях других авторов [Noguchi Е. et al., 1999].
Ген фактора некроза опухолей-а (TNFA). TNFa относится к провоспалительным цитокинам суперсемейства TNF. В экспериментах in vivo он способен вызывать некроз опухоли у мышей, вследствие чего название фактор некроза опухоли (TNF). TNFa секретируется многими типами клеток, главным образом, макрофагами, дендритными клетками, Т-лимфоцитами, моноцитами, В-клетками, тучными клетками и эозинофилами [Ярилин А.А., 1999]. При атопическом воспалении TNFa контролирует степень инфильтрации стенки бронхов нейтрофильными гранулоцитами, участвует в регуляции экспрессии молекул адгезии, ответственных за избирательную адгезию эозинофилов в очаге воспаления, то есть является медиатором, ответственным за развитие поздней фазы аллергической реакции [Зайцева О.В. и др., 2000]. Действуя в совокупности, эти факторы приводят к микроизменениям сосудов стенок воздухоносных путей, сокращениям гладкой мускулатуры бронхов, гиперсекреции слизи. Кроме того, TNFa способен стимулировать мезенхимальные клетки, такие как фибробласты и гладкомышечные клетки, что играет важную роль в патогенезе ремоделировании стенок дыхательных путей [Russo С. et al., 2000; Kips J.C., 2001]. Ряд исследований показал, что больные бронхиальной астмой имеют повышенный уровень TNFa в клетках бронхеальвеолярного лаважа, в образцах биопсии, в слюне [Broide D.H. et al., 1992; Cembrzynska-Nowak M. et al., 1993]. Следовательно,.центральная роль атопического воспаления в астме и повышенный- уровень TNFa у астматиков- предполагает, что функциональные варианты гена TNFA играют важную роль при бронхиальной астме.
Ген TNFA картирован в пределах III кластера генов главного комплекса гистосовместимости (МНС) на коротком плече 6 хромосомы (6р21.1-21.3) [Dunham 1. et al., 1987]. В большинстве работ отмечено, что однонуклеотидная замена G на А в 308 положении промотора гена связана с повышенной экспрессией гена TNFA in vitro, а присутствие аллеля TNF -308А - с высокой продукцией цитокина [Wilson A.G. et al., 1997; Chagani Т. et al, 1999].
Полиморфный локус -308G A гена TNFA исследовался многократно в различных популяциях (европеоидных, восточно-азиатских и южноазиатских) на наличие ассоциации с бронхиальной астмой и атопией, однако, результаты оказались противоречивыми. В девяти из этих исследований выявлена достоверная ассоциация аллеля TNFA -308A с астмой и атопией, в одной работе опубликованы данные о значимой ассоциации аллеля TNFA -308G с астмой, в то время как в пяти работах авторы не обнаружили ассоциации -308G A полиморфного варианта гена TNFA с развитием заболеваний [Gao J. et al., 2006]. В европеоидных популяциях была обнаружена значимая ассоциация полиморфного варианта TNFA (-308G A) со средней степенью тяжести бронхиальной астмы, а также с БА, ведущей к летальному исходу [Chagani Т. et al., 1999]. У пациентов с назальным полипозом, проживающих в Турции, генотип TNFA -308G/A был выявлен маркером повышенного риска [Erbek S.S. et al., 2007]. Исследования, проведенные Moffatt M.F. с соавт. показали, что два гаплотипа, содержащих аллель TNFA -308A (LTcNcoI l/TNF-308 2/HLA-DRBl 03 и LTaNcoI l/TNF-308 2/HLA-DRBl 02) ассоциированы с развитием астмы у семей из Австралии [Moffatt M.F. et al., 2007]. Две большие европейские популяции численностью в И тыс.. человек (представленные SAPALDIA -Швейцарским когортным исследованием -загрязнения, воздуха и легочных, сердечных заболеваний у взрослых и ECRHS — Европейским респираторным сообществом охраны здоровья) были прогенотипированы по полиморфному локусу -308G A гена TNFA [Castro-Giner F. et al., 2008].
Анализ полиморфного локуса -590С Т гена IL4 у больных бронхиальной астмой и в контрольной группе
Проведен анализ однонуклеотидной замены -590С Т, локализованной в промоторной области гена IL4, у больных БА и здоровых индивидов из РБ (табл. 3.1-3.5). Учитывая неоднородность населения Республики Башкортостан в этническом отношении, в исследуемые выборки включены индивиды наиболее многочисленных этнических групп Башкортостана: русских, татар- и башкир. Представлено распределение частот аллелей и генотипов данного полиморфного варианта и в выборке лиц смешанной этнической принадлежности (табл. 3.1). В работе проведено- сравнение распределения частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов, как между контрольными группами, так и между выборками больных БА и контроля соответствующей этнической принадлежности.
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса 590С Т гена IL4 в сравниваемых контрольных группах представлено в табл.
В изученных нами выборках преобладал аллель IL4-590 C, частота которого составила 60,78% у башкир, 67,03% у татар и 74,59% у русских (табл. 3.1). В выборке здоровых индивидов смешанной этнической принадлежности данный аллель был выявлен в 69,05% случаев. Частота распространенности аллеля IL4-590 C в различных популяциях мира значительно снижается с Запада на Восток: от 82%-86% в европейских, 33% 46% в афро-американской до 27%-30% в азиатских популяциях [Noguchi Е. et al., 1998; Burchard E.G. et al., 1999; He J.Q. et al., 2003; Basehore M.J. et al., 2004; Chiang C.H. et al., 2007]. Обнаружено, что у башкир аллель IL4-590 C встречается достоверно реже по сравнению с русскими (х 6,59, р=0,01). По распределению частот генотипов данного локуса башкиры также достоверно отличаются от русских (х =7,79, р=0,02) (табл. 3.2). При попарном сравнении обнаружена более высокая частота генотипа IL4-590 C/C и более низкая частота генотипа IL4-590 T/T у русских (53,28% и 4,10%) по сравнению с башкирами (35,29%, %2=4,66, р=0,03 и 13,73%, %2=5,16, р=0,02, соответственно).
Различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса -590С Т гена IL4 были статистически значимы между пациентами и здоровыми индивидами русской этнической принадлежности (х2=4,70, р=0,03, x2=6j66, р=0,04) (табл. 3.2). У больных БА русской этнической принадлежности частота генотипа IL4-590 T/T оказалась.значительно выше (12,57%), чем в контрольной группе (4,10%, х2=6,24, р=0,01, OR=3,36, 95%CL 1,24-9,15) (табл. 3.1). В группе русских индивидов, больных Б А,, отмечается, повышение частоты встречаемости аллеля JL4-590 T (33,71%).по сравнению с контролем (25,41%, х =4,69; р=0,03), и снижение-частоты аллеля IL4-590 G (66,29% и 74,59%, соответственно). Таким образом, аллель IL4-590 T Таблица 3.1.
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта -590С ТтеяаИ4 у больных БА и здоровых индивидов различной этнической принадлежности IL4 Русские сБА Русские контроль Татары сБА Татары контроль Башкиры сБА Башкиры контроль Метисы сБА Метисы контроль п, p,±sp, С1% п, p,±sp, С1% п, p,±Sp, С1% П p,±Sp, С1% п, p,±Sp, С1% п, p,±Sp, С1% п, p,±Sp, С1% п, p,±sp, С1% С/С 79 45,14±3,76 (37,62-52,83) 65 53,28±4,52 (44,03-62,36) 38 37,25±4,79 (27,88-47,39) 42 46,15±5,23 (35,64-56,92) 25 38,46±6,03 (26,65-51,36) 18 35,29±6,69 (22,43-49,93) 60 39,74±3,98 (31,87-48,01) 31 49,21±6,30 (36,38-62,11) С/Т 74 42,29±3,73 (34,87-49,97) 52 42,62±4,48 (33,72-51,90) 52 50,98±4,95 (40,89-61,01) 38 41,76±5,17 (31,50-52,57) 32 49,23±6,20 (36,60-61,93) 26 50,98±7,00 (36,60-65,25) 74 49,01±4,07 (40,79-57,26) 25 39,68±6,16 (27,57-52,80) Т/Т 22 12,57±2,51 (8,05-18,41) 5 4,10±1,80 (1,34-9,31) 12 11,76±3,19 (6,23-19,65) 11 12,09±3,42 (6,19-20,60) 8 12,31±4,08 (5,47-22,82) 7 13,73±4,82 (5,70-26,26) 17 11,26±2,57 (6,70-17,41) 7 11,11±3,96 (4,59-21,56) N 175 122 102 91 65 51 151 63 С 232 66,29±2,53 (61,07-71,22) 182 74,59±2,79 (68,64-79,93) 128 62,75±3,38 (55,72-69,40) 122 67,03±3,48 (59,69-73,81) 82 63,08±4,23 (54,17-71,37) 62 60,78±4,83 (50,62-70,31) 194 64,24±2,76 (58,55-69,65) 87 69,05±4,12 (60,20-76,98) Т 118 33,71±2,53 (28,78-38,93) 62 25,41±2,79 (20,07-31,36) 76 37,25±3,38 (30,60-44,28) 60 32,97±3,48 (26,19-40,31) 48 36,92±4,23 (28,63-45,83) 40 39,22±4,83 (29,69-49,38) 108 35,76±2,76 (30,35-41,45) 39 30,95±4,12 (23,02-39,80) Примечание здесь и далее: п, - численность групп; N - объем выборки; р, - частота генотипа (аллеля); sp - ошибка р„ С1% -доверительный интервал. Таблица 3.2. Анализ гетерогенности сравниваемых групп больных БА и здоровых индивидов по распределению частот аллелей и генотипов -590С Т полиморфного варианта гена IL Сравниваемые группы по частотам аллелей по частотам генотипов х2 p(df) х2 p(df) контроль (русские)/контроль (татары) 2,91 0,09 (1) 4,97 0,08 (2) контроль (русские)/контроль (башкиры) 6,59 0,01 (1) 7,79 0,02 (2) контроль (русские)/контроль (метисы) 1,29 0,26 (1) 3,37 0,19(2) контроль (татары)/ контроль (башкиры) 1,12 0,29(1) 1,60 0,45 (2) контроль (татары)/контроль (метисы) 0,14 0,71 (1) 0,14 0,93 (2) контроль (башкиры)/контроль (метисы) 1,70 0,19(1) 2,23 0,33 (2) русские с БА/контроль (русские) 4,70 0,03 (1) 6,66 0,04 (2) татары с БА/контроль (татары) 0,77 0,38 (1) 1,80 0,41 (2) башкиры с БА/контроль (башкиры) 0,13 0,72(1) 0,14 0,93 (2) метисы с БА/контроль (метисы) 0,91 0,34(1) 1,77 0,41 (2) русские с БА/контроль (русские) (до 18 лет) 6,84 0,009 (1) 10,23 0,006 (2) татары с БА/контроль (татары) (до 18 лет) 1,63 0,20 (1) 2,31 0,31(2) русские с БА/контроль (русские) (старше 18) 0,22 0,64(1) 0,29 0,86(2) татары с БА/контроль (татары) (старше 18 лет) 0,07 0,79 (1) 0,75 0,69 (2) Примечание здесь и далее: % (Р) - оценка достоверности различий по распределению частот генотипов между двумя группами. является маркером повышенного риска развития БА (OR=l,49, 95%С1 1,04-2,15), а аллель IL4-590 C можно рассматривать как протективньтй у лиц русской этнической принадлежности (OR=0,67, 95%С1 0,47-0,96).
Установленные ассоциации являются более выраженными у больных русской этнической принадлежности с аллергической формой бронхиальной астмы (х2=9,29, р=0,002, %2=11,99, р=о,002, соответственно) (табл. 3.3). Самая высокая ассоциация с аллергической формой БА была определена для генотипа IL4-590 T/T, который был выявлен с частотой 17,71% у больных и 4,10% в контроле (OR=5,04, х2=Ю,97, р-0,0009, 95%С1 1,78-14,21). Риск развития заболевания повышен и у носителей аллеля IL4-590 T (OR=l,88, 95%CI 1,25-2,83, І=9,29, р=0,002). Гомозиготный генотип IL4-590 C/C и аллель IL4-590 C являются маркерами пониженного риска развития аллергической формы БА (OR=0,57, 95%С1 0,33-0,99, х2=4,04, р=О,04 и OR=0,53, 95%С1 0,35-0,80, х2=9,29, р=0,002).
Распределение частот аллелей и генотипов данного полиморфного варианта в зависимости от степени тяжести заболевания показало, что у больных с тяжелым течением БА русской этнической принадлежности частота генотипа IL4-590 T/T (13,33%) была значительно выше, чем у здоровых индивидов (4,10%, х2==4 56, Р=0,03, OR=3,60, 95%С1 1,04-12,45) (табл. 3.3). Следует отметить, что в литературе имеются данные о взаимосвязи данного полиморфного локуса с тяжестью течения астмы, в частности, уменьшение объема форсированного экспираторного выдоха ассоциировано с аллелем IL4-590 T и генотипом IL4-590 T/ T [Burchard E.G. et al., 1999; Sandford AJ. et al., 2000].
Анализ полиморфного варианта 677С Т гена MTHFR у 155 больных бронхиальной астмой и в контрольной группе
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного варианта 3953С Т гена IL1B в контрольных группах русских, татар, башкир и метисов представлено в табл. 3.19. Нами обнаружено, что в исследуемых группах с наибольшей частотой встречался аллель 1ЫВ 3953С, частота которого у русских составила 79,92%, у татар - 75,82%, у башкир - 80,39% и у метисов -74,60%. Последующий анализ распределения частот аллелей и генотипов 3953С Т полиморфного локуса гена IL1B не выявил достоверных отличий между сравниваемыми контрольными группами (Р 0,05) (табл. 3.20). Аллель IL1B 3953C, по литературным данным, в мировых популяциях также является самым частым: у жителей Японии он встречается с частотой 97,4% [Markova S. et al, 2007], в популяции Китая - 97% [Chou Н.-Т. et al., 2005], и значительно реже в европейских популяциях- 78% [Moos V. et al., 2000].
Сравнение распределения частот аллелей и генотипов данного полиморфного варианта между больными бронхиальной астмой и контрольной группой таюке не продемонстрировало значимых различий ни у русских, ни у татар, ни у башкир, ни в выборке индивидов. смешанной этнической принадлежности (табл. 3.20). В выборке метисов, больных БА, отмечено значительное понижение частоты встречаемости генотипа IL1B 3953C/T (25,19%) по сравнению со здоровыми индивидами (41,27%). Показатель отношения шансов для носителей данного генотипа составил 0,48 (95%С1 0,25-0,91, х2=5,20, р=0,02).
В,табл. 3.21 представлено распределение частот аллелей и генотипов 3953С Т. полиморфного варианта гена IL1B в группах индивидов;, больных БА, до и старше 18 лет, а также в контрольных выборках соответствующей этнической принадлежности. Анализ распределения частот аллелей и генотипов между исследуемыми выборками больных и здоровых индивидов статистически значимых отличий не выявил (табл. 3.20). 106
Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса 3953С Т гена IL1B у больных БА и здоровых индивидов различной этнической принадлежности IL1B Русские сБА Русские контроль Татары сБА Татары контроль Башкиры сБА Башкиры контроль Метисы сБА Метисы контроль Пі Pi±sp, CI% п, Pi±sp, С1% Пі p,d=Sps CI% Пі Pi±Sp, CI% Пі Pi±Sp, CI% Пі p,±Sp, CI% Пі Pi±sp, CI% Пі Pi±sp, CI% С/С 96 62,75±3,91 (54,57-70,42) 76 62,30±4,39 (53,07-70,91) 52 60,47±5,27 (49,34-70,85 52 57,14±5,19 (46,34-67,47) 32 56,14±6,57 (42,36-69,26) 33 64,71±6,69 (50,07-77,57) 87 66,41±4,13 (57,64-74,42) 34 53,97±6,28 (40,94-66,61) С/Т 51 33,33 3,81(25,93-41,40) 43 35,25±4,33 (26,82-44,41) 28 32,56±5,05 (22,84-43,52) 34 37,36±5,07 (27,44-48,13) 21 36,84±6,39 (24,45-50,66) 16 31,37±6,50 (19,11-45,89) 33 25,19±3,79 (18,02-33,52) 26 41,27±б,20 (29,01-54,38) Т/Т 6 3,92±1,57 (1,45-8,34) 3 2,46±1,40 (0,51-7,02) 6 6,98±2,75 (2,60-14,57) 5 5,49±2,39 0,81-12,36) 4 7,02±3,38 (1,95-17,00) 2 3,92±2,72 (0,48-13,46) 11 8,40±2,42 (4,27-14,53) 3 4,76±2,68 (0,99-13,29) N 153 122 86 91 57 51 131 63 С 243 79,41±2,31 (74,44-83,80) 195 79,92±2,56 (74,33-84,76) 132 76,74±3,22 (69,71-82,84) 138 75,82±3,17 (68,94-81,85) 85 74,56±4,08 (65,55-82,25) 82 80,39±3,93 (71,35-87,59) 207 79,01±2,52 (73,57-83,78) 94 74,60±3,88 (66,08-81,93) т 63 20,59±2,31 (16,20-25,56) 49 20,08±2,56 (15,24-25,67) 40 23,26±3,22 (17,16-30,29) 44 24,18±3,17 (18,15-31,06) 29 25,44±4,08 (17,75-34,45) 20 19,61±3,93 (12,41-28,65) 55 20,99±2,52 (16,22-26,43) 32 25,40±3,88 (18,07-33,92) Анализ гетерогенности сравниваемых групп больных БА и здоровых индивидов по распределению частот аллелей и генотипов полиморфного локуса 3953С Т гена IL1B Сравниваемые группы по частотам аллелей по частотам генотипов х2 p(df) х2 p(df) контроль (русские)/контроль (татары) 1,02 0,31 (1) 1,57 0,46 (2) контроль (русские)/контроль (башкиры) 0,01 0,92 (1) 0,46 0,80 (2) контроль (русские)/контроль (метисы) 1,37 0,24 (1) 1,57 0,46 (2) контроль (татары)/ контроль (башкиры) 0,78 0,38 (1) 0,81 0,67 (2) контроль (татары)/контроль (метисы) 0,06 0,81 (1) 0,25 0,88 (2) контроль (башкиры)/контроль (метисы) 1,07 0,30 (1) 1,35 0,51 (2) русские с БА/контроль (русские) 0,02 0,88 (1) 0,52 0,77 (2) татары с БА/контроль (татары) 0,04 0,84 (1) 0,53 0,77 (2) башкиры с БА/контроль (башкиры) 1,04 0.31 (1) 1,03 0,60 (2) метисы с БА/контроль (метисы) 0,95 0,33 (1) 5,45 0,07 (2) русские с БА/контроль (русские) (до 18 лет) 0,13 0,72 (1) 0,87 0,65 (2) татары с БА/контроль (татары) (до 18 лет) 0,79 0,37 (1) 3,26 0,20 (2) русские с БА/контроль (русские) (старше 18) 0,09 0,77 (1) 0,18 0,9Г(2) татары с БА/контроль (татары) (старше 18) 0,41 0,52(1) 0,67 0,71 (2) Следует отметить, что в детской группе пациентов татарской этнической принадлежности обнаружена тенденция к уменьшению частоты гетерозиготного генотипа 1ЫВ 3953С/Т- 23,26% по сравнению с 40,82% - в контрольной группе (х =3,21, р=0,07).
Таким образом, в результате проведенного анализа 3953С Т полиморфного локуса гена IL1B у больных Б А и контро л я из РБ показано; что у лиц смешанной этнической принадлежности риск развитиязаболевания ассоциирован с наличием гетерозиготного генотипа При исследовании Р7У7У?-полиморфного варианта гена IL1RA, локализованного во 2 интроне, из 5 встречающихся аллелей [Hang L.W. et al., 2003] в наших выборках было выявлено четыре аллеля: IL1RA I, IL1RA II, IL1RAVII, IL1RA IVK семь генотипов: IL1RA I/ I, ILIRA I/ II, ILIRA П/ ІІ, ILIRA I/ III, IL1RA II/ III, ILIRA I/ IV и ILIRA II/ IV. В табл. 3.22 представлено распределение частот аллелей и генотипов VNTR полиморфного локуса гена ILIRA в контрольных выборках русских, татар, башкир и метисов, а также частоты аллелей и генотипов данного полиморфного варианта у больных астмой. Наибольшее распространение имеют аллели ILRA I и ILRA II, частота которых составила 66,26% и 31,71% у русских, 72,53% и 24,73% у татар, 73,53% и 25,49%) у башкир, 74,60% и 22,22% у метисов. Частота аллеля ILRA4II была низкой и составила у русских - 2,03%, у татар - 2,75%, у башкир -0,98%, у метисов - 3,17%. Обзор литературных данных показал, что аллель ILRA I встречается в 74,3% случаев в бельгийской популяции [Vijgen L. et al., 2002], в 73,6%у жителей Великобритании [Cullup Н. et al., 2004]; в,75% у жителей Турции [Arman A. et al., 2008] и в 83% в тайваньской популяции [Hang L.W. et al., 2003]. Аллель ILRA II в различных популяциях мира выявляется в среднем в 21-23% случаев, а оставшиеся аллели встречаются менее-чем в 5% случаев [Vijgen L. et al., 2002; Hang L.W. et al., 2003; Cullup H. et al., 2004; Arman A. et al., 2008]. Анализ распределения частот аллелей и генотипов VNTR полиморфного варианта гена IL1RA в этнических группах РБ не выявил статистически достоверных отличий как- между сравниваемыми контрольными! выборками, так и между группами больных БА и здоровыми индивидами соответствующей этнической принадлежности (табл. 3.22, 3.23).
