Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Обзор литературы
1.1. Частота и распространенность фенилкетонурии в популяциях мира - 10
1.2 Возможные механизмы распространения фенилкетонурии 14
1.3 Молекулярные основы фенилкетонурии 16
1.3.1 Метаболизм фенилаланина в организме человека и структура белка фенилаланингидроксилазы 16
1.3.2 Ген фенилаланингидроксилазы человека 18
1.3.3. Мутации гена фенилаланингидроксилазы 20
1.3.4. Полиморфные локусы гена РАН. 25
1.3.5. Распространение мутаций гена фенилаланингидроксилазы в
популяциях мира и их ассоциация с ПДРФчгаплотипами 29
1.4. Клиническая характеристика фенилкетонурии 35
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования
2.1. Материал для исследования 41
2.2. Методы исследования 41
2.2.1. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК 41
2.2.2. Рестрикциониый анализ 44
2.2.3. SSCP-анализ 45
2.2.4. Статистическая обработка результатов 47
ГЛАВА III. Результаты и обсуждение
3.1. Распространенность фенилкетонурии в Республике Казахстан 50
3.2. Исследование мутаций в гене фенилаланингидроксилазы 56
3.3. Анализ полиморфных локусов Mspl(a), Pvullfa), VNTR и STR гена РАН в популяциях Казахстана 67
3.3.1.Анализ распределения частот и генотипов Mspl(a) полиморф ных аллелей генаРАНв популяциях Казахстана 68
3.3.2. Анализ распределения частот и генотипов Pvull(a) полиморфных аллелей гена фенилаланингидроксилазы в популяциях Казахстана 74
3.3.3. Изучение полиморфизма VNTR аллелей и генотипов гена фенилаланингидроксилазы в популяциях Казахстана 79
3.3.4. Изучение полиморфизма STR аллелей и генотипов гена фенилаланингидроксилазы в популяциях Казахстана 87
3.3.5. Генетические расстояния и кластерный анализ популяций Казахстана по данным о полиморфизме VNTR и STR аллелей гена фенилаланингидроксилазы 95
3.3.6. Анализ частот гаплотипов полиморфных Mspl(a), Pvu\T(a), VNTR и STR локусов гена фенилаланингидроксилазы в этнических группах русских и казахов из Казахстана 102
3.4. Изучение распределения частот аллелей и гаплотнпов полиморфных локусов VNTR, М$р\(а), STR и Pvul\(a) гена фенилаланингидроксилазы в семьях с ФКУ из Казахстана 106
3,4.1. Анализ распределения частот аллелей полиморфных локусов VNTR, Mspl(a), STR и Pvuil(a) на нормальных и мутантных хромо сомах 106
3.4.2.Анализ распределения частот гаплотипов гена фенилаланингидроксилазы на нормальных и мутантных хромосомах в семьях с ФКУ 115
3.4.3. Анализ ассоциации различных гаплотипов с мутациями гена фенилаланингидроксилазы 121
3.5. Алгоритм молекулярно-генетической диагностики фенилкетонурии в Республике Казахстан 125
Заключение 128
Выводы 138
Список литературы
- Частота и распространенность фенилкетонурии в популяциях мира
- Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
- Распространенность фенилкетонурии в Республике Казахстан
- Генетические расстояния и кластерный анализ популяций Казахстана по данным о полиморфизме VNTR и STR аллелей гена фенилаланингидроксилазы
Введение к работе
Изучение молекулярных основ моногенных наследственных болезней человека и их распространение в различных регионах мира является актуальной проблемой медицинской генетики и генетики человека, Фенилкетонурия (ФКУ) - это одно из наиболее распространенных тяжелых аутосомно-рецессивных заболеваний, обусловленное наследственным дефектом фермента фенилаланингидроксилазы (РАН). Вследствие накопления и токсического действия фенилаланина и его производных на ткани и, прежде всего, клетки головного мозга, заболевание характеризуется высокой степенью слабоумия и тяжелыми психическими расстройствами, развивающимися у больных при отсутствии бесфенилаланиновой диеты с первых дней жизни.
С введением в практику здравоохранения различных стран мира массового обследования на ФКУ стало возможным изучить частоту и популяцион-но-генетические аспекты данного наследственного заболевания. Частота ФКУ среди новорожденных по данным массового скрининга в различных странах составляет в среднем 1:10000, однако значительно варьирует в зависимости от популяции: от 1:2600 до 1:120000 новорожденных [Aoki К., Wada Y., 1988, Wooetal., 1992, Zschocke J., 2003].
В связи с наличием межпопуляциониых и внутрипопуляционных [Woo et al.,. 1992, Zschocke J., 2003] различий в структуре и частоте ФКУ для эффективной профилактики и лечения данного заболевания представляется необходимым его генетико-эпидемиологическое изучение в Республике Казахстан.
Классическая фенилкетонурия наследуется аутосомно - рецессивно и вызвана мутациями в гене фенилаланингидроксилазы (РАН), локализующегося на длинном плече 12 хромосомы в области q22-q24 [Lidsky et al., 1985]. Кодирующая белок последовательность (кДНК) включает около 90 кб и состоит из 13 экзонов. Большинство изменений в гене РАН, вызывающих заболевание, являются однонуклеотидными заменами, включая миссенс (64%), б сплайсинг (13%) и нонсенс (6 %) мутации и нейтральные полиморфизмы (6%). Почти 20 миссенс-мутаций затрагивают высокомутагенные CpG ди-нуклеотиды. Остальные мутации возникают в результате делеций или инсер-ций различных типов. В настоящее время в гене РАН выявлено более 490 различных мутаций, частота и встречаемость которых характеризуется высокой гетерогенностью и существенными межпопуляционными различиями []. Наиболее распространенной (мажорной) мутацией гена РАН в европейских популяциях является миссенс-мутация R408W, генетический дефект которой связан с заменой С (цитозина) на Т (тимин) в 12 экзоне, ведущей к замене аргинина на триптофан в 408-положении белка РАН.
Различные популяции мира имеют выраженную генетическую гетерогенность по частоте и характеру мутаций гена РАН [Rey et al., 1988; Scriver et al., 1995; Okano et al., 1990, 1998, Eisensmith et al., 1992, Takarada Y, 2003; Аничісина A.A., 2003], что находит отражение в особенностях клинического течения, диагностики и лечения фенилкетонурии. Поэтому в каждой конкретной популяции необходимо изучать частоту и спектр мутаций гена РАН для наиболее эффективной организации медико-генетической службы и ранней диагностики и профилактики этого тяжелого наследственного заболевания [Горбунова, Баранов, 1997, Хуснутдииова, 2005].
В нитронах гена РАН локализованы более 10 ПДРФ-локусов и высокополиморфные мини- и микросателлитные повторы (VNTR и STR), гаплотипы по которым отличаются высокой степенью гетерозиготности и выраженным неравновесием по сцеплению с определенными мутациями гена РАН [Eisensmith et al., 1992, 1995, Tighe О., 2003]. Все это делает анализ полиморфных локусов гена высокоинформативным для проведения пренатальной диагностики и скрининга ФКУ в большинстве популяций. В то же время необходимо отметить, что популяционное разнообразие частоты встречаемости полиморфных локусов гена /М# предполагает обязательное предварительное популяционно-генетическое изучение особенностей полиморфизма исполь- зуемых локусов в выборке здоровых индивидов - жителей исследуемого региона с учетом их этнической принадлежности.
Цель исследования: изучение мутаций и анализ полиморфных локусов в гене фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией, в семьях высокого риска и в популяциях Республики Казахстан.
Задачи:
Изучить распространенность фенилкетонурии в Республике Казахстан по данным ретроспективного анализа и массового неонатального скрининга.
Исследовать спектр мутаций в гене фенилаланингидроксилазы у больных фенилкетонурией из Республики Казахстан.
Провести анализ распределения частот аллелей и генотипов VNTR, Mspl(a), STR и PvMlI(a) локусов гена фенилаланингидроксилазы в популяциях Казахстана.
Проанализировать распределение частот гаплотипов по локусам VNTR, MspUp), STR и PvwII(a) гена фенилаланингидроксилазы в неотягощенных ФКУ семьях.
Провести сравнительный анализ распределения частот аллелей и гаплотипов полиморфных ДНК-локусов VNTR, Msp\{a), STR и PvwII(a) на нормальных и мутантных хромосомах, оценить степень ассоциации мутаций гена фенилаланингидроксилазы с определенными аллелями и гаплотипами в семьях больных фенилкетонурией из РК.
Разработать алгоритм молекулярно-генетической диагностики фенилкетонурии в Республике Казахстан.
Научная новизна: Впервые определена распространенность фенилкетонурии в различных этнических группах, проживающих в Казахстане, по данным ретроспективного анализа и массового неонатального скрининга. Впервые для популяций русских и казахов из Республики Казахстан проанализированы частоты и спектр наиболее распространенных диагностически значимых мутаций гена РАН. Впервые проведено изучение распределения частот аллелей и гаплотипов полиморфных локусов VNTR, Msplfa), STR и Pvn\l(a) гена фенилаланингидроксилазы и определена степень их ассоциации с мутациями гена РАН у больных ФКУ казахской и русской этнической принадлежности, проживающих в Казахстане, что позволило определить информативность и диагностическую ценность данных полиморфных локусов для косвенной ДНК-диагностики фенилкетонурии в РК.
Научно-практическая значимость: Полученные нами данные о распространенности ФКУ могут быть использованы для оценки генетического груза в Республике Казахстан. По результатам молекулярно-генетического анализа определена информативность отягощенных по ФКУ семей для пре-натальной диагностики, сформирован контингент пациентов, нуждающихся в ее проведении. На основании результатов исследования спектра мутаций, частот аллелей и гаплотипов полиморфных ДНК-локусов VNTR, Msplfa), STR и Pvullfa) гена РАН разработан алгоритм пре- и постнатальной диагностики и профилактики ФКУ в Республике Казахстан.
Положения, выносимые на защиту:
Частота и распространенность ФКУ в этнических группах русских и казахов.
Идентификация и частота 4 мутаций в гене РАН у больных ФКУ из Республики Казахстан.
Достоверные различия по распределению частот аллелей и генотипов полиморфных локусов Msplfa), VNTR и STR гена РАН в популяциях русских и казахов между собой и с популяциями Европы и Азии.
Достоверные различия по распределению частот аллелей и гаплотипов полиморфных локусов VNTR, Msplfa), STR и Pvullfa) гена РАН между нормальными и мутантными хромосомами в семьях больных фенилкетонурией из Казахстана.
Ассоциация обнаруженных мутаций гена РАН с определенными гаплоти-пами по полиморфным локусам VNTR, Msplfa), STR и Pvullfa) гена РАН.
Информативность прямой и косвенной ДНК-диагностики для семей с ФКУ из Республики Казахстан.
Разработка алгоритма молекулярно-генетической диагностики фенижетонутжи в Республике Казахстан.
Автор выражает глубокую признательность заведующей лабораторией молекулярной генетики человека ИБГ УНЦ РАН, доктору биологических наук, профессору Хуснутдиновой Эльзе Камилевне за предоставленную возможность проведения научного исследования, ценные советы и, моральную поддержку при обсуждении и подготовке диссертации. Автор благодарит Ахметову Виту Леоновну, научного сотрудника лаборатории, за неоценимую помощь и поддержку при выполнении работы, в написании диссертации, подготовке доклада и презентации, а также весь коллектив лаборатории молекулярной генетики человека за творческую атмосферу научного поиска.
Частота и распространенность фенилкетонурии в популяциях мира
ФКУ - распространенное аутосомно-рецессивное заболевание, вызываемое молекулярными дефектами в гене РАН и характеризующееся умственной отсталостью у больных, не получивших своевременного и адекватного лечения в раннем возрасте. Биохимической основой ФКУ является нарушение нормального гидроксилирования L-фенилаланина в тирозин вследствие дефицита фермента фенилаланингидроксилазы, что ведет к накоплению фенилаланина (ФА) и активации вспомогательных путей его распада [Foiling А, 1971, Кон P.M., 1986]. Следствием дефицита фенилаланингидроксилазы является гипер фенил ал аиинемия (ГФА), которая оказывает токсическое влияние на центральную нервную систему (ЦНС) и ведет к поражению головного мозга.
Заболевание впервые описано в 1934 году норвежским врачом Феллин-гом. В 1938 году он идентифицировал биохимический маркер заболевания, продемонстрировав значительное увеличение содержания ФА в крови и моче больных [Foiling А, 1971]. В 1953 году Джервис установил, что образец печеночной ткани больных ФКУ не катализирует превращение ФА в тирозин. Это открытие позволило не только локализовать метаболический дефект при ФКУ, но и подтвердило представление о необходимости гидроксилирования ФА для дальнейшего окисления до С02 и воды. Пенроуз, Монро и Джервис на основании исследования родословной установили аутосомно-рецессивный тип наследования ФКУ [Jervis G.A., 1954]. В 1954 году Бикелъ, Геррард и Хикманс [Bickel Н., 1987], анализируя первые попытки лечения ФКУ, пришли к выводу, что ограничение потребления ФА с пищей нормализует его уровень в крови и улучшает психомоторное развитие больных. Они предположили, что эффекта лечения можно добиться, вводя диетотерапию в неона-тальном периоде.
В начале 60-х годов, после того как Гатри в 1961 году разработал и начал применять оригинальный микробиологический тест определения концентра ции ФА в крови, стала возможной массовая диагностика ФКУ. С тех пор в различных странах мира с целью ранней диагностики ФКУ и других наследственных дефектов обмена обследованы десятки миллионов новорожденных. Основная цель скринирующих программ - постановка диагноза в пресимпто-матической стадии и введение лечения до нарушения функций органов и систем.
В отечественной литературе ФКУ впервые была описана в 1965 году. [Лебедев Б.В., Блюмина М.Г., 1972]. После этого были опубликованы данные скринирующих программ по ФКУ, результаты которых позволили судить о распространенности данной наследственной патологии на обширной территории бывшего СССР [Степанец А.П., 1988, Цукерман ГЛ., 1986].
Сегодня массовое обследование новорожденных с целью ранней диагностики ФКУ интегрировано в системе медицинского обслуживания большинства стран с высоким уровнем здравоохранения [Schulze A, et al 2002]. Массовое просеивание на ФКУ выявляет все формы ГФА, обогащает медико-генетическими сведениями о генетической гетерогенности и клиническом полиморфизме найденного дефекта. Неонатальный скрининг на ФКУ позволяет обнаружить ряд доброкачественных ГФА у новорожденных. Научный вклад массовых программ по ФКУ оказался не менее велик, чем практический. Успешное функционирование скрининга новорожденных в течение 35 лет позволило определить частоту и геногеографию ФКУ во многих популяциях, причем эти данные тем достовернее, чем больший объем обследованной популяции. ФКУ стала одной из самых информативных моделей в попу-ляционной генетике человека [Гинтер Е.К., 1982].
Наибольшую распространенность ФКУ получила у лиц европеоидной расы, однако и у них ее частота существенно варьирует в различных регионах и этнических группах (табл. 1). По данным европейских центров скрининга ФКУ, частота заболевания в восточно-европейских популяциях выше, чем в популяциях Западной и Юго-Западной Европы. В северной Европе понижается градиент частоты ФКУ с запада на восток - от Ирландии до
Финляндии, при этом Норвегия и Швеция имеют промежуточное значение частоты. Большинство граничащих между собой центрально-европейских стран имеют весьма схожую частоту ФКУ. Предполагается, что для западной Европы центром происхождения ФКУ является Ирландия [Veale А., 1980]. В скандинавских популяциях частота ФКУ исключительно низка, особенно в Финляндии (1:100 000) [Guldberg et al., 1995] и в Швеции (1:22 000-1:30 000) [Svensson Е, 1991, 1993]. Показатели неонатального скрининга ФКУ в США (1:8 000) вполне сопоставимы с частотами в большинстве популяций Европы [DiLella et al., 1986, Hofmann К. J., 1991, Aulehla-Scholz С et al, 2003]. Самая высокая частота ФКУ наблюдается в Турции (1:4 172) [Ozalp et al., 2001], что объясняется авторами высокой частотой носительства гена ФКУ и высокими значениями инбридинга в популяции. В других обследованных азиатских по пуляциях установлена значительная вариация частот ФКУ: в Израиле 1:8 649 [Thalhammer О. et al, 1986], в Китае - 1:16000 [Chen B.G. etal, 1989], в Японии 1:80500 [Kimura et al, 2001, Аокі К., 2003]. Остальные страны по частоте ФКУ занимают промежуточное положение между этими точками.
В конце 70-х годов в Белоруссии, Литве и Латвии в рамках республиканского здравоохранения было учреждено массовое просеивание на ФКУ всех новорожденных. В РФ реальное введение скрининга на ФКУ начато с 90-х годов, среди обследованных новорожденных ФКУ выявлена с частотой 1:6950 [Банков А.Д. и др, 1996, Зелинская Д.Н. и др., 1996]. В таблице 2 представлены результаты популяционно-генетического исследования ФКУ в странах СНГ, демонстрирующие высокую частоту заболевания в Европейской части бывшего СССР, в популяциях с преимущественно славянским населением. Так, частота ФКУ в Белоруссии составила 1:5963 новорожденных, Эстонии - 1:6000, Украине - 1:6758, Литве - 1:9 300, Республике Молдова -1:9 000, Латвии - 1:8 170, в Республике Башкортостан - 1:10707 [Магжанов, 1994]. В Санкт-Петербурге частота ФКУ (1:7600) сходна с частотой в Москве (1:8315). Из азиатских популяций бывшего СССР минимальная частота ФКУ определена в Таджикистане, она составляет 1:19000, но, по мнению авторов, истинная популяционная частота ФКУ остается невыясненной, т.к. значительное количество выявленных с ГФА новорожденных не явилось на уточняющее обследование [Жильцова И.В., 1990, Пилосов, 1990]. Таким образом, имеющиеся в литературе эпидемиологические данные показывают, что распространенность ФКУ в настоящее время изучена не достаточно. Отсутствуют сведения по многим странам мира, особенно, азиатского, африканского и южноамериканского регионов, хотя имеющиеся отдельные данные в популяции монголоидной (Япония, Китай, Корея) и негроидной (негры США и ЮАР) рас показывают их значительное отличие их от популяций европейской расы.
Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК
Для исследования использованы образцы ДНК больных с клиническим диагнозом «фенилкетонурия», состоящих на учете в медико-генетической консультации Городского центра репродукции человека г. Алматы, медико-генетических консультациях г.г. Тараз, Караганда, Кустанай, Павлодар, членов их семей, а также здоровых доноров, проживающих в Республике Казахстан. Материал для исследования собран в лаборатории медицинской генетики Республиканского научно-исследовательского центра охраны здоровья матери и ребенка, г. Алматы в 2003-2005 гг. Обследовано 25 больных ФКУ из 20 семей. По этнической принадлежности семьи распределились следующим образом: 5 казахских семей (25%), 13 русских семей (65%), 1 азербайджанская семья и 1 уйгурская семья (по 5%). Диагноз «фенилкетонурия» устанавливался на основании данных клинического и биохимического обследования врачами Городского центра репродукции человека г.Алматы, медико-генетических консультаций г.г. Тараз, Караганда, Кустанай, Павлодар.
Выборка здоровых доноров представлена жителями Республики Казахстан: 201 неродственных представителей казахской этнической принадлежности (выборка набиралась из представителей всех трех казахских жузов), 60 неродственных представителей русской этнической принадлежности.
С целью анализа распределения частот гаплотипов полиморфных локу-сов гена РАН на нормальных хромосомах было исследовано 30 русских и 30 казахских семей, проживающих на территории Республики Казахстан. Забор крови производили после медицинского осмотра у взрослых жителей, принадлежащих к разным семьям, что позволяет рассматривать выборки случайными для популяций.
Выделение ДНК из периферической крови обследуемых проводилось солевым методом с последующей хлороформ-фенольной очисткой и тести рованием на 3% агарозном геле с различными концентрациями фага X [Miller S.AetaI,1988].
Для анализа мутаций 165Т, IVSWM546, R261Q, R261P, R252W, R252G, R252Q, R408W, IVS12ntl, R158Q, P281L гена РАН использовали диагностический набор праймеров и рестриктаз PCU-8, производства ООО "Центр молекулярной генетики", г.Москва. Реакция проведена в 25 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH4 2 S04,, 1,5мМ MgCl2, 0,01% Tween-20, ОД мкг геномной ДНК, по 10 пМ специфического праймера, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной ДНК-полимеразы. ГШР проводили по схеме: начальная денатурация (94С, 5 мин.); 30 циклов амплификации со следующими параметрами: 1) денатурация -94С, 45 секунд; 2) отжиг - 58С, 45 секунд; 3) синтез - 72С, 45 секунд; после чего проводили инкубацию при 72С в течение 7 минут.
Анализ полиморфных Mspl(a), Pvull(a), VNTR и STR аллелей гена РАН проводили методом полимеразной цепной реакции (ПНР) синтеза ДНК на амплификаторе производства компании "ДНК-технология" с использованием ДНК-полимеразы Themras aquaticus производства фирмы "Силекс М".
Амплификацию Mspl(a) аллелей гена РАН проводили с использованием праймеров, последовательности которых были взяты из работы Wedemeyer с соавт. (1991) (табл.8). Реакция проведена в 30 мкл общего объема смеси, содержащей 67 мМ трис-HCl (рН 8,8), 16,6 мМ (NH S04,, 1,5мМ MgCl2, 0,01% Tween-20, ОД мкг геномной ДНК, по 10 пМ каждого праймера, по 200 мкМ dATP, dGTP, dCTP, dTTP и 1 единицу активной ДНК-полимеразы. Режим амплификации был следующим: начальная денатурация (94С, 5 мин.), 30 циклов амплификации: 1) денатурация - 94С, 1 мин.; 2) отжиг - 55С, 1 мин.; 3) синтез - 72С, 1 мин.; элонгация (72С, 10 мин.).
Для амплификации Pvull(a) локуса гена РАН были использованы прай-меры, предложенные Dworniczak. с соавт. (1989) (табл.8). Реакционная смесь не отличалась от вышеописанной. Режим амплификации был следующим: начальная денатурация (94С, 4 мин.), 28 циклов амплификации: 1) денатурация - 94C, 45 сек.; 2) отжиг - 63C, 45 сек.; 3) синтез - 72C, 45 сек,; элонгация (72С, 10 мин.).
Амплификацию VNTR и STR аллелей гена РАН проводили с использованием праймеров, последовательности которых были предложены Goltsov с соавторами (1992, 1993) (табл.8). Реакционная смесь не отличалась от вышеописанных. Режим амплификации был следующим: начальная денатурация (94С, 4 мин.); 29 циклов амплификации: 1) денатурация - 94С, 45 сек.; 2) отжиг - 55С, 45 сек.; 3) синтез - 72С, 1 мин.; элонгация (72С, 10 мин.). Результаты амплификации VNTR, Mspl(a) и Pvullfa) аллелей гена РАН оценивались путем проведения вертикального электрофореза в 7%-ном полиакрила-мидном геле (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида 29:1) при напряжении 250 В в течение пяти часов. В качестве электрофорез-ного буфера использовали IxTBE (трис-боратный буфер). По окончании электрофореза гель окрашивали раствором бромистого этидия (0,1мкг/мл) в течение 15 минут и фотографировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Размеры аллелей определяли путем одновременного электрофореза с ДНК фага X, гидролизированного рестриктазой Pst I. Результаты амплификации STR аллелей гена РАН оценивались путем проведения вертикального электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле (исходное соотношение ак риламида и метиленбисакриламида 29:1) при напряжении 100В в течение 14 часов. Остальные условия соответствуют описанным для идентификации других локусов гена РАН.
Распространенность фенилкетонурии в Республике Казахстан
Основные климатогеографические, демографические и этнические характеристики Республики Казахстан
Географическое положение. Казахстан расположен на стыке двух континентов - Европы и Азии, между 45 и 87 градусами восточной долготы, 40 и 55 градусами северной широты. Географический центр европеиско-азиатского субконтинента находится именно в Казахстане (на пересечении 78 меридиана с 50 параллелью). Казахстан занимает площадь, равную 2724,9 тыс.кв.км и раскинулся к востоку от Каспийского моря и приволжских равнин до горного Алтая от предгорий Тянь-Шаня на юге и юго-востоке до Западно-Сибирской низменности на севере. На востоке, севере и северо-западе Казахстан граничит с Россией, на юге - с государствами Центральной Азии -Узбекистаном, Кыргызстаном и Туркменистаном, а на юго-востоке - с Китаем.
Природные условия. Более четверти территории страны занимают степи, половину - пустыни и полупустыни, остальную четверть - горы, моря, озера и реки. Основными свойствами климата страны являются его резкая континен-тальность и неравномерное распределение природных осадков.
Таким образом, территория Казахстана характеризуется сложным ландшафтом и суровыми природно-климатическими условиями. Эти факторы способствовали неравномерной заселенности территории, а пустыни и горные массивы способствовали территориальной изоляции населения, что, в конечном итоге, способствовало подразделенности населения республики.
Демография. Казахстан является одной из малонаселенных стран мира -6,1 человек на 1 кв.км. Всего здесь проживают 14,952 млн. человек, из которых почти 53,4% составляют казахи, около 30% - русские. В стране прожи вают представители 120 национальностей и народностей - украинцы, немцы, узбеки, татары и другие.
Этнические характеристики. Среди двух тысяч этносов (наций и народностей) мира казахи по численности занимают 70-е место. Сейчас в Казахстане проживают около 8 млн. казахов.
Казахи представляют переходную от европеоидной к монголоидной южносибирскую расу. Метисационную концепцию южносибирской расы обосновали и описали в своих работах Левин М.Г. (1951, 1954) и В.В. Гинзбург (1951, 1952), считавшие, что европеоидные черты южносибирской расы восходят к эпохе бронзы, к андроновскому антропологическому типу. Казахская этническая группа образовалась из коренного, издревле обитавшего на данной территории населения [СП. Толстова и др., 1962]. В эпоху бронзового века на территории современного Казахстана обитали субстратные индоиранские племена, оказавшие существенное влияние на формирование этногенеза казахов. В литературе представлена разносторонняя антропологическая характеристика казахов по палеоантропологическим [Исмагулов О., 1970], соматологическим [Гинзбург В.В., 1952.], гематологическим [Исмагулов О., 1974.], одонтологическим [Зубов А.А., 1973] и дерматоглифическим [Гладкова Т.Д., 1964.; Хить Г.Л., 1964.] данным, все исследователи пришли к выводу, что казахи занимают промежуточное положение между европеоидами и монголоидами с нарастанием интенсивности монголоидного компонента с сакского времени (VII-IV вв. до н.э.) вплоть до XVI в. Лингвистически казахи принадлежат к казахской языковой подгруппе кыпчакской группы западной ветви тюркской группы алтайской языковой семьи.
Исследования, проведенные по некоторым локусам ядерной ДНК и гап-логруппам митохондриальной ДНК с целью оценки степени родства и генетических взаимоотношений изученных популяций с другими народами мира [Абдуллаева, 2004, Салимова, 2004, Березина, 2005] также показали, что популяция казахов занимает промежуточное положение между популяциями Европы и Азии.
Русские в значительном числе переселились в Казахстан в конце 19 века из центральной России, Поволжья, а большое их число переместилось в 30-е, 40-е и 50-60-е годы 20 столетия из всех регионов бывшего Советского Союза в целях создания индустриальной базы, в период эвакуации в годы Великой Отечественной войны, а также для освоения целинных и залежных земель в Казахстане [Нац. Энциклопедия, 2001].
Частота и распространенность фенилкетонурии в Республике Казахстан.
Известно, что наиболее надежные данные в отношении частоты и распространенности наследственного заболевания в отдельных популяциях могут быть получены при осуществлении массовых скрининговых программ.
В Республике Казахстан массовый скрининг новорожденных на фенил-кетонурию был внедрен в 1989 году, с помощью микробиологического теста Гатри, Проведение скрининга было начато в г. Алматы, к 1991 году был внедрен диагностический комплекс фирмы Labsystems (Финляндия) по определению фенилаланина в сухих пятнах крови методом количественной флуо-риметрии. Все роддома города были охвачены массовым обследованием, которое проводилось регулярно до 1996 года, когда из-за отсутствия реактивов и тест-бланков было прекращено вплоть до 2000 года. Остальные регионы Казахстана так и не были полностью охвачены скринингом, обследование проводилось селективно и не в полном объеме, в результате чего больные выявлялись на 2-3 году жизни после неоднократных обращений к невропатологу и другим специалистам. Исходя из вышесказанного, г.Алматы является единственным регионом Казахстана, который на протяжении нескольких лет был достаточно полно охвачен скринингом новорожденных на ФКУ, что дает возможность предварительно оценить частоту заболевания в республике. По результатам скрининга, проводившегося с 1989 по 1997гг. в Городском Центре репродукции человека, частота фенилкетонурии в г. Алматы составляет 1:6980 (табл 10).
Генетические расстояния и кластерный анализ популяций Казахстана по данным о полиморфизме VNTR и STR аллелей гена фенилаланингидроксилазы
В популяционно-генетических исследованиях для анализа эволюционных взаимоотношений близко родственных видов или популяций широко используются данные о характере распределения частот аллелей разных ло-кусов ядерного генома. Для это рассчитываются генетические расстояния и на основе полученных данных строится дендрограмма генетических взаимоотношений. В 1983 г. Nei с соавт. изучили относительные достоинства и недостатки разных вариантов расчета генетических расстояний для получения наиболее точной топологии дендрограммы. В качестве исходящей гипотезы использовалась модель бесконечного ряда аллелей (Infmite-allele model, IAM) [Kimura and Crow, 1964], согласно которой вновь возникшие мутантные аллели всегда отличаются от уже имеющихся в данной популяции аллелей. Данная модель оказалась эффективной для анализа классических генетических маркеров, таких как полиморфные белки и группы крови [Nei, 1987].
В последние годы для изучения генетических взаимоотношений между относительно близкими популяциями все шире используются микросателлитные ДНК локусы [Bowcock et al., 1994; Roy et al., 1994; Deka et al., 1995]. Применение этих ДНК-маркеров возможно при соблюдении условия соответствия ступенчатой мутационной модели (stepwise mutation model, SMM), предложенной для микросателлитных локусов Ohta и Kimura в 1993 г. Для оценки генетических расстояний при анализе микросателлитных локусов Goldstein с соавт. (1995) и Shriver с соавт. (1995) предложили новые способы расчета. Однако преимущества и недостатки этих оценок по сравнению с предложенными ранее пока не ясны.
При проведении кластерного анализа мы исходили из предположения о том, что использованные мини- и микросателлитные локусы удовлетворяют условию SMM мутационной модели, хотя на практике это предположение не всегда сохраняется. Это происходит вследствие, как минимум, трех известных причин. Во-первых, мутации иногда приводят к нуклеотидным заменам, требующим два или более ступенчатых изменения [Weber and Wong, 1993]. Во-вторых, существует проблема нерегулярности возникновения мутационных изменений, благодаря чему появляется большая вариабельность в накоплении того или иного типа повторов [Forbers et al., 1995; Garza et al., 1995; Goldstein et al., 1995]. И, в-третьих, некоторые локусы характеризуются высоким уровнем полиморфизма в одних популяциях и низким в других.
Несмотря на вышеперечисленные недостатки, микросателлитные локусы широко используются для анализа генетических взаимоотношений относительно близких популяций, так как в отличие от классических ДНК-маркеров, при анализе микросателлитных локусов представляется возможным исследовать одновременно несколько полиморфных участков.
Для определения степени генетической близости популяций Казахстана с популяциями, описанными ранее, нами рассчитаны генетические расстояния с использованием частот VNTR и STR аллелей гена РАН (табл. 30). На основе полученных матриц был проведен кластерный анализ и построены соответствующие дендрограммы (рис. 24). Кластерный анализ генетических взаимоотношений между исследоваными популяциями Казахстана и некоторыми популяциями Волго-Уральского региона, проведенный по оценкам Dm и Fst [Nei et al.,1983; Latter, 1972] показал высокую однородность по изученным локусам популяции казахов и башкир, объединившихся в один кластер (рис. 24, а, в). Остальные популяции присоединялись одна за другой к этому кластеру. Близкими оказались популяции русских Республики Казахстан и мордвы, также образующие кластер, присоединившийся предпоследним. Интересно, что популяции русских Казахстана и Волго-Уральского региона не объединились в один кластер, что свидетельствует о некоторой генетической дифференциации этих популяций. На самой последней ступени ко всем популяциям присоединились удмурты, демонстрируя, тем самым, свою существенную генетическую отдаленность по данным полиморфным системам.
На дендрограмме, построенной на основе расчетов показателя Ds [Nei, 1972], картина взаиморасположения народов Казахстана и Волго-Уральского региона несколько меняется (рис. 24, б). Наиболее генетически близкими оказались башкиры и русские РБ, к их кластеру вновь присоединились казахи. Далее популяции объединяются последовательно одна за другой, лишь русские РК и марийцы соединились в один в кластер. Удмурты по-прежнему остались обособленными от остальных популяций.
Как видно из дендрограммы, построенной на основе расчета показателя (5ц.) , популяции разделяются на три ветви. Первую образуют казахи и марийцы, вторую - башкиры, чуваши и татары, коми и русские РБ присоединяются отдельно, а третью ветвь образуют мордва и русские РК. Однако, объединение всех ветвей происходит на небольшом генетическом расстоянии, что свидетельствует о генетической близости этих популяций по исследованным локусам. Популяция удмуртов и на этой дендрограмме стоит обособленно от остальных народов. Полученная по всем четырем показателям картина, в принципе, согласуется с данными этнографии об общности тюркских (казахи, башкиры, татары) и финно-угорских (марийцы, коми, мордва) народов. Объединение в один кластер мордвы и русских можно легко объяснить близостью географического положения мордвы к славянским народам, способствующих метисации данных этносов. Популяция удмуртов стоит обособленно, присоединяясь ко всем ветвям самой последней, демонстрируя существенную генетическую отдаленность, что согласуется с данными, полученными при изучении частот гаплогрупп митохондриальной ДІЖ у народов Волго-Уральского региона для оценки степени родства и генетических взаимоотношений этой популяции с другими народами мира [Бермишева М., 2002].
