Введение к работе
Актуальность проблемы
Всемирная организация здравохранения (ВОЗ) прогнозирует увеличение заболеваемости мелиоидозом и связывает это, в частности, с увеличением посещаемости эндемичных по инфекции областей [Wilson D.R. et al., 1993]
Мелиоидоз отличается многообразием клинических проявлений, поэтому даже в эндемичных регионах первичный диагноз редко бывает верным. Легочная форма этого заболевания занимает особое место, так как характеризуется тяжелым течением и высокой летальностью. Не исключено, что больные с мелиоидозной пневмонией, интенсивно выделяющие инфект в окружающую среду, представляют эпидемическую опасность [Borgherini G. et al., 2006; Currie B.J. et al., 2000; Puthucheary S.D. et al., 2001].
О том, что органы дыхания могут являться первичными воротами инфекции при мелиоидозе в естественных условиях, накоплено достаточно фактов. Указанный механизм заражения рассматривают как равнозначный или второй по значению после чрескожного. Вероятно, этим можно объяснить тот факт, что в странах Юго-Восточной Азии легочный мелиоидоз - наиболее распространенная форма заболевания, хотя чаще всего путь инфицирования остается неустановленным [Christenson В. et al., 2003; Elliott J.H. et al., 2005; Lee S.W.etal., 2005].
Вторая возможная причина появления больных с легочной формой ме-лиоидоза - аварийные ситуации в специализированных учреждениях научного или иного профиля, осуществляющих работу с возбудителем. По различным оценкам, причиной 65-80 % случаев внутрилабораторного заражения являются аэрогенные инфекции, вызванные соответствующими возбудителями, в том числе Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei [Leelarasamee A., 1998; Pospisil L., 2000]. В таких случаях неизбежно появление больных с легочными формами инфекции, сопровождающимися, как правило, тяжелой клинической картиной.
И, наконец, третий аспект проблемы - преднамеренное создание бактериального аэрозоля. Возбудитель мелиоидоза по многим свойствам отвечает требованиям, предъявляемым к вероятным биологическим поражающим агентам (БПА) [Guilhot A. et al., 2005; Keluangkhot V. et al., 2005; Warawa J. et al., 2002; Wittig M.B. et al., 2006].
2 Указанные обстоятельства объясняют необходимость разработки средств защиты от легочного мелиоидоза, которые, как известно, должны базироваться на знании особенностей механизма развития заболевания. Эти вопросы в определенной степени решены для инфекции, вызванной типичными по антигенному составу штаммами возбудителя мелиоидоза, однако, не изучены при использовании для заражения микроба с измененной антигенной структурой. Ранее было установлено, что утрата возбудителем мелиоидоза одного из признаков, детерминирующего натогенность - поверхностного биомолекулярного комплекса, обозначенного как антиген 8 (Лг8) [Пивень Н.Н., Илюхин В.И., 2000], с которым связывают антифагопитарную активность микроба, приводит к авирулентности возбудителя для относительно резистентных к мелиоидозу белых мышей и крыс при парентеральных способах инфицирования [Алексеев В.В., 2001]. Однако, при аэрогенном заражении Аг8" вариантами микроба, данные экспериментальные модели проявляли чувствительность к инфекции, что определило целесообразность проведения дальнейших исследований особенностей развития и протекания инфекционных процессов, вызванных атипичными формами микроба [Алексеев В.В., 2000; Алексеев В.В., 2002]. Исследования такого рода, по нашему мнению, представляют как теоретический интерес в плане оценки патогенетической роли отдельных факторов вирулентности микроба и исследования механизмов адаптации микробных клеток атипичных штаммов в условиях макроорганизма, так и имеют важное практическое значение, поскольку могут дать сведения, необходимые для дальнейшего совершенствования тактики защитных мероприятий, в том числе схемы лабораторной диагностики заболевания.
Цель работы - изучение особенностей течения экспериментального легочного мелиоидоза при аэрогенном заражении штаммами Burkholderict pseadomallei с различным антигенным составом. Задачи исследования:
Разработать экспериментальную модель легочного мелиоидоза на белых крысах при аэрозольном заражении штаммом В. pseudomallei, дефектным по синтезу Аг8.
Дать сравнительную характеристику легочной инфекции, вызванной типичным и атипичным штаммами мелиоидозного микроба. Сформулировать основные закономерности механизма развития легочного ме-
лиоидоза у белых крыс при аэрогенном заражении дефектным по Аг8 штаммом В. pseudomallei.
Провести сравнительный анализ продукции внеклеточных гидролаз типичными н атипичными штаммами В. pseudomallei на различных стадиях инфекционных процессов у экспериментальных животных, зараженных подкожным и аэрогенным методами.
Исследовать вариабельность антигенного состава типичных и атипичных штаммов В. pseudomallei, изолированных от животных с различным клиническим течением и на отдельных стадиях заболевания.
Оценить эффективность имеющихся средств иммунодиагностики для исследования проб биологического материала от животных, экспериментально инфицированных типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.
Научная новизна
В ходе выполнения диссертационной работы получены новые сведения о механизмах развития легочного мелиоидоза белых крыс, вызванного штаммами возбудителя с различной антигенной структурой: охарактеризованы па-толого-анатомические и патоморфологические изменения макроорганизма при инфекционном процессе, исследованы особенности диссеминации атипичного штамма возбудителя мелиоидоза в ходе экспериментальной инфекции, изучены особенности взаимодействия микроба с клетками системы мо-нонуклеарных фагоцитов в легких экспериментальных животных.
Получены новые сведения об особенностях экспрессии генов цитоки-нового ответа клеток иммунной системы экспериментальных животных в ходе инфекционного процесса, вызванного штаммами В. pseudomallei различной вирулентности и Burkholderia thailandensis.
Показано значение секретируемых микробом гидролаз различной субстратной специфичности в развитии экспериментальной аэрогенной инфекции, вызванной штаммом В. pseudomallei с атипичной антигенной структурой.
Показаны различия в качественном и количественном составе отдельных антигенных комплексов возбудителя (Аг8, белки внешней мембраны) в ходе инфекционного процесса, вызванного штаммами В. pseudomallei различной вирулентности.
4 По материалам проведенных исследований получен патент на изобретение № 2257413 «Штамм бактерий В. thailandensis КМ-161 - авирулентный имитатор возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован 27.07.2005 г.). Практическая значимость
Определены технические и биологические условия воспроизведения на белых крысах легочного мелиоидоза в острой форме с атипичным течением и доброкачественным исходом заболевания. Экспериментальные модели могут быть использованы для решения различных вопросов биологии возбудителя и проблем прикладного характера, связанных с разработкой средств специфической профилактики и совершенствованием лабораторной диагностики. Материалы исследования составили основу «Методических рекомендаций по экспериментальному моделированию легочного мелиоидоза, вызванного атипичным штаммом Pseu-domonas pseudomallei» (утверждены директором Волгоградского НИП-ЧИ 23.12.2001)
Установлено, что утрата мслиоидозным микробом способности синтезировать Аг8 не приводит к полной потере возбудителем вирулентности при аэрогенном способе инфицирования, а развитие заболевания, вызванного атипичными вариантами возбудителя, определяют продуцируемые микробом экзофермспты. Выявленные особенности течения заболевания могут явиться основой для коррекции тактики диагностических и профилактических мероприятий при легочной форме мелиоидоза.
Показана эффективность тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов мелиоидоза, разработанной в Волгоградском научно-исследовательском институте, для исследования проб биологического материала от животных, экспериментально инфицированных типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.
Совокупность полученных результатов может быть использована для планирования дальнейших исследований по изучению патогенетической роли отдельных биополимеров возбудителя мелиоидоза.
Материалы исследования вошли в «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004 г.).
Положення, выносимые на защиту
Разработанная экспериментальная модель легочного мелиоидоза белых крыс с использованием аэрозоля штамма В. pseudomalki 100-16-1, дефектного по синтезу Аг8, позволяет исследовать особенности течения мелиоидозиой инфекции, вызванной атипичными вариантами возбудителя.
Продукция клетками В. pseudomalki обладающего антифагоцитарной активностью антигена 8 и внеклеточных протеаз является определяющим фактором диссеминации микроба в организме аэрогенно инфицированных животных и соответствующих патоморфологических изменений в органах и тканях макроорганизма.
Продукция внеклеточных гидролитических ферментов клетками атипичных по антигенной структуре вариантов В. pseudomalki является ведущим фактором, определяющим способность возбудителя к выживанию в инфицированном макроорганизме.
Анализ экспрессии генов цитокинов ТЫ- и Тп2-профилей клеточного ответа может быть информативным инструментом исследования процессов стимуляции различных звеньев иммунной системы при анализе особенностей течения инфекции, вызванной штаммами В. pseudomalki различной вирулентности.
Вариабельность экспрессии мажорных поверхностных антигенов у культур В. pseudomalki, выделенных от животных с различными клиническими формами инфекции, и увеличение уровня продукции антигенов 39, 42 и 90 - 120 kDa у изолятов В. pseudomalki от животных с развившейся острой формой инфекции свидетельствует о патогенетической значимости обозначенных биополимеров.
Тест-система иммупоферментная для обнаружения антигенов сапа и мелиоидоза эффективна для серологической диагностики инфекции, вызванной типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной научно-практической конференции «Problems of biological and ecological safety» (Оболенск, 2000), IV межгосударственной научно-прак-
6 тической конференции «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), научных конференциях ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ 2003 - 2007 гг.
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 116 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 219 работ, в том числе 46 отечественных н 173 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 12 рисунками.
Публикации
По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе в 4 журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций.
