Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. CLASS Обзор литератур CLASS ы 13
1.1. Внутривидовое типирование патогенных микроорганизмов на основе фенотипических признаков
1.2. Использование молекулярно-генетических методов для внутри-видового типирования возбудителей бактериальных инфекций
1.3. Дифференциация штаммов патогенных буркхольдерий с использованием молекулярно-биологических методов
Собственные исследования 42
Глава 2. Материалы и методы 42
2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды, условия культивирования
2.2. Подготовка проб для ПЦР 45
2.3. Выделение ДНК 45
2.4. Полимеразная цепная реакция 46
2.4.1. Реакция амплификации с произвольными праймерами 46
2.4.2. Реакция амплификации со специфическими праймерами 47
2.4.3. Реакция амплификации для мультилокусного сиквенс-типирования
2.5. Детекция продуктов амплификации и определение размеров фрагментов ДНК
2.6. Секвенирование продуктов амплификации и анализ полученных нуклеотидных последовательностей
2.7. Статистическая обработка результатов 51
2.8. Заражение лабораторных животных 52
ГЛАВА 3. Генетическое типирование штаммов патогенных буркхольдерий с использованием сек-венирования
3.1. Монолокусное типирование штаммов патогенных буркхольдерий с использованием секвенирования флагеллярного и рибосо-мальных генов
3.2. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов патогенных буркхольдерий.
ГЛАВА 4. Генотипирование штаммов патогенных буркхольдерий на основе амплификации с произвольными праймерами (RAPD)
4.1. Стандартизация условий постановки реакции амплификации и подбор праймеров для RAPD-типирования патогенных буркхольде-рий . 69
4.2. Анализ генетического полиморфизма возбудителя сапа с использованием произвольных праймеров. 72
4.3. RAPD-типирование штаммов возбудителя мелиоидоза 78
4.4. RAPD-типирование мутантных и выделенных от экспериментально зараженных животных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза.
Заключение 89
Выводы 98
Список использованных источников 100
- Использование молекулярно-генетических методов для внутри-видового типирования возбудителей бактериальных инфекций
- Реакция амплификации со специфическими праймерами
- Монолокусное типирование штаммов патогенных буркхольдерий с использованием секвенирования флагеллярного и рибосо-мальных генов
- Стандартизация условий постановки реакции амплификации и подбор праймеров для RAPD-типирования патогенных буркхольде-рий
Введение к работе
Увеличение заболеваемости мелиоидозом в эндемичных очагах, расширение ареала этой инфекции и ее регистрация во многих странах мира [67, 88, 89, 124, 137], появление новых случаев сапа [98], в том числе обусловленных внутрилабораторным заражением [118], определяют возможности возникновения в любом регионе неблагоприятной эпидемической ситуации по этим инфекциям и таят в себе угрозу их распространения. Возросший интерес к В.mallei и B.pseudomallei, возбудителям сапа и мелиоидоза, в последнее время также обусловлен возможностью их использования в качестве потенциальных агентов биотерроризма [179].
В современных условиях, когда эпидемиологические закономерности распространения опасных инфекций существенно изменились, возникает необходимость пересмотра и усовершенствования системы внутривидового типирования их возбудителей, которая, являясь ключевым звеном в расшифровке вспышек бактериальных инфекций, направлена на определение штамма - источника заражения.
Для многих видов микроорганизмов, в том числе возбудителей особо опасных инфекций, разработаны оптимальные схемы дифференциации штаммов, основанные на вариабельности либо фенотипических, либо ге-нотипических признаков. Однако в отношении возбудителей сапа и мелиоидоза исследования, направленные на поиск простых и высокоэффективных методов внутривидовой дифференциации штаммов, продолжаются до настоящего времени.
Возможности методов внутривидового типирования патогенных буркхольдерий на основе фенотипических признаков ограниченны ввиду их относительно низкой вариабельности. Предпринимались попытки разработать схему типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза на основе их антигенной структуры [70, 104, 105], чувствительности к бактериофагам [18, 26], спектров суммарных клеточных белков [11], однако эф- фективность дифференциации во всех этих случаях оставалась крайне низкой.
Проблемы, связанные с недостатками фенотипических методов ти-пирования, стимулировали развитие способов внутривидовой дифференциации, основанных на исследовании структуры ДНК. Предназначенные первоначально только для научных исследований, в настоящее время гено-типические методы начинают занимать доминирующее место в решении различных проблем медицинской микробиологии и эпидемиологии.
На сегодняшний день общепринято, что результаты генотипирова-ния характеризуются большей однозначностью по сравнению с морфологическими, биохимическими или иммунологическими методами дифференциации микроорганизмов и предоставляют непосредственную информацию для выяснения эволюционных и эпидемиологических связей различных изолятов бактерий. При отсутствии корреляции между генотипом и частью фенотипа, которая может быть определена существующими микробиологическими методами, предпочтение отдается генотипическим методам [10].
Для молекулярного типирования штаммов возбудителя мелиоидоза использовали рестрикционный анализ хромосомной ДНК (ПДРФ) [79, 178], метод риботипирования [138, 176] и пульс-электрофореза [111, 185], различные модификации полимеразной цепной реакции [102, 170, 194] и мультилокусное сиквенс-типирование (МЛСТ) [152]. С помощью данных методов удалось показать клональность вспышек мелиоидоза среди аборигенов Папуа-Новой Гвинеи и Австралии [86, 87], расшифровать водную вспышку заболевания в Австралии [81], подтвердить рецидивы заболеваний после проведенной антибиотикотерапии [111, 190]. Кроме того, была показана высокая близость геномов этих бактерий и высказано мнение о том, что возбудитель сапа является клоном возбудителя мелиоидоза [152].
7 В последние годы появились работы, связанные с секвенированнием последовательностей нуклеотидов, направленные на идентификацию и внутривидовую дифференциацию патогенных буркхольдерий [113, 114]. Однако в настоящий момент развитие генотипических методов, основанных на прямом секвенировании, сдерживаются достаточно высокой стоимостью исследований.
Необходимость исследований, направленных на генотипирование В. mallei и B.pseudomallei определяется сохранением угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций в результате техногенных катастроф, природных катаклизмов, а также террористических актов с использованием этих возбудителей, относящихся к потенциальным агентам биотерроризма группы В [205].
Успех противодействия биотерроризму во многом зависит от разработки новейших технологий и комплексного подхода к лабораторным исследованиям по обнаружению и дифференциации штаммов патогенных агентов при сочетанном применении нескольких взаимодополняющих генотипических методов. Анализ фенотипических и генотипических характеристик обнаруженного патогена позволит определить его эпидемиологическую значимость и объем противоэпидемических мероприятий.
Несмотря на достигнутые успехи в области генотипирования, проблема определения штаммовой гетерогенности патогенных буркхольдерий по-прежнему существует. Актуальность исследования обусловлена отсутствием единого мнения и регламентирующих документов для дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. Кроме того, основная масса исследований в области генотипирования патогенных буркхольдерий направлена на разработку схем внутривидовой дифференциации B.pseudomallei, в то время как в отношении В.mallei имеются лишь единичные публикации [102, 111, 120, 123].
8 Целью настоящей работы являлся
Анализ геномного полиморфизма коллекционных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и выбор оптимальных методов внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий.
Задачи исследования
Провести анализ современных методов генотипирования и оценить возможность их использования для внутривидовой дифференциации коллекционных штаммов патогенных буркхольдерий
Проанализировать нуклеотидные последовательности, представленные в доступных генетических базах данных, для выбора ДНК-мишеней и проведения внутривидового типирования штаммов В. pseudomallei и В. mallei с использованием монолокусного секве-нирования.
Оценить разрешающую способность метода мультилокусного сик-венс-типирования для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий.
Подобрать произвольные праймеры и оптимизировать условия проведения реакции амплификации для эффективной и воспроизводимой дифференциации штаммов В. pseudomallei и В. mallei с использованием ПЦР-типирования (RAPD, Rep-ПЦР).
9 Научная новизна
Впервые проведен анализ изолятов возбудителя сапа на основе реакции амплификации с произвольными праймерами и предложен оригинальный набор олигонуклеотидных затравок для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий.
Впервые показана высокая эффективность метода RAPD для внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа, в то время как для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза — мультилокусного сиквенс-типирования и ПЦР-типирования (RAPD, Rep-ПЦР).
Использование алгоритма eBURST для анализа результатов мультилокусного сиквенс-типирования позволило впервые установить, что штаммы коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института B.pseudomallei 100, С-141, а также B.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Азиатской группе.
Оценена возможность использования фрагментов генов 16S рРНК, 23SрРНК vijliC в качестве ДНК-мишеней для генотипирования возбудителей сапа и мелиоидоза и показана их низкая эффективность для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий.
Выявлено, что сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC является алгоритмом ускоренной идентификации В. mallei и В. pseudomallei. Показано, что для повышения специфичности при идентификации патогенных буркхольдерий необходимо использовать секвенирование двух локусов геномной ДНК - фрагмента гена 16S рРНК и участков генов 23S рРНК или fliC.
Показано, что разработанный нами метод выделения ДНК из объектов окружающей среды (почва, вода), контаминированных возбудителями
10 особо опасных микозов (патент №2295569), эффективен для экстракции
ДНК патогенных буркхольдерий.
Практическая ценность
Предлагаемые схемы ПЦР-типирования с выбранными наборами произвольных праймеров и мультилокусного сиквенс-типирования используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ для анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и изучения генетически измененных штаммов патогенных буркхольдерий, а также могут быть востребованы для проведения эпидемиологического расследования вспышек сапа и мелиоидоза как при исследовании материала от больных, так и из объектов окружающей среды.
Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации и лабораторной диагностики особо опасных заболеваний, проводимых на базе ВолгоградНИПЧИ.
По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Молекулярно-биологические подходы к идентификации и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ 06.03.2006 г.
Положения, выносимые на защиту
1. Набор произвольных олигонуклеотидных затравок, обозначенных Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA позволяет проводить внутривидовое типиро-вание штаммов возбудителя сапа, а набор праймеров PR 7, PR 16, PR 13, и RA - эффективен для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза.
Мультилокусное сиквенс-типирование эффективно для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов В. mallei, которые объединяются в единый сиквенс-тип, входящий в клональный комплекс штаммов В. pseudomallei.
Использование алгоритма eBURST для анализа результатов мультило-кусного сиквенс-типирования позволяет достоверно устанавливать географическую принадлежность штаммов возбудителя мелиоидоза с неизвестным источником выделения.
Секвенирование двух локусов ДНК - фрагмента гена 16S рРНК и участков 23SрРНК или fliC позволяет проводить ускоренную идентификацию возбудителей сапа и мелиоидоза, а секвенирование участка гена, кодирующего 16S рРНК патогенных буркхольдерий - дифференцировать В. mallei от В. pseudomallei.
Апробация работы
Основные материалы диссертации доложены на итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ (Волгоград, 2004, 2005); на V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004),. XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006), Межгосударственной научно- практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского самми-
12 та «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств»» (Оболенск, 2006), XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), 65-й юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007).
По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 123 станицах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 208 источников, в том числе 55 отечественных и 153 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 25 рисунками.
Использование молекулярно-генетических методов для внутри-видового типирования возбудителей бактериальных инфекций
В настоящее время традиционные методы микробиологии, используемые для типирования штаммов микроорганизмов, дополняются новыми молекулярно-биологическими подходами, которые позволяют оценивать генетическое разнообразие, устанавливать степень родства, определять геномный полиморфизм штаммов и выявлять индивидуальные особенности микроорганизмов при анализе структуры их ДНК [10, 54].
Одним из первых способов, позволивших провести внутривидовую дифференциацию с использованием генетических особенностей микроорганизмов, был плазмидный анализ [145, 149]. Этот метод, возникший сначала как эмпирический, получил глубокое научное обоснование после того, как было выяснено, что плазмиды могут детерминировать важнейшие биологические свойства [100, 108, 149]. Преимуществом плазмидного анализа перед рядом фенотипических методов дифференциации штаммов микроорганизмов прежде всего является способность выявлять связи между вариантами, обнаруженными во время вспышек инфекции. Учитывая, что многие плазмиды несут R-детерминанты, плазмидный анализ позволяет проследить возможные механизмы появления антибиотикоустойчивых госпитальных штаммов [108, 130, 145, 149].
Этот метод ранее был успешно применен на широком круге патогенов, таких как Yersinia pseudotuberculosis, Neisseria meningitidis, Salmonella typhimurium [5, 15, 78]. Плазмидный анализ, в сочетании с другими генетическими методами, использовался во многих случаях для более точного эпидемиологического мониторинга нозокомиальных инфекций, в частности вызванных В. cepacia [206].
Анализ плазмидного профиля широко используется для дифференциации штаммов Klebsiella pneumonia при эпидемиологических исследова 20 ниях [183]. Сочетание различных методов типирования, включая плазмид ный анализ и RAPD, позволило успешно дифференцировать штаммы этого микроорганизма при расшифровке вспышек бактериальных инфекций в различных лечебных учреждениях [80, 127]. Изучение плазмидного состава и рестрикционный анализ плазмид по-прежнему остаются актуальными для индикации и типирования возбудителя чумы [19]. Однако метод плазмидного анализа имеет существенный недостаток, заключающийся в ограниченности исследований только плазмидсодержа-щими штаммами, а также в том, что плазмиды могут быть нестабильны и не всегда наследуются в потомстве. В некоторых случаях плазмидные профили штаммов, изолированных во время вспышек, и контрольных штаммов, эпидемиологически не связанных со вспышками, бывают одинаковыми, в этом случае плазмидный анализ, используемый для эпидемического штамма, и выявления источника инфекции, оказывается непродуктивным [52, 54]. Поэтому при типировании возбудителей инфекционных заболеваний данный метод используется в сочетании с другими методическими подходами внутривидовой дифференциации [119, 197]. На сегодняшний день предложены и разрабатываются способы, позволяющие выявлять индивидуальные особенности штаммов на уровне хромосомной ДНК бактерий. Одним из таких методов дифференциации штаммов возбудителей бактериальных инфекций является рестрикционный анализ хромосомной ДНК (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, ПДРФ). Метод основан на феномене полиморфизма ДНК, зависящего от количества и положения специфических нуклеотидных последовательностей для распознавания эндонуклеазами рестрикции (сайтов рестрикции) и образованием фрагментов различной длины, которые выявляют с помощью электрофореза. Генетические перестройки, полученные в результате инсерций, деле ций или инверсий могут приводить к изменению рестрикционной картины. Мутации, не ведущие к изменению фенотипа, но каким-либо образом изменяющие сайты рестрикции, также влекут за собою появление иного характера распределения рестрикционных фрагментов ДНК [38, 129]. Как правило, разделение рестриктов ДНК для выявления ПДРФ осуществляется при помощи электрофореза в геле агарозы (при этом их подвижность обратно пропорциональна длине). С использованием различных эндонуклеаз рестрикции, методом ПДРФ было успешно проведено внутривидовое типирование штаммов Listeria monocytogenes [175], Legionella pneumophila [107], Shigella sonnei [83], P. aeruginosa [97] и многих других видов микроорганизмов. В данных работах исследователи отмечают высокую дифференцирующую способность использованного метода. В то же время, существенный недостаток метода ПДРФ, заключается в сложности интерпретации полученных результатов. Это связано с тем, что паттерны каждого штамма представлены большим количеством рестрикционных фрагментов (иногда 50 и более), образуемых при ферментативном гидролизе тотальной хромосомной ДНК. Такие электрофореграм-мы трудно анализировать даже с применением компьютерной обработки. Решением данной проблемы явилось использование ДНК-зондов. Этот методический прием заключается в переносе и закреплении фрагментов из геля на мембранный фильтр с сохранением картин фракционирования гидролизованых фрагментов ДНК и последующей гибридизации фильтра с меченым зондом (блот-гибридизация) [186]. В результате выявляются лишь те рестрикционные фрагменты,
которые гомологичны используемому ДНК-зонду.
В саузерн-блоте типирование осуществляется по двум молекулярным маркерам: по сайтам рестрикции эндонуклеаз и по присутствию в ре 22 стрицированных фрагментах специфических нуклеотидных последовательностей, тестируемых с помощью зондов.
Центральным звеном метода является использование собственно ДНК-зонда, способного детектировать фрагменты, содержащие полиморфные (или иные интересующие) участки ДНК. Используют зонды, ме-ченные по изотопу Р, с последующей визуализацией картины гибридизации радиоавтографией, либо зонды, меченные каким-либо другим способом (биотин, дезоксигенин и др.). ДНК-зонд и ПДРФ, который им выявляется, в совокупности представляют маркерную систему генома.
Универсальный принцип генетического маркирования с помощью случайных ДНК зондов сформулирован еще в 1978 г. D. Botstein с соавторами [84]. Они высказали гипотезу о том, что любые анонимные последовательности ДНК сами по себе могут служить многочисленными маркерами полиморфизма и использоваться для генетического анализа (ДНК-фингерпринт).
Данный метод с применением специфических для возбудителя чумы ДНК-зондов широко используется исследователями для молекулярного типирования Yersinia pestis [17]. ПДРФ возбудителей сальмонеллеза с использованием в качестве зонда IS200 имеет наибольшую воспроизводимость и рекомендован для анализа сложных эпидемических ситуаций [74, 150]. Метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с использованием гибридизационного зонда на инсерционную последовательность IS6110 является своеобразным "золотым стандартом" методов типирования клинических изолятов Micobacteria tuberculosis [77]. В данной работе дискриминирующая способность этого метода составляла 99 %, а воспроизводимость — 100 %. Стандартизация метода позволяет сравнивать результаты исследований между отдельными лабораториями и создавать базы данных IS6110-ПДРФ генотипов микобактерий. Таким образом, преимущество исследования рестрикционного полиморфизма хромосомной ДНК перед плазмидным анализом заключается в значительно большей стабильности ПДРФ как эпидемиологического маркера по сравнению с плазмидными профилями [54].
Другим вариантом метода ПДРФ хромосомной ДНК, в котором в качестве зондов выступают нуклеотидные последовательности генов 16S и 23S рРНК, является метод риботипирования. Этот метод с успехом применяется для молекулярно-эпидемиологического анализа возбудителя чумы. Так, риботипирование 70 штаммов Y. pestis, выделенных на 5 континентах за 72-летний период, позволило разделить их на 16 риботипов [165].
Применение метода риботипирования определило существование клональных различий среди штаммов V. cholerae 0139, выделенных в 1996-1997 гг. [109].
Реакция амплификации со специфическими праймерами
Для амплификации фрагментов генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC B.pseudomallei и В.mallei были использованы олигонуклеотидные затравки U33/OL731, b23-s5/b23-a6 и bfl-ls/bfl-2a, соответственно (табл.5).
Реакционная смесь содержала ДНК (100 нг), специфические олиго-нуклеотидные прямые и обратные праймеры, дезоксирибонуклеозидтри-фосфаты (200 мкМ каждого дНТФ), буфер и фермент Taq-полимеразу. В качестве отрицательного контроля использовали дистиллированную воду.
Для всех пар праймеров в реакции амплификации использовались Taq-полимераза и ПЦР-буфер производства НПФ «ДНК-Технология» с конечной концентрацией MgC — 2 мМ.
ПЦР с праймерами b23-s5/b23-a6 и bfl-ls/bfl-2a продолжительностью 42 цикла проводили в режиме: денатурация - 94 С - 10 сек, отжиг праймеров - 68 С - 10 сек, синтез комплементарной цепи — 72 С - 10 сек. После последнего цикла пробирки прогревали в течение 1 мин при температуре 72 С.
Реакцию амплификации с олигонуклеотидными затравками U33/OL731 продолжительностью 35 циклов выполняли по программе: денатурация — 94 С - 10 сек, отжиг праймеров - 60 С — 10 сек, синтез комплементарной цепи - 72 С - 10 сек. После последнего цикла пробирки прогревали в течение 1 мин при температуре 72 С. 2.4.3. Реакция амплификации для мультилокусного сиквенс типирования
Типирование проводилось на основе вариабельных участков семи консервативных генов (асе, gltB, gmhD, lepA, lipA, narK, ndh), отвечающих за некоторые функции жизнеобеспечения клеток [152] (табл.6).
Для проведения реакции амплификации использовали режим «горячего старта». Полимеразную цепную реакцию проводили в 0,6 мл пробирках. Реакционная смесь содержала прямые и обратные олигонуклеотидные праймеры для каждого локуса [152], дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, деионизированную воду, буфер, фермент Taq-полимеразу и анализируемую пробу, содержащую 10-50 нг исследуемой ДНК. Во все пробирки добавляли по 30 мкл вазелинового масла.
Реакцию амплификации с олигонуклеотидными затравками для выявления вариабельных участков семи консервативных генов проводили в соответствии с рекомендациями [152], с собственными модификациями (глава 3.2.). 2.5. Детекция продуктов амплификации и определение размеров фрагментов ДНК
Присутствие специфического ПЦР-продукта детектировали элек-трофоретическим разделением амплификационной смеси в 1,5 % агарозном геле, приготовленном на трис-боратном буфере (0,089М трис-борат, 0,089М борная кислота, 0,002М ЭДТА рН 8,0), при градиенте напряжения 5В/см. Время проведения электрофореза составляло 30 мин.
Окрашивание гелей для визуализации в проходящем ультрафиолетовом свете (трансиллюминатор фирмы «LKB», Швеция) производили бромистым этидием (0,5 мкг/мл). Для фотографирования использовали фотопленку марки «Микрат-300». Результаты оценивали по наличию или отсутствию в геле ампликонов необходимого размера.
Монолокусное типирование штаммов патогенных буркхольдерий с использованием секвенирования флагеллярного и рибосо-мальных генов
Для генотипирования штаммов патогенных буркхольдерий первично в качестве ДНК-мишеней были выбраны участки генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC, наиболее широко представленные в генетических базах данных и использованные ранее в нашей лаборатории для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза. Алгоритм исследования включал амплификацию, секвенирование и сравнение полученных нуклеотидных последовательностей с использованием программ BLASTn и Vector NTI. Изучаемые последовательности сопоставляли друг с другом и определяли предполагаемые регионы дифференциации штаммов.
Для амплификации фрагментов генов 23S рРНК nfliC использовали олигонуклеотидные затравки b23-s5/b23-a6 и bfl-ls/bfl-2a, соответственно [4], а для гена 16S рРНК — праймеры U33/OL731 [163]. Высокая чувствительность и специфичность данных праймеров показана ранее [4, 163].
Учитывая, что на данном этапе работы оценивали лишь возможность генотипирования на основе выбранных ДНК мишеней, в работе использовали три коллекционных штамма B.pseudomallei 100, С-141, 107 и два штамма B.mallei 10230, V-120. Кроме того, секвенировали продукты ПНР проб экспериментального клинического материала (кровь, печень, селезенка), полученного от зараженных патогенными буркхольдериями животных. В результате ПЦР с данными праймерами получены специфические фрагменты размерами 717 п.н. (для U33/OL731), 666 п.н. (для b23-s5/b23-аб) и 376 п.н. для bfl-ls/bfl-2a (рис.1). Исключение составил штамм B.pseudomallei 57576, который не выявлялся праймерами b23-s5/b23-a6 да 54 же в диапазоне концентраций 1x106- 1x108 м.к./мл. При использовании праймеров b23-s7/ Ь23-а8 [49], фланкирующих другой участок гена 23S рРНК, получен положительный результат ПЦР при анализе всех штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, в том числе и B.pseudomallei 57576 (рис.2). После амплификации фрагментов ДНК штаммов В. pseudomallei и 5. mallei продукты ПЦР были секвенированы. Сиквенс-анализ ампликонов, полученных в результате ПЦР, подтвердил специфичность ранее сконструированных в нашей лаборатории амплификационных тест-систем для обнаружения патогенных буркхольдерий при исследовании чистых культур, экспериментального материала и проб объектов внешней среды, кон-таминированных возбудителями сапа и мелиоидоза [4, 49]. Для сравнительной оценки полученных результатов секвенирован ные последовательности исследуемых штаммов возбудителей сапа и ме-лиоидоза, были сопоставлены с аналогичными последовательностями генов 16S рРНК, 23S рРНК и/ІіС генетической базы данных GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information) и контигами, представленными на серверах (http://www.tigr.org/ и http://www.sanger.ac.uk/).
Сравнительный анализ секвенированных последовательностей штаммов патогенных буркхольдерий между собой, а также с контигами и аналогичными последовательностями возбудителей сапа и мелиоидоза, представленными в генетических базах данных, проводили с помощью программы AlignX из программного пакета Vector NTI.
При сравнении фрагментов генов 16S рРНКу 28 штаммов возбудителя мелиоидоза было выявлено 3 нуклеотидных замены на секвенирован-ном участке в 717 п.н. в позициях 124, 405 и 618 (рис.3).
Кластерный анализ данных статистической обработки нуклеотидных последовательностей, при помощи программы TreeCon for Windows с использованием алгоритма Т.Н. Jukes и C.R. Cantor [131], позволил сформировать 3 группы штаммов В. pseudomallei (рис.4). Все исследуемые нами штаммы возбудителя мелиоидоза оказались в одной кластерной группе.
Анализ данных групп показал, что формирование кластеров не связано ни с источником, ни с географическим регионом выделения штаммов возбудителя мелиоидоза.
Стандартизация условий постановки реакции амплификации и подбор праймеров для RAPD-типирования патогенных буркхольде-рий
Наиболее простым способом дифференциации штаммов микроорганизмов из существующих на данный момент генотипических методов является амплификация с произвольными праймерами (RAPD). Его стоимость значительно ниже риботипирования, пульс-электрофореза и мульти-локусного сиквенс-типирования. В единицу времени возможен скрининго-вый анализ значительно большего количества штаммов в сравнении с перечисленными методами, не требуется дорогостоящих реактивов и оборудования, что при эпидемиологическом обследовании и анализе возможных вспышек сапной и мелиоидозной инфекций имеет определяющее значение.
Однако метод требовал строгой стандартизации условий выполнения, начиная с этапа выделения ДНК и заканчивая проведением электрофореза и регистрации данных. Так, даже при изменении лишь одного из компонентов реакционной смеси - увеличении концентрации ДНК-матрицы, праймеров или изменении состава буферного раствора, происходили выраженные изменения электрофоретической картины продуктов амплификации. Для получения высокоинформативных и воспроизводимых ДНК-профилей были оптимизированы параметры ПЦР - отработаны температурные режимы, определены необходимые концентрации праймеров, исследуемой ДНК, Taq-полимеразы, состав ПЦР-буфера и условия проведения электрофореза. Отдельного внимания заслуживала стандартизация количества ДНК-матрицы, используемой в реакции RAPD. В серии экспериментов было установлено, что наиболее широкий спектр амплифици руемых фрагментов наблюдается при содержании ДНК 100 нг (рис.12).
Амплификацию ДНК продолжительностью 45 циклов проводили в 25 мкл буфера, содержащего 0,02 мМ каждого дезоксирибонуклеозидтри-фосфата, 100 пМ праймирующего олигонуклеотида, 1 ед. Taq-полимеразы и 100 нг анализируемой геномной ДНК. Температурный режим ПНР: денатурация - 94 С в течение 30 сек; отжиг праймеров - 36 С в течение 30 сек; элонгация цепи - 72 С продолжительностью 120 сек.
Основная трудность в использовании метода RAPD для типирования штаммов микроорганизмов состоит в выборе праймеров, поскольку случайный подбор не всегда приводит к четким и воспроизводимым результатам.
Для генотипирования штаммов патогенных буркхольдерий в реакции амплификации нами первично было проанализировано 15 различных праймеров и их сочетаний (табл.4). Ранее 10 из них были предложены для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза. Данных об их приме 71 нении для дифференциации штаммов возбудителя сапа в доступной литературе обнаружить не удалось.
В результате серии экспериментов подобран оптимальный набор олигонуклеотидных затравок, показавших наибольшую эффективность для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий (табл.9).
При генотипировании штаммов возбудителя сапа наибольшую дифференцирующую способность показали праймеры Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA. Для RAPD-анализа возбудителя мелиоидоза эффективными оказались праймеры RA, PR 13, PR 16 и PR 7.
При RAPD-анализе с использованием перечисленных праймеров формировались характерные паттерны для каждого штамма или группы штаммов, отражая генетическую гетерогенность патогенных буркхольдерий. Каждый из олигонуклеотидов или их комбинаций давал возможность обнаружить специфические микролокусы в геномах штаммов, которым свойственна различная степень нуклеотидной изменчивости на внутривидовом уровне.
При анализе продуктов амплификации ДНК в зависимости от прай-мера и штаммов было зарегистрировано 7-18 фрагментов ДНК размером от 100 до 1500 п.н.. Со всеми праймерами на электрофореграммах визуализировались как общие для вида мажорные фрагменты, характерные для всех анализированных штаммов, так и вариабельные регионы, в которых присутствовали четко выраженные ампликоны, позволяющие группировать штаммы по сходству ДНК-профилей внутри вида.
Причем, большее количество вариабельных ампликонов было отмечено у возбудителя мелиоидоза. Штаммы возбудителя сапа характеризовались меньшей гетерогенностью, что выражалось в превалировании консервативных фрагментов.
