Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Понятие ризосферы как специфичной зоны обитания микроорганизмов 5
Глава 2. Методы исследования ризосферы
2.1. Методы подготовки образцов к микробиологическому анализу 12
2.2. Метод посева 15
2.3. Метод световой микроскопии 16
Глава 3. Корневые выделения и микрорганизмы прикорневого пространства 19
Глава 4. Минеральное питание растений и микроорганизмы ризосферы 29
Глава5. Объекты и методы исследования 37
Глава 6. Влияние фосфора на колонизацию микроорганизмами прикорневой зоны ячменя
6.1. Динамика численности микроорганизмов в прикорневой зоне ячменя 41
6.2. Микронавески ризосферной почвы и лабораторные артефакты 48
Глава 7. Динамика численности микроорганизмов в прикорневой зоне ячменя при внесении калийных удобрений влияние полного минерального удобрения 55
Глава 8. Колонизацию микроорганизмами прикорневой зоны ячменя 66
Глава 9. Изучение процесса колонизации микроорганизмами корней разных сортов ячменя 77
Глава 10. Влияние азота на колонизацию микроорганизмами корней фасоли 85
Заключение 95
Выводы 100
- Методы подготовки образцов к микробиологическому анализу
- Метод посева
- Динамика численности микроорганизмов в прикорневой зоне ячменя
- Микронавески ризосферной почвы и лабораторные артефакты
Введение к работе
Известно, что микроорганизмы прикорневой зоны играют важную роль в жизнедеятельности растений. Взаимоотношения между растением и отдельными микробными популяциями лежат в широком диапазоне от рост стимулирующей роли азотфиксирующих бактерий и микоризных грибов до развития микробного патогенеза (Kloepper, 1993). Специфика условий жизнедеятельности микроорганизмов в прикорневой зоне, механизмы колонизации ризосферы и ризопланы, благоприятные и неблагоприятные последствия этих процессов для растения - всё это вопросы, прямо связанные с состоянием растений и их урожайностью. Успешное использование отдельных видов бактерий и грибов в сельскохозяйственной практике неразрывно связано с изучением основных принципов функционирования микробной системы прикорневой зоны растений, её специфичности (зависимости от вида растений) и её отличий от почвы без растений.
Влияние условий минерального питания на жизнедеятельность растений является традиционной и наиболее изученной проблемой агрохимии. Гораздо меньше известно о воздействии тех или иных удобрений на численность и структуру почвенных микробных систем. Что же касается факторов, определяющих скорость и характер колонизации почвенными микроорганизмами прикорневой зоны растений и собственно поверхности корня, то вопрос этот изучен слабо. Между тем множество событий в ходе вегетации, таких как значительные колебания температуры и влажности почвы, внесение удобрений и пестицидов могут трансформировать естественный ход событий, усиливая или ослабляя специфику взаимодействий различных биологических компонентов в прикорневом пространстве.
Изучение микробных комплексов прикорневой почвы и поверхности корня, а также факторов, влияющих на колонизацию корня и прикорневого пространства различными популяциями микроорганизмов имеет первостепенное значение для характеристики взаимоотношений между развивающимся растением и микроорганизмами (Lynch, 1990). Указанные местообитания, несомненно, специфичны по составу субстратов и ингибирующих веществ (Lynch, Wihipps, 1990). Нет никаких оснований ставить под сомнение многочисленные данные о видовой специфике микробных сообществ ризосферы и ризопланы, отражающей селективные свойства этих местообитаний (Mahaffe, Kloepper, 1997).
Зерновые и бобовые культуры обладают огромной пищевой ценностью и являются основой севооборотов большинства регионов умеренного пояса. Именно эти растения, в первую очередь, привлекают наше внимание при изучении специфики развития микробных систем прикорневых зон в присутствии минеральных удобрений.
Ранее в нашей лаборатории были проведены исследования по влиянию азота как элемента минерального питания растения на колонизацию микроорганизмами прикорневой зоны и поверхности корня ячменя (Полянская и др., 1994b). Было показано, что внесение азотнокислого аммония создает мощный стимул для колонизации прикорневого пространства и поверхности корня почвенными грибами, а также способствует некоторому возрастанию численности прокариотных микроорганизмов в ризоплане ячменя. Эти данные позволили предположить, что и другие элементы минерального питания могут играть значительную роль в процессах взаимодействия в системе растение-микроорганизмы.
Целью настоящее работы являлось изучение процессов колонизации ризосферы и ризопланы ячменя и фасоли основными группами микроорганизмов в зависимости от обогащенности почвы азотом, фосфором, калием и полным минеральным удобрением.
В задачи исследования входило:
Изучение влияния азота, фосфора, калия и полного минерального удобрения на рост и развитие ячменя и фасоли.
Изучение влияния этих форм удобрений на процессы колонизации микроорганизмами прикорневых зон этих растений.
3. Сравнение процессов колонизации основными группами
микроорганизмов прикорневых зон ячменя и фасоли.
Сравнительная оценка предрасположенности сортов ячменя к заселению корней различными группами микроорганизмов.
Изучение влияния характера навесок почвы на результаты микробиологического анализа.
Научная новизна
Впервые с помощью прямых методов количественного учета изучено влияние калийного, фосфорного и полного минерального удобрений на динамику содержания основных компонентов комплекса микроорганизмов в почве, ризосфере и ризоплане растений. Установлено, что присутствие дополнительного фосфора, калия и NPK неблагоприятно влияет на развитие почвенных грибов во всех 3-х местообитаниях. Показано, что при этом возрастает конкурентоспособность прокариотных микроорганизмов и их значимость в составе микробного комплекса.
Практическая значимость
Неблагоприятное влияние изученных минеральных удобрений на развитие мицелия грибов является основанием для оптимизации стратегии подавления патогенов и внедрения полезных популяций. Необходимо учитывать описанные эффекты при планировании очередности агротехнических мероприятий и выборе необходимой дозы фунгицидов. Например, целесообразно вносить фунгициды непосредственно после калийных, фосфорных удобрений и NPK, что позволит минимизировать дозы фунгицидов.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Методы подготовки образцов к микробиологическому анализу
Ризосферной обычно считают почву, которая остаётся прикреплённой к поверхности корней после встряхивания (для удаления крупных частиц почвы и органического материала). Количество остающейся на корнях почвы зависит от типа почвы, вида растений, влажности и других факторов, в том числе от интенсивности встряхивания. Чем меньше почвы остаётся на корнях, тем выше R/S-отношение для популяции. Из этого следует, что выражение ризосферного эффекта как R/S-отношения является более точным, когда сравнивают растения в одном типе почвы и при сходных условиях выращивания (Rovira & Davey, 1974).
Экспериментально установлено, что ризосфера имеет ширину всего в несколько мм (Papavizas, Davey, 1961, Youssef et al., 1989) и, следовательно, возникает необходимость в определенных модификациях общеиспользуемых методов отбора почвы, микробной изоляции и учета микроорганизмов. Сложившиеся методы исследования ризосферы, в частности, методы подготовки образцов к микробиологическому анализу, были предназначены, в основном, для определения ризосферного эффекта по изменению общей численности микроорганизмов.
При анализе микрофлоры ризосферы наиболее часто используется процедура, предложенная Тимониным (Timonin, 1940) с последующими модификациями (Curl, Truelove, 1986) . По Тимонину, корни вынимают из почвы с минимальными повреждениями, осторожно встряхивают для удаления крупных частиц почвы и помещают в колбы со 100 мл стерильной воды. Для получения образца ризосферы колбы с корнями встряхивают в одинаковом режиме в течение 20 минут. Процедура может варьировать в зависимости от целей исследований (Parkinson et al., 1971; Johnson, Curl, 1972; Skinner et al., 1980). Результаты многих работ базируются на методах, раздельного изучения ризосферы и ризопланы (Methods in plant ecology, 1986). В этом случае образец ризосферы (почва + корень) подразделяется на два подобразца. Ризосферная почва представляет собой почву, отделившуюся от корней при легком встряхивании в воде, а собственно корни считаются ризопланой. Существует достаточно много вариаций процедуры подготовки корней к микробиологическому анализу, среди них: изменение интенсивности и режима механической обработки, применение различных диспергирующих химических агентов (Palleroni, 1980).
Следует отметить относительность сведений, полученных с помощью выше описанных приемов разделения образцов ризосферы и ризопланы. В ходе отделения от корней ризосферной почвы вполне вероятно попадание в нее обитателей ризопланы, что может привести к преувеличениям в оценке ризосферного эффекта. Кроме того, на поверхности корня есть участки, свободные от почвы, с которых смыв микроорганизмов ризопланы в образец ризосферы более вероятен. В специально проведенном эксперименте (Rovira, Davey, 1974) на основе анализа общей численности микроорганизмов было показано, что доля смываемых клеток невелика и составляет 3-4% бактерий, адсорбированных на поверхности корня. Для удаления избытка почвы корни райграса опускали в колбу с 50 мл стерильной воды, затем переносили их в другую колбу с 50 мл стерильной воды и взбалтывали до тех пор, пока они не очистятся от почвы (на данном этапе отмывалось 3 10е клеток бактерий на 1 г веса свежих корней). В дальнейшем, отмытые корни помещали в колбы со 100 мл воды и 5 г стеклянных бус (D=4MM) И отмывали в течение 15 мин на качалке для отделения ризоплановой микрофлоры от корня. В этом случае отмывалось 90 106 клеток бактерий на 1 г свежих корней. Следовательно, в образец ризосферы смывается не более 3-4% бактерий, адсорбированных на корне. Значение ризосферного эффекта популяций сильно зависит от степени адсорбции микроорганизмов на корнях. Анализ использованных методических приемов показывает, что, когда клетки на корне адсорбированы сильно, то при встряхивании корней в течение 5 мин в воде по методу Тимонина, в почвенную суспензию переходит в 2, 5 раза больше клеток, чем при простом погружении корней в воду (Louw, Webley, 1959). При слабой адсорбции клеток на корне обе процедуры дают сходные результаты. Таким образом, уже при простом погружении корней в воду основная масса слабо адсорбированных клеток смывается. Пятикратное отмывание корней в воде также приводит к отмыванию большинства клеток с корней в образец ризосферы.
В тех случаях, когда клетки прочно адсорбированы на корне, чем меньше количество почвы остается на поверхности корня, тем выше будет значение ризосферного эффекта, если рассчитывать его по отношению количества клеток во взвешенном образце почвы с корнями к этому показателю в почве (Clark, 1949). Из-за гетерогенной природы ризосферы невозможно найти универсальный способ взятия образцов (Bowen, Rovira, 1976), однако, анализ данных о весовом количестве почвы и корней в образце, несомненно, в значительной степени может увеличить информацию (Clark, 1949). Предложенный Ровирой и Деви (Rovira, Davey, 1974) показатель отношения отобранной ризосферной почвы (R) к весу свежих корней (Kt) также позволяет реально оценить и сравнить данные работ разных авторов, даже в том случае, когда исследователи не проводили отдельного изучения ризопланы.
Метод посева
Световая микроскопия используется в основном для изучения распределения микроорганизмов на корнях растений. Чтобы получить объективную картину распределения микроорганизмов на всей поверхности корня необходимо исследовать большое число полей зрения на разных участках корневой системы. Для этой цели разработана специальная система, обеспечивающая репрезентативность выборки. (Newman, Bowen, 1974). Световая микроскопия продемонстрировала неравномерность распределения микроорганизмов на поверхности корня (Красильников, 1958, Bowen, Rovira, 1976). Встречаются как одиночные клетки, так и микроколонии разных размеров (до 100 клеток). Отмечается преимущественная локализация микроколоний в местах соединения эпидермальных клеток (Rovira, 1979), что связывают с более значительной эксудацией (а возможно, просто аккумуляцией выделений) и повышенной стабильной влажностью на стыке клеток (Bennett, Lynch, 1981). Для бактерий наблюдали большую приуроченность к местам слияния эпидермальных клеток, чем для грибов и актиномицетов. Несмотря на то, что грибы также стремятся расти в этой области, их способность к транслокации питательных веществ позволяет им обитать в более бедных по содержанию питательных веществ локусах корня (Bowen , Rovira, 1976).
Молодая, наиболее активная часть корня, представленная кончиком и зоной удлинения (возраст от 24 часов до 72 часов), практически не заселена микроорганизмами (Foster, Bowen, 1982). В ходе изучения этой зоны с помощью микроскопии нередко создается впечатление о ее стерильности. Клетки микроорганизмов представлены на более старых участках корня, но и здесь микроорганизмы занимают не более 10% площади (Bowen, Rovira, 1976). Колонии бактерий первоначально встречаются в виде очень удаленных друг от друга небольших гроздей клеток, но по мере старения корней колонии увеличиваются в размере и могут со временем образовывать чехол вокруг корня (Звягинцев, 1962, 1973).
Таким образом, существенные значения ризосферного эффекта, как превышение численности микроорганизмов вблизи корней над таковой в почве, регистрировались преимущественно методом посева. Между тем, почвенный микробиолог хорошо знает, насколько неполон общий количественный учет микроорганизмов методом посева на любые из известных питательных сред. Поэтому ризосферный эффект может быть связан не столько с общей численностью микроорганизмов, сколько с большей полнотой их учета в прикорневой зоне вследствие специфики видового состава и, соответственно, трофических потребностей. Наиболее точным методом количественного учета микроорганизмов в почве и других средах, отличающихся существенной гетерогенностью, представляется метод эпилюминесцентного микроскопирования, но именно этим методом значительного ризосферного эффекта не удается зарегистрировать (Trolldenier, 1973; Полянская и др., 1994). Так как интенсивность экссудации весьма неравномерна, возможны резкие скачки численности микроорганизмов в прикорневой зоне во временном интервале. Однако заселенность последней простейшими и другими хищниками может играть роль механизма контроля над численностью микробных популяций. Кроме того, рост микроорганизмов в прикорневой зоне может сдерживаться конкуренцией между микроорганизмами и корневой системой растения за те или иные биогенные элементы. Наблюдавшиеся высокие значения физиологической активности микрофлоры прикорневой зоны (Калининская и др, 1977,
Берестецкий, 1985, Умаров, 1986; Nelson et al, 1986, Giller, Day, 1985) не обязательно связаны о высокой численностью микроорганизмов, а могут также определяться их видовым составом. Так в работе Махафе и Клоэпера (Mahaffe, Kloepper, 1997)были показаны изменения структуры бактериального комплекса в почве, ризосфере и ризоплане огурца. В почве на протяжении всего опыта абсолютными доминантами являлись бактерии рода Bacillus - 67%. В значительно меньшем количестве присутствовали в почве бактерии рода Arthrobakter - 8%, затем Pseudomonas - 4%, Micrococcus - 3%.
Таким образом, в почве "пирамида" классов имеет весьма узкую вершину. В прикорневом пространстве наблюдались иные тенденции. Так в ризосфере и ризоплане увеличивалась доля других родов бактерий, таких как Arthrobakter, Pseudomonas, Agrobaktenum, Enterobakter, в то время как бактерии рода Bacillus составляли в прикорневом пространстве 15-16% от общего количества видов.
Динамика численности микроорганизмов в прикорневой зоне ячменя
Динамика численности микроорганизмов в прикорневой зоне ячменя Следует отметить, что если вопрос о дефицитности азота открыт вследствие симбиотической и несимбиотической азотфиксации прокариотными микроорганизмами, то фосфор всегда считался мощным лимитирующим фактором для развития растений. В нашем эксперименте внесение фосфора повлияло как на длину стебля развивающегося ячменя (в меньшей степени), так и в особенности на увеличение веса репродуктивных органов, то есть на величину урожая (почти вдвое) (табл.4, рис. 1).
Обогащение минеральным фосфором почвы не оказало решающего воздействия на конфигурацию кривых динамики численности бактерий, при этом следует отметить, что увеличение их численности в начале сукцессии в присутствии дополнительного фосфора было большим, и показатели стабилизации численности также превышали контрольные (рис. 2).
В ризосфере ячменя наблюдались две более мощные, чем в контроле, вспышки численности бактерий в присутствии дополнительного фосфора, приуроченные к резким изменениям характера эксудации корневой системы ячменя на 3-7 и 16-е сутки вегетации (Barber, Gunn, 1974). При этом к 40-ым суткам наибольшей численности бактерии достигают в варианте с высокой дозой внесения фосфора и табилизация происходит на более высоком уровне.
Непосредственно на поверхности корня растения „были отмечены те же вспышки численности бактерий, но уровень стабилизации численности при обеих дозах близок к контрольному. Аналогичные закономерности характерны для колонизации этих местообитаний мицелием актиномицетов (рис.3).
Что касается эукариотного комплекса (рис. 4) , то в эксперименте в свободной от корней почве уровень стабилизации грибного мицелия был заметно выше, чем в контроле, а в ризосфере и, особенно, в ризоплане наблюдалась иная картина. В ризосфере растения внесение стандартной дозы фосфора не препятствовало развитию мицелия грибов, а внесение высокой дозы фосфора, напротив, угнетало развитие грибного мицелия. Аналогичное угнетение грибов наблюдалось на поверхности корня наблюдалось при внесении обеих доз удобрения. Снижение содержания мицелия сопровождается и снижением численности грибных спор в изученных местообитаниях (рис. 5).
Сходные данные были получены и для фасоли.
Описанный эффект можно объяснить снижением роли микоризы в развитии растения при обогащение почвы наиболее дефицитным ресурсом, что может сопровождаться продукцией корнем соответствующих ингибиторов. Используемый метод не позволяет подкрепить это предположение дифференцированным учетом микоризных и свободно живущих популяций. Полученные результаты хорошо согласуются с экспериментальными данными, приведенными в работах Полянской и Тернера с соавторами (Полянская и др., 1994; Turner et al., 1985). Авторами отмечается высокая зависимость грибов в прикорневой зоне от соотношения содержания в почве фосфора и азота. Наибольшая численность грибов наблюдалась при высоком содержании азота и низком содержанием фосфора и, напротив, наименьшая численность грибов соответствовала высокому содержанию фосфора и низкому содержанию азота.
Полученные результаты могут найти практическое применение при разработке тактики использования фунгицидов в земледелии. При высоких дозах внесения фосфора в почву можно рекомендовать щадящие дозировки внесения фунгицидов, так как грибной комплекс прикорневой зоны находится в угнетенном состоянии.
Микронавески ризосферной почвы и лабораторные артефакты
Изучение специфичности микробных комплексов прикорневой зоны почвы и поверхности корня имеет первостепенное значение для характеристики взаимоотношений между растением и микроорганизмами. Указанные местообитания несомненно специфичны по составу субстратов и ингибирующих веществ (Lynch, Whipps, 1990). Нет никаких оснований ставить под сомнение многочисленные данные о видовой специфике микробных сообществ ризосферы и ризопланы, отражающей селективные свойства этих местообитаний (Красильников, 1958; Литвинов, 1967; Katznelson, 1965; Foster, 1986).
Иное дело - вопрос о численности тех или иных популяций и общей численности микроорганизмов в прикорневом слое почвы. Устоявшееся мнение о более плотной заселенности ризосферы по сравнению с окружающей почвой основывается, преимущественно, на анализе методом посева (Rovira, Davey, 1974), между тем, численность высеваемых микроорганизмов отражает больше их трофические предпочтения и физиологическое состояние, чем реальную заселенность рассматриваемых местообитаний. Результаты микроскопического учета, приводимые в отдельных отечественных (Полянская и др., 1994; Оразова и др., 1994; Оразова и др., 1999) и зарубежных (van Vuurde, de Lange, 1978; Curl, Truelove,1986) работах ставят под сомнение более высокую заселенность ризосферы по сравнению с окружающей почвой, однако вопрос остается спорным. Что касается популярных ныне физиологических методов учета, то следует отметить, что численность и биомасса микроорганизмов не обязательно коррелирует с их активностью. В разных локусах биомасса микроорганизмов может быть одинаковой, а активность совершенно разной.
Хотя в литературе имеются многочисленные данные о "ризосферном эффекте", то есть о ризосфере как о наиболее благоприятном местообитании микроорганизмов, чем собственно почве, однако в наших исследованиях (Оразова и др., 1999) не было зафиксировано выраженного ризосферного эффекта. Этот факт, несомненно, нуждается в истолковании. Простая ссылка на то, что метод посева не адекватен задаче учета общей численности, не может удовлетворить, так как некоторые исследователи прибегали и к прямым методам учета (van Vuurde, de Lange, 1978; Curl, Truelove,1986).
Ранее нами уже высказывалось предположение, что трудности в получении ризосферной почвы вызывают у исследователя соблазн воспользоваться микронавеской, что при сопоставлении с макронавеской контрольной почвы способно дать лабораторный артефакт в чистом виде.
Полученные данные показывают, что для учета численности бактерий, так называемый эффект разведений играет огромную роль. Реальное количество клеток на препаратах существенно отличается от такового, предсказанного формально: навески 1 и 0,5 г практически не отличаются между собой по численности бактерий (так как во втором случае обеспечивается наиболее полная десорбция бактериальных клеток). Уменьшение навески до 0,1 г снижает численность не в 10 раз, а в 3,5 раза; до 0,05 г не в 20 раз, а в 5; наконец до 0,005 не в 200, а всего в 20 раз (рис.ба). При этом данные по пяти вариантам опытов с дерново-подзолистой почвой практически совпадают. При исследовании сухого торфа большую роль сыграло соотношение частиц и бактериальных клеток. В навесках 1 и 0,5 г в поле зрения было много почвенных частиц и более 40 бактериальных клеток, что не дает возможность учесть микроорганизмы полностью, делая учет ненадежным. В навеске 0,1 г соотношение почвенных частиц и бактериальных клеток было оптимальным, что позволяет рекомендовать ее для учета численности бактерий в сухом торфе (рис.66).
В целом для торфа действуют те же закономерности, что и для дерново-подзолистой почвы: при работе с микронавесками: ожидаемые коэффициенты пересчета не соответствуют реально наблюдаемой картине и при уменьшении навесок искажающий эффект нарастает.
Аналогичные закономерности при переходе от макро- к микронавескам характерны и для прямого учета спор и мицелия грибов. За исключением экстремально малой навески в 0,005 г, реальные коэффициенты разведения в дерново-подзолистой почве и торфе практически совпадали при учете грибного мицелия и спор (рис.7).
При попытке учета численности микроорганизмов методом посева эффект разведения дает о себе знать уже на уровне лабораторной процедуры (Звягинцев, 1973). Так при каждом последующем разведении суспензии в 10 раз число колоний бактерий уменьшается примерно в 2-4 раза, а грибов - в 1,5-2 раза (табл.5).
