Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Межмикробные коммуникации микроорганизмов (обзор литературы) 9
1.1. Популяционно-коммуникативные исследования в микробиологии 9
1.2. Способы межклеточных взаимодействий микроорганизмов 13
1.3. Строение и биологические свойства алкилоксибензолов 24
Глава 2. Материалы и методы исследования 37
2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе 37
2.2. Методы выделения и идентификации микроорганизмов 37
2.3. Характеристика препаратов алкилоксибензола 38
2.4. Методика соинкубирования препаратов с исследуемыми штаммами 39
2.5. Методика изучения клональной структуры популяции микроорганизмов 40
2.6. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов 41
2.7. Методы статистической обработки полученных результатов 45
Глава 3. Изучение антилизоцимнои активности микроорганизмов под влиянием алкилоксибензолов 46
3.1. Влияние алкилоксибензолов на антилизоцимную активность грамнегативных микроорганизмов 47
3.2. Действие алкилоксибензолов на антилизоцимную активность грампозитивных бактерий 53
3.3. Изменение антилизоцимной активности представителей нормальной микрофлоры человека под влиянием алкилоксибензолов. 59
Глава 4. Изучение способности микроорганизмов формировать биопленки под влиянием алкилоксибензолов 66
4.1.Способность грамнегативных микроорганизмов формировать биопленки под влиянием алкилоксибензолов 67
4.2. Биопленкообразование грампозитивных микроорганизмов под влиянием алкилоксибензолов 73
4.3. Действие алкилоксибензолов на биопленкообразование представителей нормальной микрофлоры 78
Глава 5. Изменение ростовых свойств микроорганизмов под действием алкилоксибензолов 86
5.1. Изучение ростовых свойств грамнегативных микроорганизмов под влиянием алкилоксибензолов 86
5.2. Влияние алкилоксибензолов на кинетику роста грампозитивных микроорганизмов 93
5.3. Изменение ростовых свойств представителей нормальной микрофлоры человека под действием алкилоксибензолов 100
Заключение 107
Выводы 117
Список литературы 119
Список сокращений 143
- Способы межклеточных взаимодействий микроорганизмов
- Влияние алкилоксибензолов на антилизоцимную активность грамнегативных микроорганизмов
- Биопленкообразование грампозитивных микроорганизмов под влиянием алкилоксибензолов
- Изменение ростовых свойств представителей нормальной микрофлоры человека под действием алкилоксибензолов
Введение к работе
Актуальность проблемы
Микроорганизмы в развивающихся культурах, колониях и иных структурированных ансамблях связаны между собой сложными системами межклеточных взаимоотношений и для своего выживания широко используют преимущество коллективного поведения (QS), (Г.И. Эль-Регистан, 2006; Ю.А. Николаев, 2007; А.Л. Мулюкин, 2010). Феномен «quorum sensing» бактерий осуществляется различными способами, включая: механический (контактный), (Ю.А. Николаев, 2000); коммуникативный, опосредованный физическими полями, (В.П. Казначеев, А.П. Михайлова, 1981); химический
(А.С. Хохлов, 1988; А.С. Капрельянц, и др. 1993; Г.И. Эль-Регистан, 2005).
В настоящее время активно изучаются механизмы QS-взаимодействий микроорганизмов, в частности, химическая коммуникация, осуществляемая посредством низкомолекулярных соединений различной химической природы, синтезируемых и выделяемых в окружающую среду клетками микробной популяции или их частью (К. Stephens, 1986). В плане определения механизмов выживания микроорганизмов в окружающей среде, интерес представляет изучение d1 - факторов – алкилоксибензолов (АОБ), контролирующих рост микроорганизмов и этапность основных стадий их онтогенетического развития. Продукция d1-факторов клетками бактерий характерна для широкого круга как грамнегативных, так и грампозитивных микроорганизмов
(Г.И. Эль-Регистан, 1988; Е.С. Бабусенко с соавт, 1991; А.Л. Мулюкин, 1996). Алкилоксибензолы являются адаптогенами, проявляют антиоксидантную активность (Ю.А. Николаев и др., 2004), взаимодействуют с ДНК (О.К. Давыдова, 2006), стабилизируют и модулируют активность белков (А.И. Колпаков 2000, Е.И. Мартиросова, 2007). Однако открытым остается вопрос о влиянии алкилоксибензолов на важнейшие физиологические функции выживания бактерий - рост микроорганизмов и их персистентные характеристики, что и предопределило цель нашей работы.
Цель и задачи исследования
Цель исследования - изучение влияния алкилоксибензолов на ростовые и персистентные свойства микроорганизмов.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
-
Изучить влияние алкилоксибензолов на структуру популяции различных микроорганизмов по антилизоцимному признаку.
-
Оценить воздействие алкилоксибензолов на популяции грамнегативных и грампозитивных микроорганизмов по способности формировать биопленки.
-
Изучить влияние алкилоксибензолов на кинетику роста исследуемых микроорганизмов.
-
Выявить особенности структуры популяций условно - патогенной микрофлоры и представителей нормофлоры по персистентным и ростовым характеристикам при влиянии на них алкилоксибензолов.
Новизна исследования
Установлено, что алкилоксибензолы – (метилрезорцин и гексилрезорцин) оказывали влияние на ростовые свойства, антилизоцимную активность бактерий и их способность формировать биопленки.
Предложено использование метода популяционного анализа для оценки влияния алкилоксибензолов на персистентные свойства микроорганизмов (по антилизоцимному признаку и способности образовывать биопленки), выявляющего особенности структурных перестроек популяции условно-патогенных микроорганизмов и представителей нормальной микрофлоры человека.
Установлено, что действие АОБ на популяции условно-патогенных бактерий и представителей нормофлоры по антилизоцимному признаку различалось перестройкой структуры популяции микроорганизмов – более выраженным снижением антилизоцимной активности у условно-патогенных бактерий в сравнении с представителями нормальной микрофлоры.
Выявлена связь структуры алкилоксибензолов с их ингибирующим влиянием на антилизоцимную активность бактерий. Препарат алкилоксибензола с короткой цепочкой алкильного радикала – метилрезорцин (С7-АОБ) вызывал снижение среднего уровня АЛА микроорганизмов за счет появления клонов без антилизоцимного признака и исчезновения клонов с высоким уровнем АЛА, тогда как препарат алкилоксибензола с длинной цепочкой алкильного радикала - гексилрезорцин (С12-АОБ) не изменяя среднепопуляционного уровня АЛА бактерий, увеличивал долю клонов с высокой способностью ингибировать лизоцим, наряду с сохранением числа клонов с отсутствием данного признака.
Изменения ростовых свойств аутохтонных и аллохтонных бактерий и их способности формировать биопленки под воздействием АОБ имели различия, которые характеризовались усилением изученных функций у бифидобактерий и лактобацилл и их угнетением у представителей условно-патогенных микроорганизмов (K. pneumoniae, гемолитическая E. coli,
B. cereus, S. aureus).
Практическая значимость
Полученные в работе данные расширяют теоретические представления о механизмах выживания бактерий под влиянием алкилоксибензолов.
Методика популяционного анализа для оценки влияния алкилоксибензолов на ростовые и персистентные свойства микроорганизмов пригодна для изучения механизмов «quorum sensing» в бактериальных сообществах и может быть использована для отбора и тестирования различных препаратов, в том числе синбиотиков в научно-исследовательских и производственных лабораториях.
Кроме того, полученные данные могут быть использованы для разработки ингибиторов образования биопленок УПМ и веществ, обладающих антиперсистентным действием, пригодных для борьбы с условно-патогенной персистирующей микрофлорой, что открывает перспективу для создания новых синбиотиков с целью коррекции дисбиотических состояний микробиоценозов организма человека.
Положения, выносимые на защиту:
-
Алкилоксибензолы регулируют важнейшие физиологические функции выживания бактерий - ростовые и персистентные характеристики, проявляя выраженный дозозависимый эффект.
-
В среде культивирования алкилоксибензолы стимулируют рост и биопленкообразование аутохтонной микрофлоры, обеспечивая преимущество её развития по сравнению с аллохтонными бактериями.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на:
- VI Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009).
- XII и XIII Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2009, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 111 отечественных и 113 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 22 таблицами и 9 рисунками.
Связь работы с научными программами
Диссертационное исследование выполнено по открытому плану НИР, номер регистрации 0120. 0 853339. Отдельные фрагменты исследования выполнены по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», в рамках проекта № 09-П-4-1007 «Механизмы формирования и регуляция ассоциативного симбиоза человека», а также в рамках целевой программы поддержки интеграционных проектов № 09-И-4-3001 «Выявление биомишеней и разработка способов регуляции персистентного потенциала микроорганизмов».
Способы межклеточных взаимодействий микроорганизмов
Признание того факта, что бактерии и одноклеточные организмы связаны друг с другом сложными системами межклеточных взаимоотношений, привело к необходимости изучения «языка» на котором они «разговаривают друг с другом».
Еще Иерусалимский Н.Д. (1952), писал, что культура бактерий «развивается как нечто целое». Очевидно, одним из аспектов целостности популяции микроорганизмов является постоянное взаимодействие между составляющими ее клетками, обмен информацией между ними — коммуникация.
В настоящее время исследователи выделяют три канала или способа передачи информации между микроорганизмами: 1) механический (контактный) (Николаев Ю.А., 2000); 2) коммуникативный, опосредованный физическими полями, иначе называемый дистантным взаимодействием (Казначеев В.П., Михайлова Л.С., 1985) или вторичным биогенным излучением (Кузин A.M., 1997), митогенетическим излучением (Гурвич А.Г., Гурвич А.Д., 1945), вторичным биогенным излучением (Кузин A.M., 1997) или физическим сигналом (Matsuhashi М., 1995); 3) химический (посредством химических соединений) (Хохлов А.С., 1988; Kaprelyants A.S., Kell D.G., 1996; Wirth, 1996).
Механический способ передачи информации заключается в том, что некоторые из плотностно-зависимых процессов включают в себя стадии, контролируемые недиффундирующими химическими факторами. Они прикреплены к генерировавшей их клетке, и их восприятие рецепторами другой клетки требует непосредственного межклеточного контакта. Так, в голодающей популяции миксобактерий Myxococcus xanthus наблюдается агрегация клеток с последующим формированием плодовых тел со спорами. Процесс находится под контролем как диффундирующих, так и не-диффундирующих химических факторов. Поздние его стадии, когда клеточная агрегация уже идёт в течение 6 часов и необходимо обеспечить достаточно компактную укладку клеток для формирования спор, контролируются недиффундирующим факторами, прикреплённым к поверхности клетки, белковым фактором С (продукт гена csgA) (Whittaker R. Et al., 1971; Starck S. et al. 2000). Мутанты по гену csgA не способны к согласованным клеточным движениям, необходимым для компактного расположения палочковидных клеток М. xanthus; эти мутанты не формируют и плодовых тел. Идентифицировано по крайней мере 16 генов, экспрессия которых зависит от фактора С (Starck S. et al. 2000).
Дистантные взаимодействия наименее изучены из всех видов коммуникаций, в связи с тем, что плохо выявляются, а определяются количественно (Николаев Ю.А., 2000). Относительно природы физических сигналов можно предполагать широкий спектр сигналов электромагнитных и акустических полей, генерируемых при внутриклеточных процессах. Ми-тогенетическое излучение, обнаруженное впервые Гурвичем А.Г. (1945), и взаимодействие микроорганизмов (Казначеев В.П., Михайлова Л.П., 1985) в УФ диапазоне подтверждено многими авторами (Николаев, 1992; Wainwrightetal 1997). Получены факты, свидетельствующие в пользу генерации в клетках информационных сигналов в видимом и ИК диапазоне (Кузин A.M. 2000, Белоусов Л.В. и др., 1997).
Наиболее изученным остается химический способ коммуникации. Первоначально внимание исследователей межклеточной коммуникации микроорганизмов привлекало изучение отдельных микробных процессов, участвующих в их регуляции. Исследования в этом направлении велись медленно. Некоторые процессы и вещества, участвующие в них, освещались односторонне и поверхностно (Хохлов А.С., 1988). Постепенная смена микробиологических парадигм привели к зарождению биосоциального подхода к микроорганизмам (онтогенетическая теория) (Олескин А.В., 1993).
Детальный анализ межклеточных и межпопуляционных взаимоотношений привел к возникновению новой науки - биосемиотики, предметом изучения которой стала биокоммуникация — обмен информацией или ее получение от других живых объектов. С точки зрения биосоциального подхода, примеры биокоммуникаций у микробных клеток можно рассматривать как проявление социальных явлений, таких как, например, апоптоз и альтруизм. Явление апоптоза было изучено на животных и растительных клетках (Green D.R., 1998; Raff М. 1998), тогда как у микроорганизмов находится лишь на стадии изучения. Хорошо изучены ауторегуляторные системы эукариотических микроорганизмов миксомицета D. discoideum и миксобактерий, у которых в течение жизненного цикла выявлена стадия автолиза многих клеток плодового тела, за счет чего интактные клетки трансформируются в покоящиеся формы (Wireman J.W., Dworkin М., 1977; Kaiser D., 1986; Dworkin M., 1996; Dao D.N. et. al. 2000). Трансформация D. discoideum из одноклеточных амеб в многоклеточный мигрирующий псевдоплазмодий и далее в плодовое тело со спорами представляет собой кол лективную реакцию на голодание клеточной популяции (Kaiser D., 1986; Yarmolinsky M.D., 1995; Dao D.N.et. al. 2000). Когда многоклеточный псевдоплазмодий начинает строить плодовое тело, клетки в передней четверти претерпевают апоптоз. Мертвые клетки формируют плодовую ножку (Devreotes Р., 1989).
Еще одним примером может служить гибель части клеточной популяции Е. coli в условиях остановки роста бактериальной популяции (Акайзин Е.О. с соавт.1990). Голодающая популяция Е. coli подразделяется на субпопуляции, одна из которых, гибнет и подвергается автолизу, а вторая использует этот субстрат для роста и образует колониеобразующие единицы (Акайзин Е.О. с соавт.1990).
В последнее время межклеточную коммуникацию у микроорганизмов стали рассматривать неразрывно с эффектами кворума в системе (Kaiser D., Losick R., 1993; Kell D.G. et al., 1995; Salmond G.P.S. et al., 1995; Greenberg E.P.et al., 1996).
Целый ряд монографий, а также специализированных обзоров и статей посвящены изучению механизмов «общения» микроорганизмов посредством диффузии малых молекул (Fuqua W.C., 1994; Sheet al R., 2009), названных впоследствии индукторами «quorum sensing» (QS).
Термин «чувство кворума» было предложено Fuqua W.C. в 1994 году и означает восприятие клетками бактерий изменений среды, которые наступают при достижении микробной культурой некоторой пороговой численности с соответствующей реакцией на эти изменения. «Обязательными компонентами QS систем являются низкомолекулярные сигнальные молекулы - аутоиндукторы (АИ), легко диффундирующие через клеточную мембрану, и рецепторные белки, с которыми аутоиндукторы связываются» (Хмель И.А., 2006). Существуют различные типы аутоиндукторов QS-систем регуляции бактерий (таблица 1).
Влияние алкилоксибензолов на антилизоцимную активность грамнегативных микроорганизмов
Результаты исследования влияния алкилоксибензолов на антилизоцимную активность популяции грамнегативных бактерий представлены в таблице 3.
Популяция Klebsiella pneumoniae № 278 в контроле (без внесения С7-АОБ) характеризовалась высоким среднепопуляционным уровнем антилизоцимной активности и была представлена клонами с различной выраженностью АЛА. Подавляющая часть клонов К. pneumoniae (80%) находилась в области высоких и средних значений изучаемого свойства.
При изучении влияния метилрезорцина в концентрации 0,1 мкг/мл на популяцию К. pneumoniae, было установлено отсутствие изменений среднего уровня антилизоцимной активности и внутрипопуляционнои диссоциации исследуемых штаммов клебсиелл по сравнению с контролем.
При увеличении концентрации С7-АОБ в среде культивирования до 1,0 мкг/мл и 10,0 мкг/мл имело место снижение среднего уровня антилизоцимного признака К. pneumoniae на 43 % и 59 % от исходных значений признака (р 0,05). Наряду с этим происходила внутрипопуляционная перестройка исследуемого штамма в сторону снижения доли клонов с высокими и средними значениями АЛА, увеличения доли клонов с низким уровнем изучаемого свойства, а также появлением доли клонов, не обладающих способностью к инактивации лизоцима. Наибольшая часть клонов клебсиелл (85-100 %) определялась в области низких значений изучаемого свойства.
Аналогичная тенденция была выявлена при исследовании влияния метилрезорцина на популяцию Escherichia coli № 101. Популяция кишечной палочки в контроле (без внесения С7-АОБ) характеризовалась высокой среднепопуляционной выраженностью антилизоцимной активности и была представлена клонами с различным уровнем данного свойства, а наибольшая часть клонов Е. coli (85%) определялась в области высоких и средних значений АЛА.
Внесение в среду метилрезорцина в концентрации 0,1 мкг/мл на популяцию Е. coli не оказало влияния на изменение среднего уровня антилизоцимной активности и внутрипопуляционной диссоциации исследуемых штаммов кишечных палочек по сравнению с контролем.
Увеличение концентрации метилрезорцина в среде культивирования до 1,0 мкг/мл и 10,0 мкг/мл приводило к снижению среднего уровня антилизоцимной активности на 48 % и 58 % от контрольного уровня свойства (р 0,05). Наряду с этим происходила перестройка популяции Е. coli в сторону снижения доли клонов с высокими и средними значениями исследуемого свойства, увеличения доли клонов с низкими значениями АЛА, а также появление клонов, не обладающих способностью инактивировать лизоцим. Наибольшая часть клонов кишечных палочек (70-100 %) определялась в области низких значений изучаемого свойства.
При изучении влияния другого препарата из группы алкилоксибензолов гексилрезорцина (С12-АОБ) на динамику популяции грамнегативных микроорганизмов по антилизоцимному признаку (таблица 4) было установлено, что концентрация гексилрезорцина 0,1 мкг/мл в среде культивирования также не оказывала влияния на изменение среднепопуляционного уровня АЛА и перестройку популяции К. pneumoniae.
При внесении в среду С12-АОБ в концентрации 1,0 мкг/мл среднее значение антилизоцимного признака у К. pneumoniae не изменялось, за счет того, что клоны, обладающие высокими значениями антилизоцимной активности оставались на высоком уровне в пределах физиологических колебаний, а снижалась доля клонов со средним и низким уровнем свойства, а также появлялась "доля клонов с отсутствием антилизоцимного признака 50% клонов клебсиелл находились в области низких значений, изучаемого свойства.
Дальнейшее увеличение концентрации гексилрезорцина в среде до 10,0 мкг/мл не способствовало дальнейшим изменениям среднего уровня АЛА и перестройки популяции клебсиелл в сравнении с предыдущей концентрацией. Наибольшая часть клонов клебсиелл (55 %) определялась в области высоких значений изучаемого свойства.
Сходные данные были получены при изучении влияния различных концентраций гексилрезорцина на антилизоцимную активность Escherichia coli № 101.
Внесение в среду гексилрезорцина в концентрации 0,1 мкг/мл на популяцию Е. coli не оказало влияния на изменение среднего уровня антилизоцимной активности и внутрипопуляционной диссоциации исследуемых штаммов кишечных палочек по сравнению с контролем.
Увеличение концентрации гексилрезорцина в среде культивирования до 1,0 и 10,0 мкг/мл не приводило к изменению среднепопуляционного уровня антилизоцимной активности Е. coli, за счет того, что клоны, обладающие высоким значением АЛА, сохранялись на прежнем уровне, в пределах физиологических колебаний, а снижалась доля клонов со средним и низким значениями антилизоцимной активности и появлялись клоны, не обладающие способностью инактивировать лизоцим. Наибольшая часть клонов Е. coli (60-65 %) определялась в области высоких значений изучаемого свойства.
При сравнении действия изученных препаратов (метилрезорцин, гексилрезорцин) на антилизоцимную активность популяции грамнегативных бактерий (рисунок 1) был выявлен дозозависимый эффект, характеризующийся тем, что при увеличении концентрации исследуемых препаратов в среде нарастали изменения в структуре популяции грамнегативных микроорганизмов. При действии метилрезорцина происходило исчезновение клонов с высоким уровнем АЛА и увеличение доли клонов с низким значением свойства.
Тогда как гексилрезорцин не изменял количество клонов с высоким уровнем антилизоцимной активности и снижал долю клонов с низким значения АЛА-признака. Также отмечено одинаковое влияние исследуемых препаратов на клоны со средним значением антилизоцимной активности, они снижались, либо полностью исчезали. Максимальные изменения популяционной структуры грамнегативных микроорганизмов отмечались при влиянии изучаемых препаратов концентрации 10,0 мкг/мл.
Биопленкообразование грампозитивных микроорганизмов под влиянием алкилоксибензолов
Популяция Bacillus cereus № 279 в контроле (без внесения С 7-АОБ) характеризовалась среднепопуляционным уровнем биопленкообра-зования (0,18±0,01) . Популяция бацилл была представлена клонами с различным уровнем пленкообразования, 40 % клонов находились в области высоких значений изучаемого свойства (таблица 11).
При внесении в среду метилрезорцина в концентрации 0,1 мкг/мл отсутствовали изменения, как среднего уровня, так и внутрипопуляцион-ной перестройки штамма В. cereus в отношении биопленкообразования.
При увеличении концентрации метилрезорцина в среде культивирования до 1,0 и 10,0 мкг/мл отмечалось снижение среднего уровня биопленкообразования на 13 % и 23 % соответственно (р 0,05). Наряду с этим популяция бацилл перестраивалась таким образом, что снижалась (до полного исчезновения) доля клонов с высоким и средним значением биопленкообразования и увеличивалась доля клонов с низкой способностью формировать биопленки. Наибольшая часть клонов (50-90 %) находилась в области низких значений признака.
Установлено, что при внесении метилрезорцина в концентрации 10,0 мкг/мл в среду культивирования были зафиксированы максимальные изменения среднего уровня пленкооборазования и внутрипопуляционной перестройки В. cereus.
Сходные данные были получены при изучении влияния различных концентраций метилрезорцина на популяцию Staphylococcus aureus № 104 по способности формировать биопленки (таблица 11). Оказалось, что концентрация метилрезорцина 0,1 мкг/мл также не оказывала влияния на изменение среднепопуляционного уровня и внутрипопуляционной перестройки S. aureus. При увеличении концентрации метилрезорцина в среде культивирования до 1,0 и 10,0 мкг/мл было выявлено снижение среднего уровня биопленкообразованияна 13 % и 28 % соответственно (Р 0,05).
Популяция стафилококков перестраивалась в сторону снижения (до полного исчезновения) клонов с высоким уровнем изучаемого свойства, снижения клонов со средним уровнем признака и увеличения количества клонов с низкой способностью пленкообразования. Наибольшая часть клонов (65 - 95 %) находилась в области низких значений пленкообразования.
При изучении влияния гексилрезорцина на популяцию грамнпози-тивных микроорганизмов (таблица 12) по способности формировать биопленки было установлено, что концентрация гексилрезорцина 0,1 мкг/мл не оказывала влияния на средний уровень и внутрипопуляционную перестройку по способности образовывать биопленки популяцией Bacillus cereus № 279.
При увеличении концентрации гексилрезорцина в среде культивирования до 1,0 и 10,0 мкг/мл не было отмечено изменения среднего уровня биопленкообразования у бацилл, за счет того, что клоны с высокой способностью пленкообразования оставались на уровне контрольных значений, снижались клоны со средним значением и увеличивались клоны с низким значением изучаемого признака. При этом 40% клонов находились в области высоких значений признака. Максимальные изменения перестройки популяции В. cereus наблюдались при использовании гексилрезорцина в концентрации 10,0 мкг/мл.
При изучении влияния различных концентраций гексилрезорцина на популяцию Staphylococcus aureus № 104 по способности формировать биопленки получены сходные данные, как и при влиянии на популяцию В. cereus. Концентрация гексилрезорцина 0,1 мкг/мл практически не оказывала влияния на изменение среднего уровня биопленкообразования и внутрипопуляционную перестройку S. aureus. При изучении влияния гексилрезорцина в концентрациях 1,0 и 10,0 мкг/мл не было выявлено изменений среднего уровня биопленкообразования стафилококка. Клоны с высокой способностью пленкообразования изучаемого признака снижались и увеличивалась доля клонов с низкой способностью БПО. При этом 40 % клонов находились в области высоких значений изучаемого признака.
Максимальные изменения перестройки популяции S. aureus наблюдались при влиянии гексилрезорцина в концентрации 10,0 мкг/мл.
При сравнении действия метилрезорцина и гексилрезорцина в различных концентрациях на способность популяций грампозитивных микроорганизмов формировать биопленки (рисунок 5) был выявлен дозозависи-мый эффект, характеризующийся тем, что с увеличением концентрации препаратов в среде, нарастали изменения структуры популяции грампозитивных микроорганизмов. При действии метилрезорцина происходило исчезновение доли клонов с высоким уровнем пленкообразования, снижение числа клонов со средним значением изучаемого признака, а также увеличение клонов с низким значением пленкообразования, благодаря чему происходило снижение среднепопуляционного уровня свойства. Однако при внесении в среду гексилрезорцина среднепопуляционный уровень биопленкообразования оставался в пределах контрольных значений, за счет сохранения доли клонов с высоким уровнем свойства и увеличения клонов, не обладающих признаком.
Изменение ростовых свойств представителей нормальной микрофлоры человека под действием алкилоксибензолов
Данные по изучению влияния препаратов алкилоксибензолов на ростовые свойства микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры человека представлены в таблице 19. Как видно из таблицы, лаг-фаза В. bifidum №791 в контроле (без внесения АОБ) продолжалась 1 час. Значения оптической плотности в лаг-фазе варьировали от 0,67 ед.ОП до 0,92 ед.ОП, а прирост биомассы бифидобактерий увеличился на 39 % (р 0,05). Логарифмическая фаза продолжалась 6,5 часов, оптическая плотность нарастала с 0,92 ед.ОП до 1,7 ед.ОП, прирост биомассы составил 80 % (р 0,05). Стационарная фаза роста наступала с 7,5 часов от начала инкубации исследуемого штамма. В данное время наблюдался выход штамма бифидобактерий на фазу «плато», на протяжении которой значения оптической плотности исследуемой культуры варьировали в пределах физиологических колебаний (от 1,71 ед.ОП до 1,72 ед.ОП).
Внесение метилрезорцина в различных концентрациях в среду культивирования не оказывало достоверного влияния на ростовые свойства В. bifidum (рисунок 9). Полученные данные о длительности фаз роста и интенсивности прироста биомассы бифидобактерий не отличались от контрольных значений. Аналогичные данные были получены при влиянии метилрезорцина на ростовые свойства L. acidophilus №1. Лаг-фаза контрольной кривой роста L. acidophilus №1 (без внесения АОБ) продолжалась 1 час. Значение оптической плотности варьировало с 0,65 ед.ОП до 0,92ед.ОП, прирост биомассы исследуемого штамма увеличился на 41% (р 0,05). Лог-фаза продолжалась 6,5 часов, оптическая плотность варьировала 0,92-1,73 ед.ОП, прирост биомассы культуры составил на 84%. Стационарная фаза роста наступала через 7,5 часов от начала инкубирования исследуемого штамма, лактобациллы выходили на фазу «плато», а оптическая плотность на протяжении данной фазы не изменялась.
При внесении метилрезорцина в различных концентрациях в среду культивирования лактобацилл также не было выявлено изменений ростовых свойств. Полученные данные кинетики роста лактобацилл под влиянием мтилрезорцина в различных концентрациях соответствовали контрольным.
Данные по изучению влияния гексилрезорцина на ростовые свойства представителей нормальной микрофлоры человека представлены в таблице 20. Гексилрезорцин в концентрации 0,1 мкг/мл не оказывал влияния на рост бифидобактерий в сравнении с контролем. Внесение гексилрезорцина в среду культивирования в концентрациях 1,0 и 10,0 мкг/мл приводило к стимуляции ростовых свойств В. bifidum № 791, что выражалось в снижении длительности лаг- и лог-фаз, преждевременном выходе в стационарную фазу роста и увеличении интенсивности прироста биомассы бифидобактерий в сравнении с контролем (рисунок 9а). Значения оптической плотности в данной фазе не изменялись. При нарастании концентрации гексилрезорцина в среде культивирования до 1,0 и 10,0 мкг/мл отмечено увеличение средних значений ОП В. bifidum в стационарной фазе роста на 18 % и 32% (р 0,05) соответственно в сравнении с контролем.
Аналогичные данные были получены при изучении влияния гек силрезорцина на популяцию L. acidophilus. Гексилрезорцин в концентра ции 0,1 мкг/мл также не влиял на ростовые свойства лактобацилл. При увеличении концентрации препарата в среде была отмечена стимуляция ростовых свойств лактобацилл, что выражалось в уменьшении продолжительности лаг, лог-фаз и преждевременном выходом на стационарную фазу, а также увеличением прироста биомассы L. acidophilus. Значения оптической плотности на протяжении данной фазы роста не изменялись. Отмечено увеличение средних значений оптической плотности лактобацилл в стационарной фазе роста на 20 % (р 0,05) и 36 % (р 0,05) при внесении препарата в концентрации 1,0 и 10,0 мкг/мл соответственно в сравнении с контролем.
Установлено, что химические аналоги из группы алкилоксибензо-лов метилрезорцин и гексилрезорцин влияют на кинетику роста грам-негативных и грампозитивных бактерий.
Выявлено, что оба препарата оказывали угнетающее действие на ростовые свойства условно-патогенных микроорганизмов, которое проявлялось уменьшением длительности лаг- и лог-фаз роста, преждевременным выходом на стационарную фазу и снижением прироста биомассы исследуемых штаммов.
Отмечено, что препараты алкилоксибензолов у представителей нормальной микрофлоры человека стимулировали рост бактерий, что также выражалось в снижении продолжительности лаг- и лог-фаз роста, преждевременном выходе изучаемых микроорганизмов в стационарную фазу, но увеличении прироста биомассы исследуемых штаммов.
Выявлен дозозависимый эффект, характеризующийся нарастанием угнетающего действия (в случае условно-патогенных бактерий) или стимулирующего влияния (у представителей нормальной микрофлоры человека) на ростовые свойства микроорганизмов при увеличении концентрации исследуемых препаратов в среде культивирования.
