Содержание к диссертации
Введение
Введение 4
1.1. Ароматические амиды и нитрилы 14
1.2. Биотрансформация ароматических амидов и нитрилов 15
1.3. Типы метаболизма ароматических соединений 16
1.4. Ферменты, участвующие в преобразовании нитрилов и амидов 19
1.5. Биотрансформация бензамида 27
1.6. Биотрансформация бензонитрила 27
1.7. Энантиоселективная биотрансформация ароматических амидов и нитрилов 29
1.8. Энантиоселективный гидролиз ибупрофенамида 34
1.9. Энантиоселектвный гидролиз N-ацетил- 2,3-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-4H-1,4-бензоксазина 36
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 38
2.1. Объекты исследования 38
2.2. Среды и субстраты для культивирования 41
2.3. Селекция штаммов-деструкторов ароматических амидов и нитрилов 41
2.4. Определение ростовых характеристик 42
2.5. Определение ферментативной активности 42
2.6. Изучение влияния температуры и рН на удельную активность фермента 43
2.7. Идентификация выделенных культур 44
2.8. Выделение ДНК и полимеразная цепная реакция 46
2.9. Секвенирование ДНК 47
2.11. Гидролиз ибупрофенамида 48
2.12. Гидролиз 2,3-дигидро-7,8-дифтор-3-метил-4H-1,4-бензоксазина (N – aцетилдифторбензоксазина) 49
2.13. Статистическая обработка 50
ГЛАВА 3. Изучение биологического разнообразия микроорганизмов почв и донных отложений, трансформирующих ароматические амиды и нитрилы 51
3.1. Изучение количества и соотношения гетеротротрофных аэробных бактерий почв и донных отложений 51
3.2. Отбор культур, активно трансформирующих ароматические амиды и нитрилы 55
3.3. Идентификация активных штаммов 57
3.4. Анализ генов метаболизма амидов и нитрилов у исследуемых бактерий. 68
3.5. Скрининг изолятов почвенных грибов, утилизирующих нитрилы и амиды. 73
ГЛАВА 4. Биотрансформация ароматических амидов и нитрилов 77
4.1. Изучение влияния состава среды на рост и активность бактерий 77
4.2. Изучение активности ферментов в процессе роста культуры 81
4.3. Определение температурной и рН-зависимости амидазной активности 89
4.4. Биотрансформация бензамида 91
4.5. Биотрансформация амида ибупрофена 93
4.6. Биотрансформация N-амида: N – aцетил-7,8-дифтор-2,3-дигидро-3-метил-4H-1,4-бензоксазина 100
Заключение 106
Выводы 114
Список литературы 115
- Ферменты, участвующие в преобразовании нитрилов и амидов
- Изучение влияния температуры и рН на удельную активность фермента
- Изучение количества и соотношения гетеротротрофных аэробных бактерий почв и донных отложений
- Изучение активности ферментов в процессе роста культуры
Ферменты, участвующие в преобразовании нитрилов и амидов
В живом мире каждая химическая реакция катализируется своим ферментом. Ферменты проявляют высокую специфичность, так например, они способны различать разные молекулы субстратов. Более того, они имеют способность работать при умеренных температурах, давлении и pH, которая делает их привлекательными катализаторами для промышленности (Quax, 2006).
Биокаталитический гидролиз нитрилов проходит по двум различным путям: одностадийный гидролиз до соответствующих карбоновых кислот с выходом аммиака с помощью фермента нитрилазы и двустадийный, при котором нитрил с помощью нитрилгидратазы гидролизуется до амида и далее амидазой до кислоты (Wang, 2005). На сегодняшний день различные нитрил-амид конвертирующие ферменты были выделены и описаны из бактерий, грибов и растений. Производство акриламида и никотиновой кислоты в промышленных масштабах доказали коммерческую значимость этих ферментов (Chen et al., 2009).
В результате множества исследований было показано, что большинство нитрилгидролизующих микроорганизмов имеют либо нитрилазу, либо нитрилгидратазу и амидазу (Banerjee et al., 2002; Wang, 2005; Martinkova et al., 2009). Некоторые микроорганизмы, такие как R. rhodochrous LL 100-21 и R. rhodochrous J1 содержат как нитрилазу так и нитрилгидратазу/амидазу. 1.4.1. Нитрилгидратазы
Нитрилгидратаза, преобразующая нитрилы в соответствующие амиды, является ключевым ферментом в двуфaерментном пути гидролиза нитрилов до кислот (Mascharak, 2002). Фермент имеет и субъединицы в эквимолярном количестве, но их количество изменяется для ферментов из различных микробных источников (Komeda et al., 1997)
Кристаллическая структура и спектроскопические исследования показали, что почти все нитрилгидратазы в активном центре содержат либо негемовое железо, либо кобальт. Fe-нитрилгидратаза и Co-нитрилгидратаза несмотря на разницу в происхождении и каталитических свойств имеют очень похожие структуры (Martinkov et al., 2010; Wang, 2005; Song et al., 2007; Chen et al., 2009). Были предложены несколько механизмов гидратации нитрила, катализируемых Fe- и Co-нитрилгидратазой. Во всех реакциях ион металла принимает участие как кислота Льюиса. В механизме А, азот нитрила координирует непосредственно ион металла и следовательно увеличивается электрофильность атома углерода, что способствует гидратации. В механизмах В и С, метал-связанный гидроксид действует либо в качестве нуклеофила для атаки атома углерода циано группы, либо в качестве главной основы активации молекулы воды в активном центре (рис. 2) (Wang, 2005). Нитрилгидратазы штаммов Rhodococcus sp. R312 (прежде известного как Brevibacterium sp. R312) и P. chlororaphis B23 - первые примеры негемовых железоферментов, содержащих ион с низкой валентностью Fe (III). Активность нитрилгидратазы повышается на свету. Хромофор, вовлеченный в фотоактивацию, является железным комплексом в субъединице. Поэтому эндогенная молекула NO, которая связана с негемовым железным центром в неактивной нитрилгидратазе, освобождается, приводя к восстановлению активности нитрилгидратазы (Maier-Greiner et al., 1991).
Модель предполагаемого каталитического механизма железосодержащих, а возможно, и кобальтсодержащих нитрилгидратаз включает три стадии. Сначала нитрил взаимодействует с гидроксильным ионом (ОH-) молекулы воды, связанной с металлом. Затем гидроксильный ион, связанный с железом, или гидроксил поляризованной ионом металла молекулы воды атакует атом углерода в нитриле с образованием имида (R-C(-OH)=NH). B заключительной фазе реакции имид таутомеризуется в амид (Kobayashi, 1999). В присутствие ионов кобальта, актиномицет R. rhodochrous J1 продуцирует две нитрилгидратазы, в зависимости от индуктора. H нитрилгидратазы действуют предпочтительно на алифатические нитрилы, тогда как L-нитрилгидратазы проявляют более высокое сродство к ароматическим нитрилам. H- и L-нитрилгидратазы использовались для промышленного производства акриламида и никотинамида из акрилонитрила и 3-цианопиридина, соответственно. Обе выделенные нитрилгидратазы содержат кобальт как кофактор. Нитрилгидратаза с кобальтом имеет треонин в-V-C-(T/S)-L-C-S-C-последовательности как активный участок, тогда как у железосодержащих нитрилгидратаз есть серин. Различие в металлических кофакторах может быть приписано различным аминокислотным остаткам в этом положении. Анализ кристаллической структуры кобальт-содержащих нитрилгидратаз Pseudonocardia thermophila JCM3095 показал, что и кобальт (III) и Fe (III) находятся в схожей окружающей среде. Остаток триптофана (Trp 72), который может быть вовлечен в закрепление субстрата в кобальт 22 содержащем ферменте заменяет остаток тирозина в Fe (III) - содержащем ферменте. Он, вероятно, отвечает за то, что нитрилгидратазы с кобальтом предпочитают ароматические, а не алифатические нитрилы (Kobayashi, Shimiru, 1998). Демаковым В.А. и коллегами была выделена термостабильная нитрилгидратаза из штамма Rhodococcus ruber GT, которая применяется для биотехнологического синтеза акриламида гидратацией акрилонитрила в водных растворах (Демаков и др., 2004). Bauer R. и коллегами выделена энатиоселективная нитрилгидратаза из Agrobacterium tumefaciens strain d3, которая была полностью отделена от амидазы. Данная нитрилгидратаза имеет температурный оптимум 40С и оптимум рН 7,0. Холофермент имеет молекулярную массу 69 кДа, субъединицы – 27 кДа. Фермент гидролизует 2-арилпропионитрилы и другие ароматические и гетероциклические нитрилы (2-фенилпропионитрил, 2 фенилбутиронитрил, 2-(4-хлорфенил)-пропионитрил, 2-(4-метокси) пропионитрил или кетопрофен нитрил) до соответствующих S-амидов. Более высокие значения энантимерного избытка были обнаружены при использовании очищенного фермента, чем при использовании цельноклеточного препарата в присутствии ингибитора амидазы. Энатиоселективность реакции с использованием целых клеток была улучшена путем увеличения температуры (Bauer et et, 1998). Клетки R. erythropolis ATCC 25544 с помощью энантиоселективных нитрилгидратазы и амидазы продуцировали 45 мМ (S)-2,2-диметилциклопропанкарбоновую кислоту из рацемического 100 мМ 2,2-диметилциклопропан карбонитрила с энантиомерным избытком 81,8% после 64 часовой реакции (Yeom et al., 2007). 1.4.2. Амидазы Амидазы - ферменты расщепляющие амиды, катализируют гидролиз амидов до карбоксилатов и аммония и присутствуют во всех царствах живого мира (Fournand, Arnaud, 2001; Лавров и др., 2010). Амидазы являются широко распространенными ферментами в живой природе и могут быть разделены на два типа. Первый тип включает алифатические амидазы, гидролизующие только короткоцепочечные алифатические амиды. Второй тип включаeт алифатические амидазы, гидролизующие амидные цепочки средней величины, некоторые ариламиды, a-аминоамиды и a-гидроксиамиды (Fornaud, Arnaud, 2001). Все эти амидазы проявляют ацилтрансферазную активность, ведущую к формированию гидроксамовых кислот. Некоторые из них также способны трансформировать разнообразные амиды, кислоты, сложные эфиры или нитрилы в соответствующие им карбоновые кислоты, гидроксамовые кислоты или кислотные гидразиды (Fornaud, Arnaud, 1997).
На сегодняшний момент роль амидаз в живом мире не определена. Однако в течение последних лет стало много известно об эволюционных аспектах этих ферментов и катализируемых амидазой реакций in vitro. Амидазы оказались эффективным инструментом для синтеза различных соединений (Chen et al., 2009).
Среди грибов-продуцентов амидаз наиболее изучена амидаза Aspergillus nidulans. Описано несколько амидаз: формамидаза, активность которой проявляется в присутствии формамида и глицинамида, в качестве субстрата; ацетамидаза, гидролизующую короткоцепочечные алифатические амиды до 6 атомов углерода; амидазы, проявляющие активность с алифатическими амидами (бутирамид, валерамид, гексаноамид) и с aриламидами (амид бензойной кислоты, фенилацетамид) (Fournand , Arnaud, 2001).
Изучение влияния температуры и рН на удельную активность фермента
Для изучения влияния температуры и рН бактерии культивировали в течение 2-3 сут., в зависимости от пика активности, на миниральной среде N с добавлением субстрата. Клетки промывали калий-натриевым фосфатным буфером. Реакцию проводили в термостатах «Термит» и термошейкерах TS100C BIOSAN (диапазон температур 5-80С, шаг 5С) с добавлением акриламида в течение 10 мин, останавливали добавлением 20 мкл НС1 конц., затем смесь центрифугировали 10 мин при 13 тыс. об. Для изучения влияния кислотности среды на активность фермента конверсию акриламида проводили в калий-фосфатном буфере в диапазоне рН 3-12 с шагом рН=1. Продукты реакции анализировали с помощью газовой хроматографии.
Газовую хроматографию продуктов трансформации амида проводили на хроматографе Chrom 5d ("LP", Чехословакия), оснащенном пламенно-ионизационным детектором. Хроматографическая колонка длиной 2 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена твердым носителем полисорб-1, фракция 0,25-0,5 мм ("Реахим", Россия). Газ-носитель азот подавался с объемным расходом 35 см3/мин. Температура термостата 190+3С, температура испарителя 220+10С. В качестве стандартов использовали растворы чистых акриламида и акриловой кислоты .
Таксономический анализ штаммов проводили на основании стандартных культурально-морфологических, биохимических и хемотаксономических характеристик по определителю бактерий Берджи (Определитель бактерий…, 1997), а также используя руководства О.А. Нестеренко и соавт. (Нестеренко и др., 1985) и И.Б. Ившиной (Ившина и др., 1987). Для определения группы бактерий по Граму, проводили стандартное общепринятое окрашивание, а также тест с 3% КОН. Определение аминокислот и сахаров клеточной стенки проводили стандартными методами ТСХ. Для определения мезо-диаминопимелиновой кислоты (мезо-ДАПК) в ампулу добавляли 10 мг сухой биомассы и 0,1 мл 6Н H2S04. Запаянную ампулу автоклавировали в течение 3 ч при 120С. Затем вскрывали охлажденную ампулу и на хроматографическую пластинку наносили 10 мкл гидролизата. Контролем служили 0,1 М растворы мезо-ДАПК, лизина и орнитина. Для разделения аминокислот использовали систему растворителей в соотношении 80:26:10:4 – метанол : дистиллированная вода : пиридин : 6Н HCl. По истечении 2-3 часов пластинку опрыскивали 0,5 % раствором нингидрина в ацетоне, высушивали и прогревали 2 минуты при 100C. Пятна мезо-ДАПК имели оливковый цвет. Для выявления сахаров 10 мг сухой биомассы помещали в ампулу и добавляли 0,1 мл 1Н H2SO4. Запаянную ампулу автоклавировали в течение 30 мин при 120С. Затем вскрывали охлажденную ампулу и на хроматографическую пластинку Sorbfil наносили 4 мкл гидролизата. В качестве контроля использовали раствор, содержащий галактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу в концентрации 1,0 %. Для разделения сахаров использовали систему растворителей в соотношении 4:1:1 бутанол : уксусная кислота : дистиллированная вода. По истечению 3-4 часов хроматограмму обрабатывали раствором, содержащим 5 г анилинфталата в 100 мл водонасыщенного бутанола. Высушивали и прогревали 4 минуты при 100С. Пятна гексоз окрашивались в буро-коричневый цвет, пентоз - в розово-коричневый.
Для видовой идентификации были разработаны праймеры к консервативным участкам генов 16S рРНК на основе анализа нуклеотидных последовательностей, приведенных в базе данных GenBank. Праймеры были синтезированны в ООО «Евроген», г. Москва (табл. 3). В качестве контрольных вариантов использовались штаммы R. erythropolis 7т, 17, 19, R. ruber 63, 72 и R. rhodochrous 67т из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов, предоставленные чл.-корр. РАН И.Б. Ившиной (номер во Всемирной федерации коллекций культур – WFCC 768). При выполнении исследовний использованы молекулярно-генетические методы, ранее оптимизиорованные в работе Ю.А. Павловой (Павлова, 2012). Выделение ДНК проводили фенольным методом. В центрифужных пробирках «Эппендорф» ресуспендировали клетки в количестве одной микробиологической петли в 0,5 мл раствора SSC следующего состава: NaCl 0.15 М, цитрат натрия 0.015 М, лизоцим 5 мг. Реакцию проводили 30 мин при 37 С. К полученному раствору добавляли 50 мкл 20% раствора SDS. Данная реакция протекала в термостате при 65 С в течение 10 мин. Затем добавляли фенол в количестве 0,5 мл, центрифугировали 10 мин. при 13000 об./мин. Водную фазу переносили в новую микропробирку. Добавляли 0,5 мл хлороформа, после перемешивания центрифугировали 3 мин. при 13000 об./мин. Супернатант снова переносили в новую микропробирку, к которому добавляли 0,5 мл изопропанола, центрифугировали 13 тыс. об./мин в течение 3 мин. Смесь охлаждали при -18 С 1 ч. Центрифугировали 5 мин. при 13000 об./мин. Жидкость сливали, осадок высушивали, растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера (10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 8.0).
ДНК грамотрицательных микроорганизмов выделяли методом кипячения. Клеточную биомассу переносили в микропробирки в количестве одной микробиологической петли. Ресуспендировали в 100 мкл стерильной Н2О. Реакцию проводили при 95С в течение 15 минут в термостате «Термит» (Россия).
Амплификацию ДНК проводили с применением термостабильной Taq-полимеразы производства ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на термоциклере Т3 (Biometra, Германия).
Электрофоретическое разделение продуктов реакции проводили в 1,2 % агарозном геле в трис-боратном буфере (ТВЕ, рН 8,0) при напряженности электрического поля 6 В/см. Агарозные гели окрашивали раствором бромистого этидия (1-2 мкг/мл) в течение 15-20 мин. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры 1kb и 100b (ООО «СибЭнзим»). Визуализацию полос осуществляли c использованием системы гель-документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия).
Изучение количества и соотношения гетеротротрофных аэробных бактерий почв и донных отложений
Исследовано биологическое разнообразие бактерий, способных активно метаболизировать амиды и нитрилы карбоновых кислот, в образцах почв. Было проанализировано 11 различных типов почв таёжной (Прикамье) и степной (Челябинская и Саратовская обл.) зоны России: поверхностно-подзолистая супесчаная, донные речные отложения, дерново-карбонатная, дерново-луговая глеевая почвы, солодь, каштановая почва степной зоны, солончак, грунт 2 м от солеотвала, ил с очистных сооружений (табл. 4). Исследованы наиболее богатые аэробными микроорганизмами верхние слои почв: дернина, гумусовый или элювиальный горизонт, образцы ризосферной зоны растений.
Для первичного отбора микроорганизмов использовали минеральную среду N, содержащую в качестве селективного субстрата ацетонитрил, ацетамид/пропионамид или фенилацетонитрил в качестве единственного источника углерода, азота и энергии в концентрации 10 мМ. Затем произвели очистку культур на богатой среде Луриа-Бертани. Для исследования способности к трансформации ароматических соединений использовали минеральную среду N, содержащую в качестве селективного субстрата бензонитрил или бензамид в концентрации 10 мМ, в качестве источника углерода – 0,1% глюкозу. Было выделено более 300 изолятов микроорганизмов, обладающих способностью к биотрансформации нитрилов и амидов, определено их количество, а также общее число гетеротрофов. Исследования показали, что культуры бактерий, способные активно трансформировать нитрилы и амиды, представлены во всех исследованных типах почв (рис.9).
Наибольшее количество гетеротрофных микроорганизмов обнаружено в образцах отбранных из гумусового дернового горизонта (на глубине 5 см) дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (2,931010 КОЕ). Много гетеротрофов содержалось также в пробах солончака, отобранных в Челябинской области (2,171010 КОЕ) и в пробах грунта в 2 м от солеотвала СКРУ-2 г. Соликамск (2,68109 КОЕ). Очевидно, что это соответствует образцам с наилучшим соотношением питательных веществ, аэрации и увлажнения. Е.В. Даденко и М.А. Репях сообщают, что по обогащенности почв бактериями на МПА солонцы и солончаки отнесятся к богатым почвам (Даденко, Репях, 2006). Бактерии, активно трансформирующие амиды и нитрилы, обнаружены во всех исследованных почвах и донных отложениях в количестве 105-107 КОЕ/г сухой почвы, что составляет от 0,05 до 48,1% (переходный горизонт дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением, глубина отбора проб 20 см) от общего числа гетеротрофов. Наибольшим абсолютным количеством амид-трансформирующих бактерий отличались пробы солончака, отобранные в Челябинской области (3,11х107 КОЕ), образцы из гумусового переходного горизонта дерново луговой почвы с повышенным увлажнением, г. Краснокамск (2,89107 КОЕ) и пробы грунта в около солеотвала (2,32107 КОЕ), а наибольшее количество нитрил-трансформирующих бактерий обнаружено в последних двух из них (3,08х107 и 7,50107 КОЕ). В большинстве образцов почв количество амид и нитрилтрансформирующих бактерий было примерно равным или соотносимым. Это свидетельствует в пользу координированного метаболизма нитрилов и амидов в экосистемах. Кроме того, было показано, что до 86% изолятов, трансформирующих амиды были способны к метаболизму и нитрильных соединений. Преобладание амидтрансформирующих бактерий наблюдалось в образцах гумусового горизонта дерново-луговой почвы и солончака, что может быть связано с повышенным увлажнением данных образфов почв, при котором образцы содержат большое количество грамотрицательных бактерий, среди которых распространена способность активно метаболизировать амидосоединения.
Однако в относительном выражении образцы солончака, гумусового горизонта дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением и солоди показали наиболее низкое процентное содержание нитрил- и амидтрансформирующих бактерий.
Фенилацетонитрил-утилизирующие бактерии представлены во всех типах почв. Наибольшее их количество обнаружено в образцах, отбранных на глубине 5 см дерново-луговой почвы с повышенным увлажнением (3,68106), а также в пробах подзолистой супесчаной почвы (6,25105). Высокая степень встречаемости бактерий, вероятно, связано с тем, что растения продуцируют многие нитрильные соединения, в том числе и фенилацетонитрил (Banerjee et al., 2002; Howden, Preston, 2009; Chen et al., 2009).
Для дальнейшей работы были отобраны 57 штаммов наиболее быстрорастущих культур аэробных микроорганизмов. Исследовали способность микроорганизмов к росту на алифатических (ацетонитрил, пропионамид) и более токсичных ароматических (бензонитрил, бензамид и фенилацетонитрил) субстратах в концентрации 10 мМ. Установлено, что наибольшее предпочтение изоляты отдавали минеральной среде с добавлением пропионамида в качестве источника азота. Наименьшее – средам с ацетонитрилом, бензонитрилом, бензамидом и фенилацетонитрилом. Однако несколько штаммов (25, 26, 30ф, 31ф, 34ф, 35ф) активно росли как на алифатических, так и на ароматических субстратах (табл. 5).
Изучение активности ферментов в процессе роста культуры
Исследовано проявление нитрилгидратазной (табл. 10) активности по отношению к акрилонитрилу в процессе роста изолятов на 10 мМ ацетонитриле. У штаммов R. erythropolis 5212 и 7-1 не обнаруживалось детектируемой нитрилгидратазной активности, что, возможно, связано с наличием нитрилазы. Штаммы R. rhodochrous 1185 (рис. 31), Pseudomonas sp. 35ф (рис. 32), R. erythropolis 13 (рис. 33), R. erythropolis 26 (рис. 34) проявили высокую нитрилгидратазную активность, которая была максимальна после 24 часов роста. После выхода культуры в стационарную фазу наблюдается резкое снижение каталитической активности.
Высокая амидазная активность была выявлена у штаммов R. rhodochrous 1185 (рис. 35), R. erythropolis 416 (рис. 36), P. fluorescens 9нх, R. erythropolis 6РИ. Для данных культур характерно совместное действие нитрилгидратазы и амидазы в первые сутки культивирования и снижение активностей при выходе в стационарную фазу роста. Штаммы R. rhodochrous 38 (рис. 37), R. erythropolis 37, R. erythropolis 25 проявляли активность на 3 сутки роста.Установлено, что штаммы R. erythropolis 13, R. erythropolis В15, R. erythropolis 26, R. rhodochrous 12и и R.fascians 21и имеют незначительную амидазную активность, либо она не детектируется. Штаммы R. rhodochrous 1185, R. erythropolis 416, R. rhodochrous 43 и A. guillouiae 22ио имеют высокие значения активности по отношению к акриламиду. Для данных видов бактерий характерно повышение активности при 50C, что говорит о термостабильности фермента. Также характерно снижение активности при выходе культур в стационарную фазу роста. Исключением является штамм R. rhodochrous 38, проявляющий максимальную амидазную активность при выходе в стационарную фазу.
Проведены эксперименты по исследованию влияния температуры и кислотности реакционной среды на удельную активность фермента при конверсии акриламида целыми клетками в течение 10 мин.
Установлено, что амидаза характеризуется термостабильностью для ферментов мезофильных организмов. Высокая активность сохранялась в интервале температуры от 50 до 65.
Максимум активности в условиях проводимого анализа проявлялся у штамма R. erythropolis 25 при 55С (рис. 38). Подобный профиль сохранялся у большинства исследованных штаммов, имеющих амидазную активность.
При изучении влияния кислотности среды установлено, что амидазная активность максимальна при рН=7. В то же время максимальная скорость гидролиза ибупрофенамида наблюдалась при pH 8,3, что, вероятно, связано со значительным увеличением его растворимости в щелочной среде. Таким образом, если фермент способен работать в слабощелочных условиях, биокаталитическую реакцию рациональнее проводить в слабощелочной среде. (рис. 39). Ферменты разных штаммов проявляли сходные профили рН зависимости.
Таким образом, биокаталитическая реакция наиболее активно проходит в интервале температур 55-65С. Это качество свидетельствует о перспективности изучаемых штаммов для промышленного применения.
Проведены исследования биотрансформации бензамида активными культурами бактерий. Показано, что большинство изолятов быстро накапливают биомассу на среде с бензамидом и глюкозой. Проведена биотрансформация бензамида предварительно выращенными клетками исследуемых культур.
Установлено, что штамм R. erythropolis 7РИ наиболее эффективно трансформирует бензамид с образованием бензойной кислоты (рис. 40) и проявляет наиболее высокую удельную активность (рис. 41).
