Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Биологические свойства возбудителя и вакцинопрофилактика коклюша (обзор литературы) 10
Глава 2. Материалы и методы 34
Глава 3. Исследование состава, токсичности и аллергизирующего действия бесклеточного коклюшного препарата 53
3.1 Исследование состава бесклеточного коклюшного препарата 53
3.1.1 Биохимическая характеристика бесклеточного коклюшного препарата 53
3.1.2 Гельхроматография 55
3.1.3 Электрофорез 57
3.1.4 Иммунохимическая характеристика бесклеточного коклюшного препарата 58
3.2 Исследование токсичности бесклеточного коклюшного препарата 59
3.2.1 Оценка острой токсичности бесклеточного коклюшного препарата 59
3.2.2 Оценка хронической токсичности бесклеточного коклюшного препарата 60
3.2.3 Оценка токсичности в тесте изменения массы мышей 61
3.2.4 Оценка гистаминсенсибилизирующей активности 63
3.2.5 Оценка лейкоцитозстимулирующей активности 64
3.3 Оценка аллергизирующих свойств бесклеточного коклюшного препарата 65
Глава 4. Исследование иммунобиологических свойств бесклеточного коклюшного препарата 67
4.1. Исследование протективной активности 67
4.1.1 Оценка протективной активности по проценту выживаемости мышей 67
4.. 1.2 Исследование возможности адоптивного переноса иммунитета в эксперименте с сингенной трансплантацией спленоцитов 68
4.2 Сравнительная оценка способности корпускулярного и бесклеточного коклюшных препаратов к индукции гуморального иммунного ответа 69
4.3 Оценка активности кроличьих коклюшных сывороток 70
4.4 Получение аффинноочищенных коклюшных антител и использование их для конструирования коагглютинационных реагентов 72
4.5 Исследование коклюшных сывороток в тестах пассивной защиты и реакции нейтрализации на мышах 75
4.6 Определение аффинности коклюшных антител 76
4.7 Исследование возможности переноса клеток памяти на мышах линии BALB/c 80
4.8 Сравнительная оценка иммуномодулирующей активности коклюшных препаратов в реакции бласттрансформации лимфоцитов с Т-клеточным митогеном 81
4.9 Сравнительная оценка активности коклюшных препаратов в реакции бласттрансформации лимфоцитов с клетками В. pertussis 82
4.10 Сравнительная оценка интенсивности воспаления при реакции гиперчувствительности у животных, иммунизированных бесклеточным и корпускулярным коклюшными препаратами 83
ГЛАВА 5. Исследование иммунобиологической активности комбинированных вакцин с корпуску лярным и бесклеточным коклюшным компонентами 93
Обсуждение 97
Выводы 102
Список литературы
- Исследование состава бесклеточного коклюшного препарата
- Иммунохимическая характеристика бесклеточного коклюшного препарата
- Оценка протективной активности по проценту выживаемости мышей
- Исследование коклюшных сывороток в тестах пассивной защиты и реакции нейтрализации на мышах
Введение к работе
Актуальность проблемы. Несмотря на несомненные успехи вакцинопрофилактики, проводимой на протяжении более 40 лет, коклюш остается серьезной проблемой здравоохранения не только России, но и мирового сообщества в целом [16, 60, 65, 119]. В мире ежегодно заболевает коклюшем около 60" млн. человек, а умирает около 1 млн. [27].
Многолетняя практика применения АКДС-вакцины, показала эффективность ее использования для специфической профилактики коклюша, дифтерии и столбняка. Тем не менее, немаловажной проблемой при применении этого препарата является его высокая реактогенность. По данным Н.В. Медуницына [15, 16, 29], в 1990-1997 гг именно на АКДС-вакцину приходилось свыше 60% всех неврологических поствакцинальных осложнений. Реактогенность комбинированного препарата в основном опосредована именно коклюшным компонентом, представленным суспензией клеток возбудителя коклюша Bordetella pertussis.
Успехи в области изучения структуры возбудителя, физиологической^ активности микробных продуцентов, выделения и фракционирования бактериальных антигенов, определяют перспективы создания новых более совершенных вакцинных препаратов. В этой связи важной проблемой в области специфической профилактики коклюша является поиск пути повышения эффективности и снижения реактогенности современных вакцин. Решением данной проблемы может стать разработка^ и внедрение в отечественную медицинскую практику вакцин на основе изолированных антигенов коклюшных бактерий (бесклеточных коклюшных вакцин).
Зарубежная практика применения бесклеточных коклюшных вакцин показывает значительное меньшую их реактогенность в сравнении, с корпускулярными [38, 56, 66, 87, 108, 139]. Это обстоятельство определяет высокую привлекательность для использования именно бесклеточных коклюшных вакцин, что позволит избежать таких побочных явлений как геморрагия, дегенеративные изменения в тканях печени, селезенки, почек, сопровождающих вакцинацию корпускулярной вакциной [62, 105]. Низкая
б реактогенность бесклеточных вакцин позволяет использовать их для
бустерной вакцинации у подростков и взрослых [3, 98]. Последнее является
немаловажным достоинством бесклеточных вакцин, в связи с тем, что в
эпидемический процесс в современных условиях все чаще вовлекаются
подростки и взрослые, среди которых заболевание протекает тяжело, нередко
приводя к формированию осложнений (пневмонии, стойкие неврологические
нарушения) и летальных исходов [20, 120, 145].
Существуют как монокомпонентные бесклеточные коклюшные вакцины, включающие в себя только коклюшный токсин, так и вакцины, содержащие до пяти компонентов: коклюшный токсин, филаментозный гемагглютинин, пертактин и фимбриальные гемагглютинины [122]. Недостаточная степень изученности влияния различных по своему составу бесклеточных коклюшных препаратов на уровень клинической защиты и различающиеся данные отдельных клинических исследований, не. представляющихся полностью сопоставимыми, вызывают дискуссию о том, какой из компонентов способен обеспечить иммунный* ответ, необходимый-для защиты. В связи с тем, что бесклеточные коклюшные вакцины весьма различаются по своему составу, оценка их протективной активности,, иммуногенности, безвредности представляется крайне важной.
Целью настоящей работы явилось проведение лабораторно-экспериментального (доклинического) исследования иммунобиологических свойств разработанного бесклеточного коклюшного препарата.
Основные задачи исследования
Оценить токсичность и аллергизирующее действие бесклеточного коклюшного препарата.
Изучить иммуногенность бесклеточного коклюшного препарата на экспериментальных животных.
3. Сконструировать комбинированную вакцину для профилактики
дифтерии, столбняка и коклюша с использованием бесклеточного
коклюшного компонента и оценить ее иммуногенность на
экспериментальных животных.
Научная новизна. Впервые проведена комплексная оценка токсичности и иммуногенной активности отечественного бесклеточного . коклюшного препарата в сравнении с используемой цельноклеточнои вакциной. В экспериментах показано отсутствие у бесклеточной коклюшной вакцины токсичности, аллергизирующей, гистаминсенсибилизирующей и лейкоцитозстимулирующей активностей. Новая бесклеточная коклюшная вакцина подобно цельноклеточнои защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом В. pertussis 18323, вызывает образование специфических антител, повышает пролиферативный ответ лимфоцитов в культурах с коклюшной суспензией, обеспечивает протективную активность в тесте сингенного переноса спленоцитов. Протективная активность и аффинность антител, образующихся в ответ на иммунизацию бесклеточным и цельноклеточным препаратами, оказались сходными. Пролиферативный ответ лимфоцитов in vitro на фитогемагглютинин после иммунизации'* бесклеточной коклюшной вакциной выше, чем после иммунизации цельноклеточнои. Патоморфологические исследования показали значительно»1 меньшую степень выраженности вторичной альтерации в тесте гиперчувствительности при введении бесклеточного препарата. Теоретическое и практическое значение работы: Полученные результаты уточняют представления о природе приобретённой противококлюшной резистентности. Принципиально важно, что новая бесклеточная коклюшная вакцина обладает сходной с традиционной цельноклеточнои вакциной протективной активностью и иммуногенностью при меньшей токсичности.
Проведенные исследования - существенная часть доклинических испытаний новых вакцин на пути их продвижения* в практику, в частности, для представления в Государственный Институт стандартизации и контроля им. Л.И. Тарасевича. Результаты исследований используются в лекционных курсах "Иммунология", "Экспериментальная иммунопатология и иммунотерапия" кафедры микробиологии и иммунологии ГОУ ВПО "Пермский государственный университет"
(614600, г. Пермь, ул. Букирева, 15). В лекционном курсе «Биотехнология» кафедры- промышленной технологии лекарств* с курсом биотехнологии ГОУ ВПО "Пермская государственная фармацевтическая академия" (614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Бесклеточный коклюшный препарат обладает более низкой
токсичностью и аллергизирующей активностью в сравнении с
цельноклеточной вакциной.
Новая бесклеточная-коклюшная вакцина подобно цельноклеточной защищает мышей от интрацеребрального заражения вирулентным штаммом В. pertussis 18323 и формирует клетки иммунологической памяти; которые функционируют при сингенном переносе протективного иммунитета.
Бесклеточная и традиционная цельноклеточная коклюшные вакцины обладают сопоставимой способностью- к индукции иммунного< ответа. Стимулирующее влияние бесклеточного* препарата на пролиферацию. Т-лимфоцитов в, культурах с фитогемагглютинином более выражено, а проявления вторичной альтерации при реакции гиперчувствительности менее значительны.
Замена в вакцине АКДС цельноклеточного коклюшного компонента на новый бесклеточный создает новую комбинированную вакцину, которая не уступает традиционной по иммуногенной активности.
Апробация работы и публикации. Основные положения работы доложены, на Межрегиональной" конференции* молодых ученых «Современные проблемы, экологии, микробиологии и»иммунологии», Пермь, 2002; Международной конференции'молодых ученых «Биология - наука XXI века», Пущино, 2004; Международной научной конференции «Студент и научно-технический прогресс», Новосибирск, 2005; Объединенном иммунологическом форуме, Санкт-Петербург, 2008. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ. Диссертационная работа
апробирована на расширенном заседании научных проблемных комиссий по микробиологии, аллергологии и иммунологии Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (Пермь, 2007) и рекомендована к защите.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 118 стр. машинописного текста, содержит 28 таблиц и 10 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав экспериментальных исследований, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 149 источников литературы, из них 37 отечественных и 112 иностранных авторов.
Связь работы с научными программами. Диссертационная работа выполнена в соответствии с основным планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (номер госрегистрации темы 01.9.70 009928) и Филиала государственного унитарного предприятия «НПО «Микроген» Минздравсоцразвития РФ «Пермское НПО «Биомед».
Исследование состава бесклеточного коклюшного препарата
При биохимической исследовании бесклеточного препарата определяли содержание гексозаминов, нуклеиновых кислот, белков, углеводов. Биохимический анализ антигенных комплексов исследуемых вакцинных препаратов выявил основные компоненты, входящие в данные комплексы. Бесклеточный препарат представляет собой белковополисахаридный комплекс.
Метод определения гексозаминов с помощью реактива Моргана-Элсона позволяет определять аминосахара в липополисахаридах, пептидогликанах и тейхоевых кислотах бактерий. Одним из наиболее значимых биохимических критериев представляется определение содержания в препаратах липополисахарида, как возможного источника реактогенности вакцинного препарата. Установлено, что содержание гексозаминов в исследуемых препаратах находится ниже предела чувствительности метода, что указывает на возможность присутствия лишь минимального количества липополисахаридов в исследуемом бесклеточном коклюшном препарате.
В реакции с орцином показано, что содержание нуклеиновых кислот в бесклеточном препарате ниже предела чувствительности метода. Суммарные данные относительно биохимического исследования бесклеточного препарата приведены в табл. 5.
Одним из наиболее информативных биохимических показателей, характеризующих вакцинные препараты, является содержание белков.
Параллельно с определением содержания белка определяли специфическую активность препарата (табл. 6). В работе были использованы коагглютинационные реагенты, приготовленные на основе антител к корпускулярному антигену (КОА-Р1), а также на основе антител к бесклеточному коклюшному препарату (КОА-Р2), выделенных методом аффинной хроматографии из экспериментальных гипериммунных кроличьих сывороток. Известно, что иммуноглобулины кроликов обладают высокой аффиностью к белку А стафилококка.
Реакцию выполняли в капельном варианте на стекле. В качестве положительного контроля использовали стандартизованную инактивированную коклюшную суспензию. Исследуемый материал в объеме 10-15 мкл наносили на стекло и добавляли 10-15 мкл КОА-реагента. Результаты учитывали по появлению агглютинатов после перемешивания капель осторожным покачиванием стекла.
Нами было показано, что специфическая и удельная активность препаратов, при использовании различных коагглютинационных диагностикумов в высокой степени коррелируют между собой. Данное обстоятельство позволяет говорить об иммунологической полноценности бесклеточного препарата, связывающего антитела к коклюшной клетке.
Полученные в результате гельхроматографического разделения фракции бесклеточного препарата были также проверены на активность в реакции коагглютинации. Как видно из полученных данных (рис. 4), наибольшая серологическая активность была сопряжена с высокомолекулярными компонентами бесклеточного антигена, чьи массы лежат в интервале от 2 000 000 до 100 000 Da. Низкомолекулярные компоненты не проявляют серологической активности и, по-видимому, не обладают протективными свойствами.
Иммунохимическая характеристика бесклеточного коклюшного препарата
В совместных исследованиях с Московским институтом вакцин и сывороток с помощью сэнвич-варианта ИФА и иммуноблотинга установлено, что бесклеточный препарат содержит основные протективные антигены коклюшной клетки: коклюшный токсин, претактин и филаментозный гемагглютинин, а также поверхностные белковые антигены с молекулярной массой 65 и 92 kDa.
Наличие коклюшного токсина выявляли, используя планшеты с иммобилизованным фетуином. В собственных исследованиях присутствие токсина детектировали методом ИФА с использованием подложек с иммобилизованным антитоксическим иммуноглобулином производства НПО «Иммунопрепарат» г. Уфа. В табл. 7 приведены значения оптической плотности образцов серий бесклеточного препарата. Наличие коклюшного токсина в препаратах определялось как в случае использования подложек с фетуином, так в случае использования иммобилизованного антитоксического иммуноглобулина.
Полученные данные свидетельствуют о том, что содержание коклюшного токсина в бесклеточном препарате воспроизводимо в разных сериях.
Несмотря на свою эффективность и обеспечение существенного снижения заболеваемости, вплоть до почти полной ликвидации, корпускулярная коклюшная вакцина (в составе АКДС-вакцины) остается наиболее токсичным препаратом действующего календаря прививок. В силу чего одним из наиболее принципиальных критериев оценки препаратов для профилактики коклюша является оценка токсичности. Токсичность препарата определяли в тестах острой и хронической токсичности, а также в тесте изменения массы мышей. Кроме того нами была оценена остаточная токсичность в тестах на лейкоцитозстимулирующую и гистаминсенсибилизирующую активность. 3.2.1. Оценка острой токсичности бесклеточного препарата
Для определения острой токсичности использовали белых мышей и морских свинок. Результаты наблюдения показали, что введение морским свинкам бесклеточной вакцины внутрибрюшинно однократно в дозе 3,656 мкг и мышам в дозе 0,546 мкг не вызывало гибели животных, не приводило к снижению массы тела (табл. 8), к изменениям волосяного покрова, образованию воспалительных экссудатов, выпотов, некробиотических изменений на месте введения. Состояние животных в опытной группе (поедание корма, двигательная активность) не отличалось от состояния животных контрольной группы.
Морских свинок после однократного внутрибрюшинного введения бесклеточной вакцины вскрывали на 2 и 8 сут. В контрольной и опытной группах внутренние органы животных имели все характерные признаки, расположение и строение. Оболочки, выстилающие внутренние полости, влажные, серовато-розового цвета, без признаков воспаления.
Головной мозг обычной консистенции, мягкая оболочка без изменений, борозды и извилины нормального вида, кровоизлияний нет. Доли легких в норме, покрыты тонкой плеврой, сосуды кровенаполнены. Сердце в норме, обычной консистенции и окраски. Печень обычного цвета, равномерного наполнения, умеренно уплотнена, с гладкой капсулой.
Селезенка в норме, с гладкой капсулой, умеренно плотная, темно-красная. 3.2.2 Оценка хронической токсичности бесклеточного препарата
Для определения хронической токсичности препарат животным внутрибрюшинно вводили ежедневно в течение 10 дней.
Наблюдение за животными проводили в течение периода введения препарата и последующих 7 суток. При этом ежедневно у животных регистрировали следующие показатели:
1. поведение (активность - повышенная или пониженная), походка (мышечный тонус, тремор, балансирование), темперамент (вялость, возбудимость, агрессивность);
2. внешний вид (истощение, ожирение), состояние шерстяного покрова (выпадение шерсти, шерсть торчащая, пятнистая, тусклая, гладкая, блестящая), глаза (слезотечение, воспаление, помутнение роговицы), уши (воспаление, цвет - бледность или покраснение), конечности (цвет, отек),
3. физиологические функции - дыхание (скорость, характер, особенности).
Оценка протективной активности по проценту выживаемости мышей
О формировании иммунного ответа к коклюшу можно судить по возможности переноса устойчивости к заболеванию. Для исследования возможности переноса адоптивного иммунитета нами были использованы мыши линии BALB/c. Суспензия клеток селезенки иммунизированных мышей вводили внутривенно с последующим интрацеребральным заражением животных-реципиентов. За зараженными мышами наблюдали в течение 14 дней. При проведении данного теста помимо исследуемых монопрепаратаов нами были использованы комбинированные вакцины на их основе. Кроме того, была использована вакцина Infanrix. Infanrix - аналог отечественной АКДС-вакцины, включающей вместо корпускулярного коклюшного компонента антигены коклюшной клетки (коклюшный токсин, фимбриальные гемагглютинины и пертактин).
В ходе эксперимента нами было показано, что при переносе клеток селезенки неиммунных доноров к неиммунным реципиентам не передаются неспецифические факторы устойчивости к коклюшу. Так, при сингенной трансплантации клеток селезенки от группы животных, которым вводился гель гидроксида алюминия, все животные реципиенты пали в течение срока наблюдения. Процент выживаемости при пересадке клеток селезенки мышей, иммунизированных комбинированными вакцинами с корпускулярным и бесклеточным компонентами, был сравним по своей величине. Однако при переносе клеток животных, иммунизированных вакциной Infanrix, процент выживаемости был ниже, чем во всех остальных опытных группах. При использовании монопрепаратов процент выживаемости в группах реципиентов был сравним с соответствующими комбинированными вакцинами и сопоставим между группами (табл. 16).
Полученные данные указывают на то, что при иммунизации исследуемыми коклюшными препаратами как в виде монопропаратов, так и в сочетании со столбнячным и дифтерийным анатоксинами формируются специфичные иммунные механизмы, защищающие животных реципиентов от интрацеребрального заражения вирулентной культурой В. pertussis 18323.
Одним из сложившихся подходов оценки иммуногенности вакцинных препаратов является оценка способности индуцировать антителогенез. При проведении исследований, направленных на изучение способности препаратов активировать антителогенез нас интересовал не только титр антител, вырабатываемых в ответ на вакцинацию, но и сродство антител к антигенам при использовании различных препаратов. Корпускулярная вакцина зарекомендовала себя как эффективный препарат для профилактики коклюша. Поэтому есть все основания полагать, что спектр антител, вырабатываемых в ответ на введение вакцины, является наиболее оптимальным для защиты организма от инфекции. Таким образом, нам виделось важным показать аналогичную специфичность антител, при использовании корпускулярного и бесклеточного препаратов.
Содержание коклюшных антител в сыворотках вакцинированных животных определяли в реакции развернутой агглютинации (РА) и иммуноферментным анализом. При постановке иммуноферментного анализа использовали иммуносорбенты с клетками возбудителя коклюша и бесклеточным антигеном. Для выявления связавшихся коклюшных антител использовали конъюгат на основе биотинилированного белка А стафилококка производства филиала ФГУП НПО «Микроген» «Пермское НПО «Биомед». Полученные данные свидетельствуют, что антитела, вырабатываемые в ответ на вакцинацию бесклеточным препаратом, реагируют с антигенами коклюшной клетки как в реакции агглютинации, так и при постановке иммуноферментного анализа при использовании подложки с иммобилизованными клетками возбудителя коклюша (табл. 17)
Исследование коклюшных сывороток в тестах пассивной защиты и реакции нейтрализации на мышах
Разработка комбинированных вакцинных препаратов проводится на базе существующих монопрепаратов. Необходимым условием внедрения в медицинскую практику комбинированных вакцин является иммуногенная активность, не отличающаяся от монопрепратов, и отсутствие потенцирования реактогенности.
Очевидно, что создание комбинированного препарата с такой же иммуногенностью и реактогенностью, как и у отдельных компонентов вакцины, является существенной проблемой. В связи с этим конструирование комбинированного препарата, на основе бесклеточного коклюшного компонента (производства НПО «Биомед») является весьма актуальной задачей. Сравнение, полученного препарата проводили с препаратом, содержащим корпускулярный препарат (АКДС-вакцина), а также с зарегистрированной в России вакциной Infanrix, содержащей бесклеточный коклюшный компонент.
Для определения напряженности гуморального иммунного ответа, формируемого при использовании сравниваемых препаратов, использовали схему иммунизации морских свинок, использованную для исследования серологического ответа на коклюшные монопрепараты. Нами также определялся уровень антител к столбнячному и дифтерийному анатоксинам.
Определение поствакцинального уровня антител определяли в сыворотках крови морских свинок реакцией агглютинации и иммуноферментным методом.
Согласно данным реакции агглютинации уровень антител, формируемый при использовании сравниваемых препаратов, достоверно не отличался. При определении содержания антител методом иммуноферментного анализа на различных подложках достоверных отличий в группах, иммунизированных АКДС и аАКДС отмечено не было (табл. 27).
При определении уровня антител методом ИФА в группе животных, иммунизированных вакциной Infanrix при использовании подложки с иммобилизованными клетками В. pertussis уровень выявляемых антител был достоверно ниже в сравнении с АКДС, при использовании подложки с иммобилизованным бесклеточным препаратом уровень антител достоверно отличался как от АКДС так и от аАКДС, при этом достоверного отличия между последними группами не было (табл. 27). Данный факт может свидетельствовать о том, что спектр антител, формируемых при использовании вакцины Infanrix значительно ниже, нежели чем при использовании АКДС и аАКДС вакцин.
Уровень дифтерийных антител достоверно отличался от группы, иммунизированной АКДС-вкциной, как в случае использования аАКДС, так и вакцины Infanrix. Достоверного отличия в уровне антител при использовании двух вакцин с ацеллюлярным компонентом не выявили.
При оценке столбнячных антител показали, что использование вакцины Infanrix опосредует достоверно меньшее накопление антител, в сравнении с АКДС и аАКДС вакцинами.
Считается, что в дополнение к выработке антител необходимо формирование клеточного иммунитета для обеспечения длительного иммунитета к В. pertussis. Поэтому оценка специфического клеточного иммунитета представлялась нам весьма важной, как в плане характеристики иммунобиологических свойств комбинированных вакцин, так и в отношении возможного использования полученных данных для контроля эффективности вакцинации. Влияние комбинированных вакцин изучали на клеточное звено иммунного ответа, оценивали в реакции ГЗТ.
Наши исследования показали, что динамика и общие закономерности протекания реакции гиперчувствительности при использовании комбинированных препаратов совпадает с таковыми при использовании монопрепаратов (табл. 28). Так, было установлено, что уровень иммунного воспаления при использовании АКДС-вакцины достоверно выше, в сравнении с вакцинами, содержащими бесклеточный коклюшный компонент. При этом уровень ответа со стороны регионарных органов иммунной системы сопоставим по своей выраженности.
Полученные нами данные указывают на более выраженную реактогенность комбинированного препарата с корпускулярным коклюшным компонентом, при сопоставимом уровне иммунного ответа со стороны регионарных лимфоидных органов.
