Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Щелочные термальные источники 9
1.1. Азотные термы 10
1. 2. Азотные щелочные гидротермы Байкальской рифтовой зоны 12
Глава 2. Микробное сообщество щелочных термальных источников 16
Глава 3. Влияние абиотических факторов на микроорганизмы, функционирующие в щелочных термальных источниках 20
3.1. Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к высоким температурам 20
3.2. Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к экстремальным значениям рН 23
Глава 4. Биологический круговорот азота в экосистемах 25
4. 1. Азотфиксирующие микроорганизмы 27
4. 2. Аммонифицирующие микроорганизмы 30
4.3. Нитрифицирующие микроорганизмы 32
4.3.1. Аммонийокисляющие бактерии 34
4.3.2. Нитритокисляющие бактерии 35
4.4. Денитрифицирующие микроорганизмы 38
Глава 5. Объекты и методы исследования 43
5.1. Объекты исследования 43
5.2. Методы полевых исследований 46
5.3. Методы лабораторных исследований 47
5.3.1. Методы культивирования и изучения роста бактерий в зависимости от физико-химических факторов 47
5.3.2. Методы идентификации бактерий 49
5.4. Методы определения скорости микробных процессов 49
5.4.1. Метод определения денитрифицирующей и азотфиксирующей
активностей чистых культур бактерий 50
5.5. Методы определения протеолитической активности 51
Глава 6. Физико-химическая и микробиологическая характеристика источников 53
6.1. Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Прибайкалья 53
6.1.2. Физико-химическая характеристика источника Горячинск по сезонам 58
6.2. Численность функциональных групп бактерий круговорота азота в гидротермах Бурятии 61
6. 2. 1. Общее микробное число и численность функциональных групп бактерий круговорота азота в источнике Горячинск по сезонам 65
Глава 7. Скорости процессов цикла азота в донных осадках источников Прибайкалья 68
7.1. Биологическая активность микроорганизмов в донных осадках термальных источников Прибайкалья 68
7.2. Азотфиксирующая активность микроорганизмов в донных осадках термальных источников Прибайкалья 69
7.3. Денитрифицирующая активность микроорганизмов в донных осадках термальных источников Прибайкалья 70
7.4. Протеолитическая активность в нативных образцах термальных источников Прибайкалья 71
Глава 8. Сезонная динамика процессов цикла азота в донных осадках источника Горячинск 78
8.1. Сезонная динамика эмиссии СОг 78
8.2. Сезонная динамика скорости азотфиксации 79
8.3. Сезонная динамика скорости нитрификации 82
8.4. Сезонная динамика скорости денитрификации 83
Глава 9. Бактерии участвующие в круговороте азота в щелочных гидротермах Прибайкалья 87
9.1. Азотфиксирующие бактерии 87
9.2. Денитрифицирующие бактерии 91
9.3. Аммонифицирующие бактерии 95
9.4. Аммонийокисляющие и нитритокисляющие бактерии 99
Заключение 105
Выводы 108
Список литературы 110
- Азотные щелочные гидротермы Байкальской рифтовой зоны
- Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к высоким температурам
- Нитрифицирующие микроорганизмы
- Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Прибайкалья
Введение к работе
Актуальность темы. Азот является одним из важнейших биофильных элементов, во многом определяющий характер и направление микробиологических процессов в различных экосистемах. Избыток или недостаток азотсодержащих соединений отражается на общей продуктивности водоемов. В настоящее время накоплен большой материал, освещающий круговорот азота в таких водных экосистемах как моря, океаны и озера (Кузнецов и др., 1985; Goering, Parker, 1972; Birch, Spiridakis, 1981; Knowles, 1982; Kuenen, Robertson, 1988; Zehr et al., 1998; Саралов, 1991;Zumpf, 1992; Koops, 2001; Lis, 2006).
В гораздо меньшей степени изучены особенности цикла азота в экосистемах, характеризуемых как экстремальные. В пределах Байкальской рифтовой зоны широко распространены слабоминерализованные источники, газирующие азотом с высокими значениями температуры (до 75°С) и рН (до 10). В щелочных термальных источниках проведено много исследований, посвященных азотфиксирующим цианобактериям. В то же время роль алкалотермофильных азотфиксирующих, нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий в биогеохимическом цикле азота изучена недостаточно.
Цель исследования - изучение бактериальных процессов цикла азота в гидротермах Прибайкалья, выделение и описание алкалотермофильных бактерий, участвующих в этих процессах.
Задачи исследования:
1. Изучение физико-химических параметров исследуемых щелочных термальных источников Прибайкалья.
2. Исследование сезонной динамики азотсодержащих соединений в илах.
3. Определение интенсивности бактериальных процессов цикла азота.
4. Изучение внеклеточной протеолитической активности в нативных образцах.
5. Определение численности азотфиксирующих, аммонифицирующих, нитрифицирующих, денитрифицирующих бактерий по сезонам.
6. Выделение чистых культур бактерий цикла азота и изучение их физиолого-биохимических свойств и определение функциональной активности.
Научная новизна работы. Впервые проведена комплексная оценка интенсивности микробного цикла азота в щелочных гидротермах. Впервые изучено пространственно-временное распространение бактерий, участвующих в процессах трансформации азота в щелочных термальных источниках Прибайкалья. Определено вертикальное распределение бактерий круговорота азота, содержание органических веществ и внеклеточная протеолитическая активность микроорганизмов в илах гидротерм. Выделены накопительные и чистые культуры азотфиксаторов, аммонификаторов, нитрификаторов и денитрификаторов, способные расти в щелочных условиях среды (рН 8,0-9,0) при высоких температурах ( 45°С). Описана алкалотермофильная нитритокисляющая Nitrospira sp. с оптимумом роста при температуре 48°С и рН 8,7.
Практическая значимость. Количественная оценка функциональной активности микроорганизмов круговорота азота может быть использована для определения экологического состояния водных экосистем. Выделенные культуры представляют интерес для биотехнологии как активные продуценты протеаз, устойчивых к высоким значениям температуры и рН. Материалы, представленные в диссертации, могут быть использованы при чтении курса лекций по предмету "Микробиология", "Биохимия", "Экология".
Защищаемые положения. • Распространение бактерий, участвующих в цикле азота в щелочных термальных источниках Байкальского региона определяется химическим составом воды, содержанием органического вещества и минеральных форм азота. В то же время такие факторы, как высокие температура и рН, не оказывают ингибирующего влияния на жизнедеятельность бактерий.
• Наибольшие значения протеазной активности в нативных образцах характерны для микробных матов и растительных остатков.
• В илах и микробных матах щелочных термальных источников среди культивируемых азотфиксирующих, аммонифицирующих, денитрифицирующих бактерий доминируют представители рода Bacillus. Среди нитрификаторов I и II фазы - представители родов Nitrosomonas и Nitrospira.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на научно-практической конференции «Биология микроорганизмов и их научно-практическое использование» (Иркутск, 2004); 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2004); Южносибирской научной конференции студентов и молодых ученых «Экология Южной Сибири» (Хакасия, 2004, 2005); Международной конференции "Экосистемы Монголии и приграничных регионов сопредельных стран: природные ресурсы, биоразнообразие и экологические перспективы", Улан-Батор (Монголия) 2005; V межрегиональной научной конференции молодых ученых «Научный и инновационный потенциал Байкальского региона», (Улан-Удэ, 2006); Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» ИНМИ (Москва, 2005, 2006); Всероссийской конференции с международным участием «Биоразнообразие экосистем Внутренней Азии» (Улан-Удэ, 2006).
Публикации. По теме диссертации, включая тезисы, опубликовано 14 работ.
Объем работы. Диссертация включает 9 глав и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка литературы (80отечественных и 111 зарубежных источников) и приложения. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы и иллюстрирована 29 рисунками и фотографиями.
Благодарности Автор выражает глубокую признательность научному руководителю д.б.н., проф. Б.Б. Намсараеву и сотрудникам Лаборатории микробиологии ИОЭБ СО РАН, к.б.н. Е.В. Лебедевой и сотрудникам Лаборатории хемолитотрофных микроорганизмов ИНМИ РАН, Я.Е.Дунаевскому, д.б.н., родным и близким.
Определение интенсивностей микробных процессов проводилось совместно с А.Л. Степановым (МГУ). Выделение цианобактерий проводилось совместно с Д.Балдановой и к.б.н. А.В.Брянской (ИОЭБ СО РАН). Определение видовой принадлежности цианобактерий проводилось к.б.н. А.В. Брянской и Д. Балдановой (ИОЭБ СО РАН). Автор приносит искреннюю благодарность всем упомянутым участникам работы.
Диссертационная работа выполнена при финансовой поддержке грантов: РФФИ 05-04-97215р_байкал_а; Президиума РАН «Происхождение и эволюция биосферы»; МО РФ № РНП. 2.1.1. НОЦ «Байкал»; Президиума СО РАН №24.
Азотные щелочные гидротермы Байкальской рифтовой зоны
Типичным примером азотных термальных вод могут служить гидротермы Байкальской рифтовой зоны. Температура воды на выходах достигает 90С, минерализация не превышает 1,0 г/л, рН - до 10, содержание силикатов до 100 мг/л (Намсараев и др., 2006). Гидрохимические данные свидетельствуют об инфильтрационном происхождении гидротерм Байкальской рифтовой зоны (Барабанов и др., 1968; Борисенко и др., 1978; Крайнов, Швец, 1980). Гидротермы формируются в восстановительной обстановке вне зависимости от влияния магматических процессов, что отличает гидротермы региона от гидротерм областей активного вулканизма (Голубев, 1982).
Азотные термы Байкальской рифтовой зоны по химическому составу подразделяются на четыре типа: 1) горячинский, 2) эллинский, 3) кульдурский и 4) питателевский (Ломоносов и др., 1977). Почти все азотные термы относятся к щелочным с величиной рН до 10,3. Редкие исключения, когда рН понижается до 6,0-6,8, объясняются смешиванием термальных вод с грунтовыми или поверхностными.
Горячинский тип. В Байкальской рифтовой зоне преимущественным распространением среди азотных терм пользуются сульфатные и натриевые кремнистые гидротермы, относящиеся к горячинскому типу. Связанные с молодыми тектоническими разломами и оперяющими их трещинами, эти гидротермы выходят в долину рек, глубоко прорезающими горные хребты Байкальской горной страны (источники Нилова Пустыня, Гусихинский, Инский, Гаргинский, Фролихинский и др.) и на побережье оз. Байкал (Горячинский, Хакусский и Давшинский). Отличительной особенностью гидротерм горячинского типа является абсолютное преобладание в анионном составе сульфатного иона и минерализация, изменяющаяся от 0,5 до 1,0 г/л. Все термы горячинского типа обладают щелочной реакцией (рН до 8,4). Особенностью рассматриваемых терм является наличие в них повышенных содержаний отдельных микрокомпонентов. В результате определения более 50 микроэлементов установлено, что наиболее широко в гидротермах распространены алюминий, железо, литий и стронций.
Аллинский тип. Аллинские (бассейн р.Алла), Уринские, Толстихинский (бассейн р. Баргузин), Змеиный (бухта Змеиная, побережье Байкала), Фролихиский (бассейн р.Фролиха), Язовские (бассейн р. Язовка). Характеризуется более низкой минерализацией - 0,2-0,6 г/л, широким диапазоном колебаний содержания сульфатов и гидрокарбонатов, рН 7-8. Дебит источников часто трудноопределим, так как они, проходя через толщу рыхлых отложений, формируют рассеянные выходы с дебитом отдельных струй сотые-десятые доли литра в секунду. Содержание растворенного азота достигает 98%, кислорода - 5,3, метана - 15,7 %. Суммарный сероводород содержится обычно в количествах, не превышающих нескольких мг/л. Характерной особенностью рассматриваемых гидротерм является то, что их выходы на поверхность, за очень редким исключением, приурочены к рыхлым образованиям различного генезиса, перекрывающим коренные породы. Очень часто источники расположены близ уреза воды рек. Характер выхода терм в значительной степени обусловливает химический состав этих вод (Пиннекер, 1980). Проходя через толщу рыхлых отложений, термальные воды разбавляются пресными грунтовыми и речными гидрокарбонатными водами, и, таким образом, формируется смешанный тип вод. В этом отношении показателен групповой выход термальных вод в долине р. Алла. Здесь на небольшом участке имеется многочисленное количество термальных источников, выходящих на урезе воды в р. Алла, химический состав которых в зависимости от доли участия поверхностных вод изменяется от гидрокарбонатно-сульфатного до сульфатно-гидрокарбонатного натриевого.
Кульдурский тип. На северо-восточном фланге рифтовой зоны, в Ципинской, Муяканской и северных частях Байкальской и Баргузинской впадин, распространены термальные воды своеобразного химического состава, относящиеся к кульдурскому типу. Представителями этих гидротерм являются Котельниковский, Сейский, Умхейский, Кучигерский, Болыпереченский и Гусихинский источники.
Главной и основной особенностью химического состава терм кульдурского типа является высокое содержание в них фтора, достигающее 14-26 мг/л, при минерализации 0,3-0,75 г/л. По химическому составу термы относятся к фторидно-гидрокарбонатным натриевым. Как правило, наряду с гидрокарбонатами в воде кульдурских терм в значительных количествах присутствует карбонат-ион. В катионном составе доминирует натрий при очень незначительном содержании магния и кальция. В составе свободных и растворенных газов рассматриваемых терм преобладает азот, содержание которого колеблется от 63,3 до 95,5%. В большинстве случаев в месте выхода термальных вод отмечается довольно сильный запах сероводорода, максимальное содержание которого достигает 31 мг/л в Умхейском источнике. Питателевский тип. В самостоятельный тип выделены азотные кремнистые термы с хлоридно-сульфатным и хлоридно-карбонатным натриевым ионным составом. Температура составила 60-70 , минерализация -1,83 г/л.Для щелочных терм Питателевского источника характерно высокое содержание фтора (до 0,008 г/л).
Адаптация и причины устойчивости микроорганизмов к высоким температурам
Для поддержания относительно постоянной вязкости мембраны при изменениях температуры у большинства бактерий происходят изменения ее липидного состава: при повышении температуры в мембрану включаются более насыщенные длинноцепочечные жирные кислоты. Это повышает «температуру плавления» липидов и обеспечивает оптимальную стабильность и текучесть при повышенной температуре. (Квасников, Исакова, 1978; Жизнь микроорганизмов ..., 1981; Логинова, 1982; Zeng et al., 1992; Сущик и др., 1999; Калачева, Сущик, 1994). При повышенной температуре в клетках Spirulina platensis уменьшалась степень ненасыщенности жирных кислот за счет снижения относительного содержания моноеновой Сш, диненасыщенной С18:2 и триненасыщенной С 18:з кислот. Для внутриклеточных жирных кислот Chlorella vulgaris Beijer отмечено уменьшение относительного содержания триненасыщенных кислот С 1б;з и С 18:3 за счет увеличения содержания диненасыщенных кислот. В составе липидов микробного мата термального источника, основу которого составляли микроорганизмы рода Chloroflexus, доминировали насыщенные и мононенасыщенные Сіб и С\% жирные кислоты (Pond et al.„ 1986; Zeng et al, 1992). Предполагается, что внеклеточные выделения свободных жирных кислот являются дополнительным механизмом регуляции и поддержания определенного состава жирных кислот клетки. Повышение температуры приводит к приостановке синтеза диеновых кислот из моноеновых у Spirulina platensis, в клетках водорослей накапливается Ci8;1 моноеновая кислота. Чтобы элиминировать этот эффект, происходит увеличение выделения мононенасыщенной кислоты в окружающую среду. При повышенной температуре роста клетки Chlorella vulgaris усиливают синтез запасных липидов в форме триацилглицеролов, избыток олеиновой кислоты переправляется в эти липиды (Сущик и др., 1999; Калачева, Сущик, 1994). У термофильных архей, мембраны состоят из липидов глицерол-полипренильной природы содержащие простые эфирные связи, которые значительно более стабильны при высокой температуре, чем липиды со сложноэфирными связями (Pond et al., 1986).
Основой термотолерантности белков организмов являются небольшие изменения их молекулярных структур. В свою очередь, изменение макромолекулярной структуры связано с изменением качественного состава белкового полимера, что ведет к возрастанию прочности внутримолекулярных связей. Исследование состава белков термофильных микроорганизмов выявило увеличение числа аминокислот, способных к образованию дополнительных водородных связей, ионных взаимодействий. Отмечено относительно высокое содержание кислых аминокислот, аргинина, гистидина (Логинова, 1982). По сравнению с мезофилами, белки термофилов отличались высоким содержанием триптофана, лейцина, низким цистеина. Уменьшение содержания цистеина в белках связано с термофильностью, особенно уменьшение числа сульфгидрильных групп, которые расположены на поверхности молекул белка и могут окисляться (Жизнь микроорганизмов..., 1981).
Ферменты термофильных микроорганизмов термостабильны и активны при более высоких температурах. Между субъединицами в молекулах энзимов термофилов существуют более прочные гидрофобные связи, что обуславливают их термостабильность (Квасников, 1978; Логинова, 1982; Чурикова, Викторов, 1989). При изучении термостабильных ферментов не обнаружено какого-либо общего структурного принципа; в каждом случае имеет место особая комбинация дополнительных связей (Pantoliano et al., 1987; Takagi et al., 1990). Ферменты многих термофилов имеют более низкую молекулярную массу и характеризуются высоким содержанием глицина, серина, глутаминовой кислоты и низким аланина (Imanaka et al., 1986; Yutani et al., 1986). Введение Pro замены структуры белка штамма Bacillus sp. 18 позволило установить термостабильность фермента на 105% выше при 70С (Masui et al., 1994).
Также известно, что при повышении температуры в клетках многих организмов синтезируются специфические белки теплового шока, которые при нормальной температуре либо не синтезируются вообще, либо синтезируются в незначительном количестве. Белки-шепероны способствуют формированию специфически термостабильной третичной структуры белков (Hartl et al., 1994). Кроме того, ответ на тепловой шок значительно перекрывается с реакциями на другие стрессы, например при тепловом шоке наблюдается синтез каталазы - белка окислительного шока, который при высокой температуре способствует выживанию благодаря, возможно, удалению пероксидов, образование которых усиливается с повышением температуры (Lengeler et al., 1997).
Гипертермофилы имеют более высокие «точки плавления» молекулы ДНК, важную роль в этом играют основные белки (гистоны), сдвигающие точку плавления на 30 С или больше. Стабильность ДНК могут придавать положительные сверхвитки, образующиеся под действием обратной гиразы (Gross, 1996; Adams, 1994.). У гипертермофильных архей-бродилыциков АТФ образуется с участием ацетил-СоА не через образование ацетилфосфата, а непосредственно через АДФ-образующую ацетил-СоА-синтетазную реакцию, возможно потому, что ангидридные связи кислот менее стабильны при повышенных температурах (Adams, 1994).
Реакция внутри клеток микроорганизмов, населяющих щелочные водоемы, поддерживается близкой к нейтральной. Это достигается благодаря наличию в цитоплазме буферных систем, которая обеспечивает содержание в ней нуклеиновых кислот и белков, а также пулов глутамата и полиаминов. В основном буферную емкость обеспечивают фосфатные группы в составе РНК и ДНК (в нейтральном диапазоне) и основные или кислые боковые цепи аминокислот в составе белков при крайних значениях рН. Регуляция рН цитоплазмы должна быть быстрой - в течение минут. Мембранный потенциал имеет необычайно высокую величину, и это компенсирует уменьшение протондвижущей силы. Низкая проницаемость цитоплазматической мембраны для протонов и других ионов обеспечивает адаптацию при высоких значениях рН среды (Чурикова, Викторов, 1989; Slonczewski, Foster 1996). Некоторые факультативно алкалофильные бактерии синтезируют индуцибельные дыхательные цепи, при функционировании которых перенос электронов сопряжен с выходом Na+ из клетки, и на этом основан механизм запасания энергии (Booth et al., 1993).
NaVH - антипорт является универсальным механизмом для создания ионных градиентов и поддержания рН-гомеостаза у алкалофилов. Протонная помпа и системы транспорта Na+ служат основными механизмами регуляции рН у бактерий, обитающих в щелочных средах; они согласованно действуют для понижения рН цитоплазмы. Это обеспечивается транспортом ионов натрия, в котором участвуют по меньшей мере три системы (Padan, Schuldiner, 1994).
Также одним из способов адаптации микроорганизмов к высокощелочным средам является способность их ферментов, находящихся на поверхности клетки или секретируемых в окружающую среду, функционировать при высоких значениях рН. Большее содержание Arg остатков во внеклеточной сериновой протеазе может сдвинуть оптимум рН в более щелочную сторону (Masui et al., 1994).
Нитрифицирующие микроорганизмы
В названии всех родов бактерий, окисляющих аммиак присутствует приставка Nitroso- (означает образование нитрита). Аммонийокисляющие бактерии широко распространены как в природе, так и в искусственных экосистемах, где органические материалы минерализуются в аэробных условиях. Эти микроорганизмы были выделены из почвенных образцов и горных пород, обнаружены в водах рек, морей, океанов и сточных водах (табл. 1).
В названии родов нитритокислителей присутствует приставка Nitro-, означающая образование нитрата. В настоящее время выделены и описаны представители 4 родов нитритокисляющих бактерий. Но еще до конца не выяснены филогенетические отношения между этими родами микроорганизмов. Лишь в последнее время установлена тесная взаимосвязь Nitrobacter с Rhodopseudomonas palustris в отношении морфологии клеток, ультраструктуры, запасного материала и олигонуклеотидных последовательностей в 16S рРНК и с Rhodopseudomonas viridis в отношении цитохрома с и состава липида А внешних мембран (Bock et al., 1986).
За исключением Nitrobacter, нитритокисляющие бактерии -облигатные литоавтотрофы, то есть нитрит является единственным энергетическим источником, а СО2 - главный источник углерода.
В присутствии органических соединений некоторые представители Nitrobacter способны расти в гетеротрофных условиях, но это медленный процесс (Сорокин, 1990).
В основном окисление нитрита идет быстрее, чем превращение аммиака в нитрит, поэтому относительно высокие концентрации нитрита встречаются редко. Нитритоокисляющие бактерии развиваются в аэробных условиях, где нитрит образуется благодаря активности аммонийокислителей или аэробной и анаэробной денитрификации. В последнем случае нитрит должен быть переведен из анаэробных условий в микроаэробные.
Представители рода Nitrobacter микроорганизмы могут вести себя как факультативные аэробы. Эта метаболическая изменчивость может объяснить присутствие нитритоокисляющих бактерий даже в анаэробных условиях (в отложениях ила) (Bock et al,1986). обнаружены в природных и антропогенных местах обитания с различными физико-химическими характеристиками, таких как термальные источники, пресные, солоноватые и соленые водоемы, содовые озера, морские экосистемы, кислые почвы, горные породы (табл. 2).
Все описанные в настоящее время НБ относятся к мезофилам и нейтрофилам за исключением одного алкалофильного вида Nitrobacter, выделенного из содовых озер (Sorokin et al., 1998). Попытки выделить нитрификаторов с другими параметрами роста большей частью заканчивались неудачей, в лучшем случае регистрировался положительный результат, как это было с обнаружением термофильных бактерий (Головачева et al., 1976) или с ацидофильным штаммом Nb. Vulgaris, с оптимумом роста при рН 5, выделенном из кислых лесных почв (Hankinson et al, 1988). Причиной неудач, как правило, являлся нестабильный рост культур и, как следствие этого, их потеря. В связи с вышеизложенным представляет большой интерес получение накопительных культур умеренно термофильных НБ с оптимумом роста около 50 С (Lebedeva et al., 2005). Это существенно расширяет температурные границы роста культивируемых нитрификаторов и влечет выделение новых таксонов, так как температура является важным фактором селекции.
Бактерии близкие к Nitrosomonas и Nitrobacter, с температурным оптимум около 55С были выделены в виде ассоциаций с другими термофилами из ряда нейтральных и слабощелочных гидротерм и термальных дерново-карбонатных почв (Головачева, 1976). Молекулярно-биологические исследования нитрифицирующих сообществ в различных местах обитания позволили сделать интересные выводы, например, было обнаружено, что в ряде природных и антропогенных биотопах преобладают представители рода Nitrospira. Следует также отметить, что при изучении термальных мест обитания Nitrobacter не был обнаружен при температуре выше 45С (Lebedeva, 2005).
Денитрификация - это последнее звено в цикле азота, в котором связанный азот возвращается в атмосферу в виде N2. Это анаэробный процесс. Процесс восстановления нитратов и нитритов с образованием молекулярного азота, который ведут микроорганизмы, получил название прямой денитрификации. Денитрификацию рассматривают как приспособление бактерий к окислению органических или неорганических субстратов в анаэробных условиях с использованием нитратов в качестве конечного акцептора электронов в дыхательной цепи (Бабьева, 1987). Как известно, способность к денитрификации широко распространена у прокариот (Zumpf, 1992). Многие микроорганизмы могут использовать №)з в качестве основного акцептора электронов для получения энергии при разложении органического вещества, когда низкая концентрация 02 ограничивает их аэробный метаболизм (гетеротрофная денитрификация): 5(СН20) + 4 N03 + 4Н+ - 5С02 + 7Н20 + 2N2 + энергия
Некоторые микроорганизмы (Thiobacillus denitrificans) могут получать энергию, используя N(V для окисления неорганических соединений, например S , Fe (автотрофная денитрификация). Это может происходить там, где NO3 поступает в зоны, богатые сульфидом железа, например, в осадок сточных вод (Golterman, 1991). Тем не менее, гетеротрофная денитрификация - наиболее экологически значимый процесс. Этот процесс протекает следующим образом: N03"-+ N02" -» NO - N20 N2
Высказывались некоторые сомнения по поводу того, является N0 промежуточным или побочным продуктом, но позже была открыта бактериальная редуктаза окиси азота: Pseudomonas stutzeri теряла способность к денитрификации, когда блокировали гены, отвечающие за синтез этого фермента. Участие N20 в денитрификации было подтверждено множеством работ (Payne, 1971). N20 восстанавливается в N2 при участии фермента редуктазы закиси азота (Stouthamer, 1988).
В зависимости от условий, промежуточные продукты денитрификации могут аккумулироваться или удалятся. Большинство почвенных бактерий обладают способностью к денитрификации, однако денитрифицирующие бактерии осуществляют ряд неполных путей восстановления: некоторые бактерии продуцируют только N2, в то время как другие выделяют смесь N20 и N2, а третьи - только N20 (Umarov, 1990, 1993).
Физико-химическая характеристика исследуемых термальных источников Прибайкалья
Исследованные термальные источники Прибайкалья (Горячинск, Алла, Гарга, Кучигер, Уро, Сея, Умхей, Котельниковский, Змеиный, Хакусы) характеризовались различной температурой, рН и другими физико-химическими параметрами (табл. 3).
Наиболее высокотемпературные из источников Прибайкалья были Уро (69,9С), Котельниковский (71,0С), Гарга (72,5 С), Алла (76,2 С). Низкие температуры в выходах, разгружающихся в русле реки, связаны с перемешиванием термальных вод с речными. К примеру, на изливе источника Сея, пробы были отобраны при температуре 50,3С, Умхей -47,6С, Кучигер - 47,2С. Воды источников Прибайкалья имели щелочную реакцию, значение рН варьировало от 7,6 до 9,9 (источник Алла). Слабощелочная реакция отмечена в водах Змеиный, Гарга и Хакусы (7,6-8,3). Максимальные концентрации сероводорода были зафиксированы в источниках Змеиный (22,5 мг/л) Кучигер (23,0 мг/л) и Умхей (33,0 мг/л). В гидротермах отмечены низкие значения окислительно-восстановительного потенциала, что характерно для вод, содержащих свободный сероводород.
Диапазон Eh восстановления сульфат-иона до сероводорода определяется диапазоном Eh и жизнедеятельностью сульфатредуцирующих бактерий. Этот диапазон достаточно велик - в нейтральной среде сульфатредукция может начинаться при Eh + 180 мВ и продолжаться до Eh - 400 мВ. Образующийся в результате протекания процессов сульфатредукции H2S, сам задает окислительно-восстановительный потенциал среды. Таким образом, восстановительная среда является следствием возникновения H2S, а не его причиной (Крайнев, Швец, 1980). Поступление значительных количеств сульфатов и легкоразлагаемых органических веществ способствует деятельности сульфатредуцирующих бактерий, которым принадлежит основная роль в образовании сероводорода.
По степени минерализации термальные воды являлись слабоминерализованными. Минерализация вод термальных источников не превышала 1 г/л.
Исследование анионного состава показало, что в воды большинства источников гидрокарбонатные. Наиболее высокое содержание гидрокарбонатов зафиксировано в источниках Алла, Кучигер. И только в воде источников Гарга и Умхей содержание карбонатов преобладало над гидрокарбонатами. Содержание сульфатов в гидротермах изменялось от 28,62 мг/л (источник Змеиный) до 103,15 мг/л (ист. Умхей). По нашим данным и из литературных источников исследуемые гидротермы в основном относятся к гидрокарбонатно-сульфатно натриевому (Уро, Алла, Кучигер, Умхэй, Змеиный) и сульфатно-натриевому (Горячинск, Хакусы, Гарга) типу вод. Выходы источников приурочены к рыхлым образованиям различного генезиса, перекрывающим коренные породы. Очень часто термы расположены близ уреза воды рек. Характер выхода терм в значительной степени обусловливает химический состав этих вод. Проходя через толщу рыхлых отложений, термальные воды разбавляются пресными грунтовыми и речными гидрокарбонатными водами, и, таким образом, формируется смешанный тип вод (Борисенко, Замана, 1976).
Образцы микробных матов, растительных остатков и илов, из исследуемых гидротерм, отбирались в зависимости от изменения температуры воды в ручье источников (рис.4).
Источники Хакусы и Змеиный были представлены по одной точке отбора на изливе, которые были каптированы деревянными срубами. Физико-химические характеристики остальных исследованных термальных источников заметно изменялись по руслу ручья. Например, ручей источника Горячинск протянулся на 2 км, где температура воды в летнее время варьировала от 18 С да 49С. В источнике Алла температура воды варьировала от 24С до 76,2С.
Температура и рН снижается по мере удаления от излива. Концентрация кислорода и значение Eh наоборот постепенно увеличивается. Содержание гидрокарбонатов в воде исследуемых проб достигает 167,7 мг/л. Для источников характерна низкая минерализация, которая была в пределах от 0,15 до 0,8 мг/л.
По содержанию органического вещества (1,7-1,8 мг/л), азотные тер мальные воды Баргузинской долины не отличаются от пресных вод интенсивного обмена. Количество органического вещества зависит от местонахождения источника. Источник Кучигер, расположенный в болотистой местности, содержал до 19,2% органического углерода (табл.5). Максимальные значения Сорг. были определены в микробных матах источников Умхей, Змеиный и Кучигер. Наименьшее количество органического вещества 0,3 - 0,4% определено в источнике Алла, выходы которого приурочены к каменистой местности.
Количество белка в исследуемых пробах составляло от 0,36 до 0,83 мг/мл. Максимальное содержание белка определено (0,83мг/мл) в микробном мате из источника Гарга. В целом концентрация органического вещества в матах и растительных остатках была выше, чем в донных осадках.
Общее количество азота в илах источников Алла, Кучигер и Горячинск варьировало от 0,09 до 2,77 % (табл.6). Наибольшие значения были определены на станциях Ал 9/4 , Ки 8-20, Ки 8-22 в количестве 0,42, 0,49, 2,77 %, соответственно. В источнике Горячинск содержание общего азота было в пределах 0,12-0,15%
Максимальное количество аммонийного азота равное 2,34 мг/ЮОг определено в источнике Кучигер, минимальное - 0,51 мг/ЮОг в источнике Горячинск. Содержание нитритного и нитратного азота в некоторых пробах илов было ниже предела чувствительности прибора. Максимальные концентрации нитритного и нитратного азота были определены в источнике Кучигер и составляли 0,13 мг/ЮОг.
