Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Перспективы применения липосомальных форм биологически активных веществ в медицинской практике (литературный обзор)
1.1. Липосомы - наноконтейнеры для доставки лекарств 15
1.2. Технологические аспекты получения липосомальных препаратов 20
1.2.1. Разработка рецептуры липосомального препарата 20
1.2.2. Методы получения липосомальных форм лекарственных препаратов
1.2.3. Включение препаратов интерферона в липосомы 40
1.2.4. Проблемы получения фармакопейных липосомальных препаратов для применения в клинической практике
1.3. Транспорт липосомированных лекарств, при различных путях их введения в организм
1.4. Терапевтический потенциал лекарственных препаратов, иммобилизованных в липосомы
1.5. Заключение по обзору литературы 58
Глава 2. Материалы и методы 60
2.1. Материалы 60
2.2. Методы 63
Глава 3. Результаты и обсуждение 80
3.1. Разработка технологии получения липосомального 80
рекомбинантного альфа -2Ь интерферона человека для клинического применения
3.1.1. Выбор метода получения липосомальной формы рекомбинантного альфа - 2Ь интерферона человека
3.1.2. Оптимизация способа получения и выбор состава липосомального препарата рекомбинантного альфа - 2 b интерферона человека
3.1.3. Отработка физико-химических и биологических методов контроля липосомальной формы рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека
3.2. Лабораторно - экспериментальное изучение липосомального препарата рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека
3.2.1 Оценка стабильности липосомальной формы рекомбинантного альфа - 2Ь интерферона при хранении in vitro
3.2.2. Изучение влияния физиологических условий пищеварительного тракта человека на биологическую активность липосомального рекомбинантного альфаинтерферона человека в модельном эксперименте
3.2.3. Исследование фармакокинетики, токсических свойств и противовирусной активности липосомального интерферона in vivo
Заключение 158
Выводы 160
Список использованной литературы
- Разработка рецептуры липосомального препарата
- Транспорт липосомированных лекарств, при различных путях их введения в организм
- Выбор метода получения липосомальной формы рекомбинантного альфа - 2Ь интерферона человека
- Оценка стабильности липосомальной формы рекомбинантного альфа - 2Ь интерферона при хранении in vitro
Введение к работе
Актуальность исследования. Отечественный рекомбинантный альфа-
2Ь (далее альфа-2) интерферон человека (Реаферон) обладает антивирусной,
антипролиферативной, иммуномодулирующей активностью [Рафальский
В. В., 1997; Ершов Ф. И., 2005]. Являясь белком, Реаферон разрушается в
желудочно-кишечном тракте, поэтому основным способом его
использования в клинической практике являются инъекции, а также
местное или ректальное применение [Ершов Ф. И., 2006;
Малиновская В. В., 2006]. Рекомбинантный альфа - 2 интерферон (ИНФ) в виде раствора для инъекций широко применяется в комплексной терапии вирусных и онкологических заболеваний человека, а именно - при острых и хронических вирусных гепатитах В, С, D, гриппе и других ОРВИ (адено-, рино-, корона- и др), вирусных конъюнктивитах, раке почки, волосато-клеточном лейкозе, лимфомах кожи, плоскоклеточном раке кожи, рассеянном склерозе, СПИДе, цитомегаловирусных инфекциях и многих других болезнях [Smith G. L. et al., 1998; Sen G. С, 2001; Samuel С. E., 2001; Lenschow D. J. et al., 2007; Ершов Ф. И. и др. 2007]. Однако клиническое использование рекомбинантного интерферона создает и некоторые проблемы. Так, для достижения терапевтического эффекта при лечении большинства патологий, при которых показано применение препаратов интерферона (ИНФ), рекомендовано применять мегадозы препарата до 6 млн ME в сутки и выше [Маркарян А. С. и др., 1998]. Например, наиболее оптимальной дозой альфа-2 интерферона при лечении хронического вирусного гепатита В, считается 3,0 -5,0 млн ME внутримышечно три раза в неделю («золотой стандарт») в течение шести месяцев. При этом некоторые авторы рекомендуют более высокие дозы ИФН - до 10 млн ME в сутки ежедневно или через день в течение 4-6 месяцев, а при суперинфекции гепатита D до 12 месяцев [Змызгова А. В., 1999; Ершов Ф. И., 2006]. Использование таких дозировок помимо краткосрочных пирогенных реакций, таких как озноб, повышение температуры, преходящих утомляемости, кожных высыпаний, зуда, лейко- и тромбоцитопении, способствует проявлению более серьёзных побочных эффектов, таких как появление нервно-психических расстройств (возбуждение, нарушения сна, раздражительность, или, наоборот, вялость, апатия, депрессия), временное выпадение волос [Змызгова А. В., 1999; Ершов Ф. И. и др., 2005]. При обкалывании очага поражения возможно развитие местной воспалительной реакции [Ершов Ф.И., 2006]. Необходимость внутримышечного инъецирования делает проблематичным применение препарата у детей младшего возраста, а в некоторых случаях его применить невозможно, например, у пациентов с сахарным диабетом из-за большого числа осложнений. Кроме того, при проведении инъекций возможно инфицирование пациента (ВИЧ, гепатиты), наличие в составе препарата донорского альбумина потенциально увеличивает этот риск [Чуйкова В. И. и др., 2008].Несмотря на очевидные недостатки, свойственные инъекционной лекарственной форме, альтернативы рекомбинантному альфа-2 интерферону при лечении ряда вирусных заболеваний в настоящее время
не существует (хронические вирусные гепатиты [Блохина н. П., 1998; Змызгова А. В.,1999], острые респираторные заболевания, вирусные заболевания респираторного тракта [Лобзин Ю.В. и др., 2004]). Однако применение Реаферона в терапии вирусных заболеваний респираторного тракта, особенно с профилактической целью, помимо побочного действия, сопутствующего парентеральному пути введения препарата, объективно сдерживается необходимостью проведения многократных внутримышечных инъекций [Маркарян А. С. и др., 1998; Лобзин Ю.В. и др., 2004].
В ряде случаев, например при лечении вирусных и онкологических заболеваний кожи и слизистых оболочек человека, целесообразно местное (наружное) применение интерферона [Клявина Е. А., 1991; Майданюк, С.А. и др., 2000; Попов В. Ф., 2002; Ершов Ф. И., 2006].
Также известны композиции для ректального введения препаратов интерферона, в частности, рекомбинантный альфа-2-интерферон в свечах (виферон) [Чистова Л. В. и др., 1993; В. В. Малиновская, 2003]. Однако при ректальном введении интерферона трудно обеспечить точное дозирование препарата ввиду частичных потерь либо жидкости, либо свечной массы, остающейся на руках или приспособлениях для введения.
В связи с вышеизложенными фактами, становится очевидной необходимость разработки новых современных лекарственных форм, которые не имели бы указанных выше недостатков, а также позволили бы их применять для ещё не используемых способов введения интерферона в организм, например перорального.
Одним из перспективных направлений снижения системной
токсичности, повышения биодоступности и, как следствие, увеличения
терапевтической эффективности лекарств, в современной
нанобиотехнологии является создание их липосомальных форм [Швец В. И., 2008]. Липосомы при этом используются как биосовместимые и биодеградируемые наносистемы доставки, оптимизирующие действие лекарств. Размеры липосом, обычно используемых в качестве переносчиков лекарств, составляют от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров, то есть находятся в нанодиапазоне, что наряду с их биологическимим свойствами обеспечивает их эффективность как систем доставки [Каплун А. П., 2007]. Липосомы изменяют фармакокинетику лекарственных препаратов, повышая их терапевтическую эффективность [Gregoriadis G., et al, 1983; Марголис Л. Б., Бергельсон Л. Д., 1986].
На сегодняшний день именно липосомы из всех наночастиц наиболее широко применяются в качестве средств доставки лекарств в клинической практике, ряд липосомальных препаратов лицензирован и производится в промышленных масштабах [Goyal P. et al, 2005; Torchilin V. P., 2005]. Наиболее значимое применение липосомальные препараты получили в химиотерапии опухолевых заболеваний, лечении глубоких микозов, вакцинологии, офтальмологии, пульмонологии и при лечении некоторых других патологических состояний [Goyal P. et al, 2005; Швец В. И., 2008].
Таким образом, потребность практического здравоохранения в инновационных лекарственных формах ИНФ, лишённых недостатков, свойственных традиционным лекарственным формам препарата, очевидна. Учитывая уникальные свойства липосом как носителей лекарств, одним из перспективных подходов к решению этой проблемы является создание липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона (ЛФИ), нацеленной на проведение интерферонотерапии без инъекций и сопутствующих им нежелательных побочных эффектов. Бесспорная важность этой задачи для отечественной клинической практики явилась актуальным основанием для проведения данной исследовательской работы.
Цель и задачи диссертационной работы. Целью настоящей работы является разработка технологии производства, методов контроля качества и экспериментальное изучение in vitro и in vivo свойств новой липосомальной лекарственной формы человеческого рекомбинантного альфа-2 интерферона. В связи с этим задачами исследования являлись:
1. Разработка и экспериментальное обоснование основных стадий
технологии получения липосомального ИНФ.
- оценка эффективности включения интерферона в липосомы,
полученные различными способами;
определение биологической активности образцов липосомального интерферона, полученных разными методами;
- выбор на основе экспериментальных данных способа получения
липосомального интерферона и оптимального состава липосомального
препарата рекомбинантного альфа - 2 интерферона человека;
-
Оценка физико - химических свойств и стабильности образцов липосомального ИНФ в процессе хранения.
-
Разработка физико - химических и биологических методов контроля качества препарата.
-
Оценка противовирусных свойств липосомального интерферона in vitro и in vivo.
-
Разработка необходимого комплекта нормативно - технической документации (ФСП, РП, инструкция по применению) на готовый лекарственный препарат и его Государственная регистрация в Российской Федерации.
Научная новизна работы.
1. Впервые разработана технология промышленного производства новой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека для перорального и наружного применения:
- впервые проведена сравнительная экспериментальная оценка
влияния условий получения липосомального ИНФ различными методами на
его биологическую (противовирусную) активность.
исследована эффективность включения рекомбинантного альфа-2Ь интерферона в липосомы, полученные различными методами.
теоретически и экспериментально обоснован выбор способа получения и оптимальный состав липосомального препарата ИНФ человека
для применения в медицинской практике.
-
Разработаны физико-химические и биологические методы контроля качества липосомального препарата ИНФ.
-
Изучена in vitro стабильность образцов липосомального ИНФ в процессе получения и хранения препарата.
-
Впервые показана безвредность липосомальной формы ИНФ при наружном и пероральном применении препарата in vivo.
-
Продемонстрирована эффективность липосомальной формы ИНФ при наружном применении препарата для лечения генитального герпеса экспериментальных животных.
6. Впервые показано, что. интерферон, иммобилизованный в
липосомы, сохраняет биологическую (противовирусную) активность в
условиях, моделирующих физиологическое окружение ЖКТ человека.
7. Впервые подтверждено, что липосомальный ИНФ при наружном и
пероральном применении способен преодолевать соответственно кожный и
гастроинтестинальный барьеры организма и проникать в кровеносное русло
экспериментальных животных, проявляя свойственную ему биологическую
активность, а затем полностью элеминироваться из организма
экспериментальных животных с помощью естественных ферментативных
систем.
Практическая ценность работы. Результатом диссертационной работы является разработанная промышленная технология получения новой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона, проявляющей терапевтическую. эффективность при пероральном и наружном применении, отвечающей всем требованиям Государственной Фармакопеи РФ. Разработан необходимый комплект НТД на препарат (ФСП, РП, инструкция по применению), проведены доклинические и клинические испытания липосомального интерферона.
Результаты работы защищены Патентом РФ № 2123328 «Противовирусное лекарственное средство для перорального применения».
На предприятии ЗАО «Вектор-Медика» наукограда Кольцово, при методическом руководстве автора налажен серийный промышленный выпуск нового лекарственного препарата - липосомального рекомбинантного интерферона альфа-2Ь - первого в отечественной клинической практике препарата интерферона для перорального применения. Впервые препарат был зарегистрирован в Российской Федерации под торговым названием «Липинт» 28.03.2001 года, регистрационное удостоверение Р № 000344/01-2001, затем переригистрирован как «Реаферон - ЕС - Липинт», регистрационное удостоверение Р № 000821/01 - 2001 от 16.11.2001. В настоящее время в медицинской практике препарат применяется в комплексной терапии больных острым и хроническим гепатитом В в активной и неактивной репликативных формах, а также хроническим гепатитом В, осложненным гломерулонефритом, в лечении больных атопической бронхиальной астмой, для проведения специфической иммунотерапии при аллергическом риноконъюнктивите, при профилактике
и лечении гриппа и ОРЗ у взрослых и детей, в комплексной терапии урогенитальной хламидийной инфекции у взрослых. Спектр терапевтического применения препарата «Реаферон-ЕС - Липинт» постоянно расширяется, продолжающиеся клинические испытания выявляют все новые нозологические формы заболеваний, в лечении и профилактике которых он эффективен.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Новая липосомальная лекарственная форма рекомбинантного альфа-2Ь интерферона человека, производимая по разработанной технологии, лишена побочных эффектов, свойственных инъекционной лекарственной форме и обладает широким спектром терапевтического применения в качестве противовирусного препарата.
-
Липосомальная лекарственная форма ИНФ позволила доставлять интерферон в макроорганизм пероральным способом с сохранением его специфической активности.
-
Липосомы, содержащие иммобилизованный в их внутреннюю полость ИНФ, предохраняют белок от деградации в желудочно-кишечном тракте макроорганизма, способствуют попаданию цитокина в кровоток и пролонгируют его терапевтическое действие, по сравнению с лекарственной формой интерферона, предназначенной для парентерального введения.
4. Система контроля физико-химических и биологических свойств
липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2
интерферона, применяющаяся на технологических стадиях её производства,
позволяет выпускать лекарственный препарат в полном соответствии с
требованиями Государственной Фармакопеи Российской Федерации.
Апробация материалов диссертации. Материалы основных разделов диссертации бьши представлены на отечественных и зарубежных конференциях: I съезд иммунологов России 23.06 - 25.06 1992 г., Новосибирск, Россия; V конференция РФ «Новые направления биотехнологии» 18.05 - 22.05 1992 г., Пущино, Россия; П-я научно -практическая конференция по генно - инженерным цитокинам 10.12 -11.12 1992 г., Оболенск, Россия; Научная конференция для врачей практиков «Методические основы применения реаферона - человеческого рекомбинантного интерферона альфа-2» 25.01 - 29.01 1993 г., Кольцове, Россия; VII International symposium on viral hepatitis 25.01-27.01 1996 г., Madrid, Spain; I конгресс педиатров - нефрологов России 17.09 -19.09 1996 г., С. Петербург, Россия; VIII конференция «Новые направления биотехнологии» 27.04 - 29.04 1998 г., Москва, Россия; Научная конференция для врачей практиков «Хорошая клиническая практика - опыт 15-летней работы службы профилактики СПИД в Хабаровском крае» 9.08 -10.08 2004 г., Хабаровск, Россия.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 научные статьи из них 3 - в журнале Вестник РАМН (1993; 1999; 2001) и 1 - в журнале Российский вестник перинатологии и педиатрии (1998). По результатам работы получен патент РФ.
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 187 страницах, содержит 27 таблиц, 14 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Список литературы включает в себя 300 источников, из них 175 иностранных.
Вклад автора в диссертационную работу. Вклад автора в представленный материал диссертации заключается в личном участии во всех экспериментальных и теоретических исследованиях, обработке результатов и формулировании выводов. Основные экспериментальные результаты получены в соавторстве с сотрудниками ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» В. В. Бирюковой, О. А. Агафоновой, А. А. Колокольцовым, А. Е. Нестеровым, Е. Д. Даниленко, Е. И. Рябчиковой, В. И. Масычевой, Н.
A. Антоновым в рамках научных тем, выполнявшихся в ФГУН ГНЦ ВБ
«Вектор», ряд научных исследований выполнен в соавторстве с
сотрудниками Кардиологического научного центра РАМН
B. П. Торчилиным, А. Н. Лукьяновым, Ю. Н. Барановым, постановка
препарата на серийное производство в ЗАО «Вектор - Медика»
осуществлена в сотрудничестве с Н. Б. Бажутиным, А. В. Войтенко.
Анализ материалов и оформление работы произведены под руководством
Е. А. Ставского. Всем коллегам, принимавшим участие в данной работе,
автор выражает искреннюю признательность.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы
Культуры клеток. Определение противовирусной активности ЛФИ биологическим методом (по цитопатическому действию вируса - ЦПД), а также содержание ИНФ и мышиного интерферона в сыворотках крови и органах экспериментальных животных, проводили с использованием в качестве чувствительных культур клеток диплоидной линии клеток (фибробластов) легкого эмбриона человека Л-68 и диплоидной линии клеток (фибробластов) легкого эмбриона мыши L-929 из коллекции культур клеток ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Культуральные среды, реактивы, используемые при этом соответствовали таковым, указанным в литературе [Ставский Е. А. и др., 2007].
Вирусы. Для титрования интерферона в культуре клеток использовали в качестве тест - микроорганизма (индикаторного вируса) - вирусы энцефаломиокардита мышей (ЕМС) или везикулярного стоматита по ОСО 42 - 28 - 158 - 88, полученные из ГИСК им. Л. А. Тарасевича. Для определения противогерпетической активности ЛФИ in vivo был использован вирус простого герпеса 2 типа (штамм MS), полученный из Государственной коллекции вирусов при Институте вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН. Перед использованием в эксперименте штамм прошел два последовательных пассажа на культуре клеток Vero Еб, инфекционный титр вируса составил 106 ЦПД.
Животные. Исследование биологических свойств ЛФИ проводили на конвенциональных самцах белых мышей ICR, крыс линии Wistar, морских
свинок, полученных из питомника ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор". Все манипуляции с животными проводили в соответствии с действующими «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. № 755).
Интерферон. Липосомальный ИНФ получали с использованием субстанции человеческого рекомбинантного альфа-2Ь интерферона, полученной на основе штамма - продуцента E.coli SG 20050 pIF 16 производства ЗАО «Вектор-Медика», с концентрацией белка 0,12 мг/мл и противовирусной активностью 4,0 107 МЕ/мл.
Методы
Липосомы с ИНФ готовили из смеси ФХ и Хол (7:3, по молям) методами механического встряхивания (МЛ), «обращения фаз» (БОЛ), ультразвукового диспергирования (МОЛ), замораживания - оттаивания (МОЛ), дегидратации -регидратации (МЛ) в сочетании с экструзией липосом через поликарбонатные мембраны [Szoka F., 1980].
Для изучения степени захвата ИНФ липосомами, полученными разными способами, использовали интерферон, меченный с помощью «йодогена» [125I] [Markwell М. А. К., Fox С. F., 1978], добавляя его к основному объёму белка в соотношении 10 : 1 (v/v). Для флуоресцентного мечения липосом использовали флуоресцентный липидный зонд R]8 («Molecular probes», США). Для определения потерь липида при проведении процедуры экструзии липосом через поликарбонатные мембраны использовали введение в липидную фазу холестерина меченого 14С из расчёта 106 распадов (ІрЛСюри) на каждую исследуемую пробу. Для отделения ИНФ, невключенного в липосомы, использовали методы колоночной гель-фильтрации на сефарозе CL-6B [Huang С. Н., 1969], ультрацентрифугирования [Waits A., et al., 1978; Кузякова Л. М. и др., 2000] и метод флотации в градиенте плотности фиколла [Heath Т. D., 1981]. Степень включения ИНФ в липосомы определяли методом флотации липосом с использованием ступенчатого градиента плотности фиколла. Процент включения ИНФ в липосомы рассчитывали по соотношению активностей липосомальной фракции и исходного препарата [ФСП 42 - 0140 - 0371-00, ЗАО «Вектор-Медика», 2001].
Время растворения липосомального препарата определяли визуально, рН определяли в суспензии потенциометрически (ГФ XI, вып. I, с. 113). Потерю в массе при высушивании определяли согласно ГФ XI, вып. I, с. 176. Условия анализа по МУК 4.1/4.2.588-96, п.43, с. 116. Определение точности розлива в лиофилизированном препарате проводили весовым методом по МУК 4.1/4.2.588-96, п.44.1, с.117. Среднюю массу и отклонение от средней массы определяли согласно ГФ XI, вып. 2, с, 142.
Количество ФХ, содержащегося в образце, определяли по входящему в состав лецитина фосфору. Определение фосфора проводили по МУК 4.1/4.2.588 - 96, п. 21, с. 77. Количество Хол, содержащегося в образце, определяли по методу Златкис - Зака [Ziatkis A., et al., 1953]. Определение
продуктов перекисного окисления липидов проводили двумя методами: по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [Yagi К., 1984] и используя спектрофотометрический метод определения индекса окисленности липидов (ИОЛ) [КейтсМ., 1975].
Стерилизацию липосом проводили в асептических условиях в специально оборудованном помещении с помощью фильтрации через ядерные мембраны на основе полиэтилентерефталатной плёнки с диаметром пор 0,1 мкм. Предварительно проводили «пузырьковую» пробу, заключающуюся в проверке целостности мембран, при помощи сжатого инертного газа (аргон высокой чистоты по ГОСТ 10157 -79, давление 1,0 атм). Стерильность препаратов липосомального ИНФ определяли в соответствии с ГФ XI, вып. 2, с. 187 методом прямого посева на тиогликолевукі среду по ТУ 42.14.161-79 и жидкую среду Сабуро. Микробиологическую чистоту ЛФИ определяли в соответствии с ГФ XI, вып. 2, с. 196 - 200 и Изменением №1, 1996г.
Лиофилизацию препарата осуществляли в соответствии с разработанным Регламентом производствах» 1194-02 [архив ЗАО «Вектор - Медика», 2001]. Далее флаконы с препаратом укупоривали на закаточном автомате. Герметичность упаковки флаконов контролировали методом погружения в ёмкость с интенсивно окрашенным раствором метиленового синего при избыточном давлении над ним (80 - 120 кПа), в течение 10-15 минут.
Специфическую (противовирусную) активность липосомального интерферона определяли в соответствии с разработанной нами ФСП 42 -0140-0371-00 [архив ЗАО «Вектор-Медика», 2001].
Стабильность липосомального интерферона в условиях физиологического окружения ЖКТ изучали либо раздельно, либо последовательно инкубируя ЛФИ разные промежутки времени с растворами натурального желудочного сока, содержащим все ферменты с конечным разведением в 1000, 100, 10 раз и неразведённым препаратом (рН 0,8 - 1,2), трипсина (рНЛ,0) (соотношение трипсин : ИНФ в липосомах составляло 1:10; 1:1; 15:1 (v/v), желчи медицинской с конечным разведением в 1000,100, 10 раз. Для разделения интерферона, заключенного в липосомы, и белка, освобождающегося из липосом в результате их разрушения, использовали ультрацентрифугирование (50000 g; Ічас; 4 С). О разрушении липосом судили по разнице в исходной радиоактивности липосомального ИНФ в начале опыта и после разделения липосом и свободного интерферона, освободившегося в результате разрушения липосом под воздействием факторов ЖКТ, и выражали в процентах. Для нейтрализации трипсина применяли его ингибитор, полученный из соевых бобов.
Специфическую (противогерпетическую) активность препарата in vivo оценивали на модели генитальной герпетической инфекции. [Маренникова С.С. и др.,1986]. Оценку безвредности препарата для лабораторных животных в остром и хроническом эксперименте (токсичность, переносимость, кожно - резорбтивное действие, кожно -
сенсибилизирующие свойства, конъюнктивальная проба, изменение массы и температуры тела, частота сердечных сокращений, исследовательское поведение в тесте "открытое поле", биохимический и гематологический анализ крови, гистологическое исследование образцов тканей, патоморфологическое исследование внутренних органов) проводили стандартными методами, одобренными для доклинических испытаний медицинских иммунобиологических препаратов [Фисенко В. П. и др., 2000]. В образцах крови определяли уровень гемоглобина, содержание эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов, рассчитывали лейкограмму. Биохимические исследования включали оценку показателей интенсивности основных видов обмена, а также активности ферментов - маркеров функционального состояния печени, почек, сердца [Меньшиков В.В., 1987].
Изучение острой токсичности и переносимости ЛФИ различными видами лабораторных животных при пероральном введении проводили при однократном внутрибрюшинном и пероральном способах введения мышам ICR и крысам Wistar. Изучение токсичности ЛФИ в условиях хронического эксперимента на крысах проводили на крысах линии Wistar при пероральном введении препарата в течение двух недель. Животные были разделены на 3 группы по 10 особей в каждой: 1 группа-контроль (физраствор), 2 группа -контроль (пустые липосомы), 3 группа - липосомальный ИНФ.
Изучение фармакокинетики рекомбинантного интерферона при наружном и пероральном применении липосомального препарата проводили на самцах беспородных мышей ICR с массой тела 20,0 ± 2,0 г. При наружном применении в дозе 6,25-103 ME на животное, при пероральном 20 000 ME на животное. В качестве препарата сравнения использовали Реаферон, который вводили внутримышечно в одинаковой дозе. Контрольные животные получали инъекцию физиологического раствора. В разные сроки после введения препаратов мышей подвергали эвтаназии мгновенной дислокацией шейных позвонков и забирали кровь для определения ИНФ. На каждую временную точку брали от пяти до десяти животных. Уровень ИНФ в сыворотке крови мышей при наружном применении определяли иммуноферментным методом с помощью иммуноферментного набора "Procon IF2 plus" фирмы "Протеиновый контур" (г. С-Петербург). Чувствительность метода определения составляла 5,0 пкг/мл. Уровень ИНФ в сыворотках и печёночном гомогенате мышей при пероральном введении препарата определяли по цитопатическому действию вируса (ЦПД). Дополнительно исследовали содержание мышиного интерферона в сыворотке крови экспериментальных животных. Результаты определения концентрации ИНФ биологическим методом выражали в ME (международных единицах), мышиных интерферонов в ТЕ (титрационных единицах) [Forti R.L. et al., 1986].
Статистическая обработка результатов исследований проводилась общепринятыми методами [Малета Ю.С. и др., 1981; Гланц С, 1999].
Разработка рецептуры липосомального препарата
Несмотря на очевидные недостатки, свойственные инъекционной лекарственной форме, альтернативы рекомбинантному альфа-2 интерферону при лечении ряда вирусных заболеваний в настоящее время не существует. Так, например, сегодня общепризнано, что альфа - интерфероны наиболее эффективны при лечении хронических вирусных гепатитов (ХВГ), они являются , единственными противовирусными препаратами, которые снижают риск формирования цирроза печени и трансформацию его в гепатоцеллюлярную карциному [Блохина Н. П., 1998; Змызгова А. В., 1999]. Кроме этого, препараты рекомбинантного альфа-2 интерферона востребованы при лечении больных гриппом и другими острыми респираторными заболеваниями (ОРЗ). Широкий спектр возбудителей ОРЗ, уникальная изменчивость вирусов гриппа, а также иммуносупрессирующее действие самих респираторных вирусов обусловливают необходимость использования ИНФ в комплексной терапии вирусных заболеваний респираторного тракта [Лобзин Ю.В. и др., 2004]. Однако применение Реаферона в терапии вирусных заболеваний респираторного тракта, особенно с профилактической целью, помимо побочного действия, сопутствующего парентеральному пути введения препарата, объективно сдерживается необходимостью проведения многократных внутримышечных инъекций [Маркарян А. С. и др., 1998; Лобзин Ю.В. и др., 2004].
В ряде случаев, например при лечении вирусных и онкологических заболеваний кожи и слизистых оболочек человека (вирусные конъюнктивиты, кератоконъюнктивиты, герпес, злокачественные лимфомы кожи, грибовидный микоз, плоскоклеточный рак кожи), целесообразно местное (наружное) применение интерферона, позволяющее локально воздействовать на клинический процесс и избегать отрицательных последствий, наблюдающихся при системном введении высоких доз ИНФ [Клявина Е. А., 1991; Попов В. Ф., 2002]. Использование для местного применения инъекционной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона в виде раствора ограничивается, во-первых, низкой стабильностью ИНФ в водных растворах, во-вторых, невозможностью обеспечения длительного контакта действующего начала с обрабатываемой поверхностью. Традиционными лекарственными формами ИНФ для местного (наружного) применения являются мази, гели. Введение биологически активного вещества в мазевую (гелевую) основу позволяет создать высокие концентрации ИНФ в области поражения и повысить его стабильность при хранении. Однако сложный набор компонентов, в том числе консервантов, включаемых в составы для обеспечения стабильности противовирусных свойств мази (геля) и наличие других вспомогательных веществ может вызвать аллергические реакции у пациентов, это ограничивает терапевтические возможности мазевых (гелевых) лекарственных форм [Клявина Е. А., 1991; Майданюк С.А.и др., 2000; Ершов Ф. И., 2006].
Также известны композиции для ректального введения препаратов интерферона, в частности, рекомбинантный альфа-2 интерферон в свечах (виферон) [Чистова Л. В. и др., 1993; В. В. Малиновская, 2003]. Однако, ректальный путь введения интерферона в виде микроклизм или свечей не удобен, не гигиеничен и вызывает естественную неприязнь, особенно у детей. Кроме того, при ректальном введении интерферона трудно обеспечить точное дозирование препарата ввиду частичных потерь либо жидкости, либо свечной массы, остающейся на руках или приспособлениях для введения.
В связи с тем, что терапевтический потенциал рекомбинантного альфа-2 интерферона не полностью использован традиционными лекарственными формами, становится очевидной необходимость разработки новых современных лекарственных форм, которые не имели бы указанных выше недостатков, а также позволили бы их применять для ещё не используемых способов введения интерферона в организм, например перорального.
Одним из перспективных направлений снижения системной токсичности, 9 повышения биодоступности и, как следствие, увеличения терапевтической эффективности лекарств в современной нанобиотехнологии является создание их липосомальных форм [Швец В. И., 2008]. Липосомы при этом используются как биосовместимые и биодеградируемые наносистемы доставки, оптимизирующие действие лекарств. Размеры липосом, обычно используемых в качестве переносчиков лекарств, составляют от нескольких десятков до нескольких сотен нанометров, то есть находятся в нанодиапазоне, что наряду с их биологическими свойствами обеспечивает их эффективность как систем доставки [Каплун А. П., 2007]. Известно, что липосомальные препараты снижают токсичность лекарственных средств, защищают их от преждевременной деградации, тем самым пролонгируя время действия лекарства в организме. Модифицируя мембрану липосом векторными молекулами (то есть молекулами, обеспечивающими специфическое сродство к структурам в поражённом органе или ткани и взаимодействие по типу лиганд - рецептор), можно обеспечить адресную доставку лекарства к клеткам-мишеням. При необходимости транспорта лекарственного вещества к органам ретикуло - эндотелиальной системы использование липосом автоматически решает эту проблему в силу трошюсти носителя к органам РЭС. Кроме того, липосомы изменяют фармакокинетику лекарственных препаратов, повышая их терапевтическую эффективность [Марголис Л. Б.и др., 1986].
На сегодняшний день именно липосомы из всех наночастиц наиболее широко применяются в качестве средств доставки лекарств в клинической практике, ряд липосомальных препаратов лицензирован и производится в промышленных масштабах [Goyal P. et al, 2005; Torchilin V. P., 2005]. Наиболее значимое применение липосомальные препараты получили в химиотерапии опухолевых заболеваний, лечении глубоких микозов, вакцинологии, офтальмологии, пульмонологии и при лечении некоторых других патологических состояний [Goyal P. et al, 2005; Швец В. И., 2008].
Таким образом, потребность практического здравоохранения в инновационных лекарственных формах рекомбинантного альфа-2 интерферона, лишённых недостатков, свойственных традиционным лекарственным формам препарата, очевидна. Учитывая уникальные свойства липосом как носителей лекарств, одним из перспективных подходов к решению этой проблемы является создание липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона, нацеленной на проведение интерферонотерапии без инъекций и сопутствующих им нежелательных побочных эффектов. Бесспорная важность этой задачи для отечественной клинической практики явилась актуальным основанием для проведения данной исследовательской работы.
Транспорт липосомированных лекарств, при различных путях их введения в организм
В качестве химического метода для стерилизации липосом используют, в ряде случаев, антибиотики, добавляемые к суспензии липидных везикул [Gregoriadis G. et al., 1974]. Однако этот метод не идеален для широкого применения из-за опасности реакций гиперчувствительности макроорганизма к антибиотикам и других побочных явлений.
Для химической стерилизации липосом применяют также окись этилена. Процесс осуществляют в течение 2,5 ч. при давлении 1,7 атм, используя в качестве стабилизатора липидного бислоя трегалозу в количестве 4,0 г на 1,0 г липида. Так как окись этилена обладает канцерогенным и мутагенным свойствами, необходимо тщательно дегазировать липосомы после стерилизации [Ratz Н. et al., 1989].
Бислойные липидные мембраны липосом хорошо проницаемы для молекул воды, коэффициент проницаемости составляет около 10" см/сек [Маррголис Л.Б. и др., 1986]. Однако этот показатель резко падает при затвердевании углеводородных цепей [Blok М.С. et al., 1975]. Это свойство липосом обеспечивает возможность их лиофильного высушивания с последующей регидратацией, позволяющей не только получать исходную форму липосом, но и включать в их внутренний объем водную фазу с растворенными в ней различными веществами [Остро М. Д., 1987; Xiao Q., 1991; JizomotoH. 1989; Tang Hui-xian etal., 1988].
Лиофильно высушенные липосомы, особенно если они хранятся при низкой температуре в атмосфере инертных газов, длительно сохраняют свои исходные свойства без потери аісгивности иммобилизованных в них веществ и их «вытекания» за пределы липосомальной мембраны [Каледин В.И. с соавт., 1990].
Лиофилизация липосом предусматривает предварительное их низкотемпературное замораживание, которое проводят в присутствии различных криопротекторов, стабилизирующих внешний и внутренний слои липосомальной мембраны. С этой целью в качестве стабилизаторов используют 1 М трегалозу [Smith G., et al.,1989], 150-300 мМ карбогидраттрегалозу [Rudolph A. S., Cliff R. О., 1990], трегалозу или сахарозу, добавляемые в количестве 60 мг к 1 мл липосом [Плетнева О. П. с соавт., 1990], 5-10% сахарозу, глюкозу или маннит [Музя Г.И. с соавт., 1994]. Последующий режим лиофилизации липосом, как правило, мало чем отличается от технологии высушивания различных биологических препаратов. Описание примерного режима лиофилизации липосомального препарата (ЛП). приведено ниже.
ЛП разливают в стерильные ампулы по 1 мл, в качестве криопротектора добавляют сахарозу до 5% и замораживают при температуре минус 40 С в течение 16 - 18 ч. Лиофилизацию, продолжающуюся 24 часа, осуществляют на установке ТГ - 5, предварительно доводя температуру в камере высушивания до минус 20 С. Рабочее давление в камере - 30 Па. Через 8-12 ч, когда температура препарата достигает 5 - 10 С, включают подогрев и досушивают препарат, доводя температуру до 25С. При этом остаточная влажность лиофильно высушенных липосом составляет 2 - 4 % [Гринько Р. А.., 1997; Гринько Р. А., Ефременко В. И. с соавт., 1997; Ефременко В.И., Таран Т.В., Кузякова Л.М. и др., 1998].
Таким образом, приведённая в данном разделе обзора литературы оценка наиболее распространённых методов приготовления липосомальных форм лекарственных препаратов позволила выявить как их технологические недостатки, так и оценить пригодность тех или иных процедур для создания липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона с учётом его физико - химических и биологических особенностей. Характеристики методов получения липосом, изучения структуры и свойств бислойных липидных везикул говорят о возможности создания ЛП разными способами, с включением в их внутренний объем или мембрану различных лекарственных веществ, стерилизации и стабилизации создаваемых липосомальных препаратов. Это открывает широкие перспективы для использования липосомальных лекарств в клинической практике. Тем не менее, анализ технологических аспектов, свойственных известным методам получения ЛП, не дал исчерпывающего ответа на вопрос о том, каким способом предпочтительнее получать липосомальный ИНФ. Наиболее перспективным методом, по - видимому, является технология получения ЛФИ, основанная на комбинации методов регидратации - дегидратации с экструзией через поликарбонатные ядерные мембраны с последующей стерилизацией и лиофилизацией препарата. Производство липосомального интерферона таким способом позволит выдержать сроки годности и другие показатели качества, рекомендованные ГФ, упростить условия транспортировки и хранения ЛФИ. Проверка справедливости этого предположения явилась одной из целей настоящей работы.
Включение препаратов интерферона в липосомы С того момента, как доступность больших количеств очищенного ИНФ, полученного по технологии рекомбинантной ДНК стала реальностью, не ослабевает интерес к использованию различных лекарственных форм ИНФ в качестве терапевтического средства (антивирусного, иммуномодулирующего, противоопухолевого). Как мы уже отмечали в настоящей работе, терапевтический потенциал ИНФ ограничивается быстрым удалением белка из кровотока, иммуногенностыо, неспособностью к селективной доставке молекул ИНФ к соответствующим клеткам - мишеням. В связи с этим, актуальной является разработка подходов к повышению терапевтической эффективности интерферонов посредством снижения их системной токсичности. Ряд исследователей предполагает, что токсичность биологически активных веществ (БАВ), в частности интерферонов, можно снизить в значительной степени при использовании систем, обеспечивающих их замедленное высвобождение [Eppstein D. A. et al., 1982; Eppstein D. A., 1986]. Двойная функция липосом (защитная и транспортная) идеально подходит для увеличения активности ИНФ in vivo. В связи с тропностью липосом к ретикуло — эндотелиальной системе, использование их для доставки иммуномодуляторов с целью противовирусной терапии эффективно в случае вирусов, поражающих макрофаги и моноциты, а также для вирусов, инфекционность которых подавляется цитотоксическими и цитолитическими макрофагами [Koff W. С. et al., 1985 а, б; Hanschmann Н., 1989].
В литературе имеется большое количество сообщений об успешных испытаниях липосомированных препаратов интерферонов на лабораторных животных [Eppstein D. A. et al., 1982; Eppstein D. A. et al., 1983; Eppstein D. A. et al., 1989; Fidler I. J., 1985; Egbaria K. et al, 1990; Hockertz S., 1991]. Ряд экспериментальных препаратов, методы их получения и свойства приведены в табл.2.
Как следует из данных, представленных в таблице, препараты липосомального ИНФ имели определённые преимущества перед свободными ИЫФ разных типов. Как правило, для приготовления этих препаратов использовали заранее сформированные «пустые» липосомы, которые нагружали активным веществом либо накануне эксперимента, либо непосредственно перед ним. Этот приём позволял исключить проблему «вытекания» лекарственного вещества из везикул. Однако опытные образцы, полученные таким способом, не отвечали требованиям, предъявляемым ГФ к лекарственным препаратам по срокам хранения.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что для включения ИНФ в липосомы чаще других использовали методы мягкого механического встряхивания, дегидратации - регидратации, «обращения фаз», замораживания -оттаивания. Липосомы, полученные этими способами, включали от 5,0 до 50 % активного вещества. Интенсивное перемешивание, озвучивание, экструзия под высоким давлением или упаривание в «обращенной фазе» приводили к большой потери активности ИНФ (до 95 % для (3 - ИНФ) [Gurari - Rotmann D., 1982].
Также изучалась возможность создания на основе липосом, содержащих рекомбинантный генно - инженерный человеческий альфа - 2 интерферон, противовирусных лекарственных средств для местного применения, в частности для лечения генитального герпеса [Мельников В. Г. и др., 1990; Гапонюк П. Я. и др., 2000].
Выбор метода получения липосомальной формы рекомбинантного альфа - 2Ь интерферона человека
Наиболее широкое применение в современной мировой клинической практике липосомальные препараты нашли в химиотерапии опухолевых заболеваний [Muggia F. М. et al, 1997; J.Vaage, 1997; Maruyama К., 1999]. Основными причинами использования липосом в антираковой терапии являются снижение токсичности лекарственного вещества за счёт изменения фармакокинетики и, так называемое, пассивное нацеливание, базирующееся на том, что капилляры, снабжающие солидные опухоли и очаги воспаления кровью, как правило, сильно перфорированы, что ведёт к накоплению липосом с лекарством в опухоли или очаге воспаления [Gregoriadis G. et al, 1991]. В связи с этим усилия многих исследователей были направлены на создание липосомальных форм антрациклиновых антибиотиков, являющихся мощными противоопухолевыми агентами и, вместе с тем, обладающими серьёзными побочными эффектами, такими как кардиотоксичность, нефротоксичность, угнетение кроветворной функции костного мозга, желудочно - кишечные расстройства [Olson F. et al., 1982; Herman E. H. et al., 1983; Van Hoesel Q. G. С. M. et al., 1984]. Сегодня на мировом фармацевтическом рынке представлены несколько вариантов липосомальной формы антрациклинового антибиотика доксорубицина, отличающихся по содержанию включенного антибиотика и размеру липосом [Ten Hagen Т. L. et al., 2000; Ishida Т. et al., 2001; Chao Т. С. et al., 2003]. Препарат «Doxil» ( «SEQUUS Pharmaceuticals», США) представляет собой липосомы, состоящие из фосфатидилхолина, холестерина и стерического стабилизатора — коньюгата дипальмитоилфосфатидилэтаноламина с полиэтиленгликолем 2000, размером 80 - 120 нм (STEALTH - липосомы). «Липодокс» (ЗАО «Биолек», Украина) получен из яичного высокоочищенного фосфатидилхолина, размер липосом около 150 нм. «Myocet» («Sopherion Therapeutics», США) — доксорубицинцитратный комплекс, диаметр липосом около 120-150 нм. Указанные липосомальные препараты обладают высокой противоопухолевой и противолейкозной активностью, обеспечивая свободное высвобождение доксорубицина из липосом и локальное распределение из крови в ткани и органы, вследствие чего уменьшается токсичность антибиотика. Препараты обладают значительно меньшей кардиотоксичностью; миело- и иммуносупрессией по сравнению со свободной формой доксорубицина, и проявляют пролонгированное действие. Применяются для лечения саркомы мягких тканей, рака молочной железы и легких, рака щитовидной и поджелудочной желез, печени, почек, яичников, тела матки [Швец В. И., 2008].
Для терапии острой лейкемии, ретикулосаркомы, хориоэпителиомы матки фирмой «Nextar» (США) разработана липосомальная форма ещё одного антрациклинового антибиотика даунорубицина - «DaunoXome ТМ» [Forssen Е. А. et al., 1994; Pea F. et al., 2000; Daniele B. et al., 2000; Wollina U. et al., 2003].
Эффективными оказались липосомальные препараты, мишенью которых являются клетки РЭС, так как именно эти клетки интенсивно поглощают наночастицы. Такая ситуация характерна для внутриклеточной микробной инфекции и при вакцинации. Так, липосомальный амфотерицин В оказался в 10 раз менее токсичным, чем свободный амфотерицин и эффективным против 15 видов грибковых заболеваний и лекарственно устойчивого висцерального лейшманиоза [Proffitt R. Т. et al., 1991; Meunier F. et al., 1991; Adler - Moore J. P. et al., 1991; Chopra R. et al., 1991]. Препарат на фармакологический рынок под торговым названием «AmBiosome» поставляет фирма «The Liposome Company» (США). Он лицензирован для российского рынка и успешно применяется в терапии внутриклеточных (лейшманиоз и гистоплазмоз), а также внеклеточных (кандидоз и аспергиллёз) системных инфекций, часто наблюдаемых у онкологических больных, больных СПИДом, страдающих иммунодефицитами [Adler-Moore J. et al., 2002; Johnson P. C, 2002; Ringden O., 2002; Kotwani R. N„ 2003; Маякова С. А. и др., 1999].
Целый ряд других антибиотиков, иммобилизованных в липосомы, продемонстрировал увеличенную клиническую эффективность по сравнению со свободными формами в экспериментах на лабораторных животных. Так, липосомальный амикацин («MiKasomeTM» производства «NeXatar Pharmaceuticals» (USA), показал высокую эффективность против внеклеточных инфекций, включая Klebsiella pneumoniae и Pseudomonas endocarditis [Fielding R. M.et al., 1999]. Обнадёживающие результаты были получены при лечении липосомальным ампициллином инфекции, вызванной у мышей Listeria monocytogenes [Bakker-Woudenberg I. A., 1985], липосомальный цефалотин оказался эффективным против Salmonella typhimurium [Desiderio J. V., 1983], липосомальный бензилпенициллин против инфекции, вызванной Staphylococcus aureus [Barsoum I. S., 1982], липосомальный дигидрострептомицин против внутриклеточного Staphylococcus aureus [Bonventre P., 1978] и экспериментального туберкулёза [Владимирский М. А. и др., 1983; Ладыгина Г. А., 1985]. Эффективными оказались иммобилизованные в липосомы ципрофлоксацин и азитромицин в терапии внутриклеточной инфекции, вызванной Mycobacterium avium [Yanagihara К., 2002].
Установлено, что липосомы могут быть хорошими адьювантами по отношению.к вирусспецифическим поверхностным антигенам, это представляет значительный интерес в свете вакцинопрофилактики [Клибанов А. Л. и др., 1988; Gregoriadis G.,1990]. Уже во второй половине 70-ых годов прошлого столетия в литературе появились сообщения о том, что включение поверхностного антигена вируса гепатита В (HBsAg) в состав липосом с последующим его введением морским свинкам, приводило к увеличению титров антител к HBsAg в сыворотке крови иммунизированных животных [Manesis Е. К. et al, 1979]. После вторичной иммунизации HBsAg, включенным в липосомы, титры антител были в 100 раз выше, а после третьей иммунизации - в 750 раз выше, чем при иммунизации свободным антигеном в растворе. С целью получения потенциальных вакцин против вируса гриппа в состав моноламеллярных липосом включали поверхностные антигены вируса гриппа А. Получены вирусоподобные структуры, названные «виросомами». При добавлении к виросомам гипериммунной сыворотки они аггрегировали в большие комплексы, выявляемые с помощью электронной микроскопии. Эти факты свидетельствовали о том, что большинство связывающих антитела центров в составе виросом оставались доступными для связывания специфическими антителами [Almeida J. D. et al, 1975]. Поверхностные антигены вируса гриппа, включенные в липосомы, при иммунизации мышей обладали выраженным защитным действием против инфекции гомологичным штаммом вируса [Анджапаридзе О. Г. и др., 1987; Gregoriadis G., 1994; Gomez-Gutierrez. J., 1995]. Более поздние литературные публикации свидетельствуют о том, что исследовательские работы по созданию липосомальных вакцин стали завершаться созданием фармацевтических препаратов [Gliick R., 1995]. В Швейцарии по этой технологии была создана вакцина против гепатита А под торговым названием «Epaxal - BernaR». Там же ведутся доклинические и клинические испытания вакцин для парентеральной иммунизации против грипппа, кори, гепатита В, дифтерии, столбняка [Vadolas J., 1998]. Создаются липосомальные вакцины и для использования в ветеринарии. Так, «Vineland Laboratories» (USA), получила лицензию на вакцины против болезней, вызываемых вирусами Ньюкасла и Avian rheovirus, обе для применения у цыплят [Vadolas J., 1998]. Отечественные исследователи также работают в этом направлении [Орехов Д. А., 2008].
Оценка стабильности липосомальной формы рекомбинантного альфа - 2Ь интерферона при хранении in vitro
Создание липосомального препарата представляет собой сложную многофакторную задачу, включающую в себя выбор компонентов липидной фазы липосом и их количественного соотношения между собой, определение оптимального соотношения липидов и лекарственного вещества, иммобилизуемого в липосомы, выбор вспомогательных веществ, обеспечивающих сохранность активного действующего начала в процессе производства и хранения препарата. Изучение и оптимизация соотношений компонентов липосомального препарата были необходимы при разработке технологии получения новой липосомальной лекарственной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека.
Существенным моментом при разработке технологии получения липосомального препарата (ЛП) является выбор способа иммобилизации лекарственного вещества во внутренний объём или мембрану липосом. На сегодняшний день известно много способов изготовления ЛП [Кузякова Л. М. и др., 2000], но в каждом конкретном случае требуется определённая их модификация, в зависимости от физико - химических и биологических свойств иммобилизуемого вещества, а также от конечных целей создания препарата.
Интерферон, как известно, относится к гидрофильным биополимерам, поэтому, в основном, иммобилизуется во внутреннюю полость липосомы. В связи с этим в настоящей работе объёму водного пространства везикул уделяли особое внимание, так как от этого параметра зависело количество ИНФ, содержащегося в липосоме. Соответственно, в мультиламеллярные липосомы молено было иммобилизовать больше ИНФ, чем в моноламеллярные, и в настоящей работе это также учитывалось. При этом было важно, чтобы метод включения интерферона в липосомы не приводил к денатурации белка и был пригоден к масштабированию с целью промышленного производства препарата.
Таким образом, из широкого спектра известных методов необходимо было выбрать наиболее полно отвечающие всем требуемым критериям для производства липосомального интерферона. В связи с этим для создания липосомального интерферона нами была проведена сравнительная оценка пригодности нескольких наиболее перспективных, отвечающих перечисленным выше требованиям, методов получения липосом.
Одним из важнейших аспектов при создании ЛФИ для клинического применения явилось определение сроков и условий хранения готового лекарственного препарата. Это обусловлено прежде всего нестабильностью интерферона в водных растворах, что ведёт к потере его биологической активности, возможной утечкой интерферона из липосом при хранении их в виде суспензии, а также ускоренным перекисным окислением липидов жидкого препарата. Кроме того, конформация белковой молекулы может быть нарушена в процессе производства препарата в результате физико - химических и температурных воздействий на интерферон. Учитывая это, требовалось .-изучить сохранность противовирусной активности ИНФ в процессе получения препарата и стабильность ЛФИ при хранении. В связи с тем, что перед нами стояла задача создания препарата, применяемого перорально, необходимо было исследовать стабильность препарата в физиологических условиях желудочно-кишечного тракта человека.
С целью стандартизации производства ЛФИ необходимо было отработать физико - химические и биологические методы контроля свойств препарата в процессе его изготовления и хранения. При этом методы контроля должны были удовлетворять требованиям Государственной Фармакопеи РФ и соответствующих методических указаний, так как липосомальная лекарственная форма рекомбинантного альфа-2 интерферона человека целенаправленно разрабатывалась для клинического применения.
Важным моментом, оказывающим влияние на разрабатываемую технологию создания ЛФИ, являлось определение биологических свойств липосомального ИНФ in vivo. В связи с этим нами проведено изучение противовирусной активности, фармакокинетики и токсических свойств ЛФИ в экспериментах на лабораторных животных. 3.1.1. Выбор метода получения липосомальной формы рекомбинантного альфа-2 интерферона человека
В процессе создания ЛФИ для оценки включения ИНФ в липосомы была необходима отработка процедуры разделения интактного и инкапсулированного белка, кроме того, требовалось каким - либо образом оценивать степень захвата вещества в липосомы. В нашем случае это было возможно 2 разными способами: во - первых, проводить эксперимент с ИНФ, меченным [ I] с последующей оценкой измерения радиоактивности выделенных фракций, содержащих липосомы и не включившийся материал; во - вторых, также разделять липосомы и свободный ИНФ и проводить измерение противовирусной активности ИНФ в липосомальной фракции методом титрования в культуре клеток. Оба метода имеют определённые недостатки, первый требует создания определённых условий для соблюдения правил техники безопасности при проведении работ с радиоактивной меткой, таких как работа в средствах защиты, в специально оборудованном помещении, выделение для экспериментальных работ отдельной посуды с её последующей дезактивацией, и т. п., второй достаточно сложен, требует наличия специально оборудованного стерильного места для проведения культуральных работ. К тому же, продолжительность определения титра интерферона в культуре клеток, как правило, составляет неделю, что при отработке технологии получения липосомальной формы интерферона было очень неудобно, так как требовалась более быстрая оценка результатов экспериментов. Кроме того, необходимо отметить, что субстанция рекомбинантного интерферона альфа — 2 достаточно дорогостоящий продукт, поэтому использование её на этапе предварительных экспериментов мы посчитали не целесообразным. С учётом этих соображений для сравнительной оценки пригодности методов получения липосом с целью создания ЛФИ нами была изучена возможность применения модельного объекта -флюоресцентного водорастворимого- красителя кальцеина. Возможность такого использования при разработке липосомальных препаратов ранее отмечалась в литературе (Лукьянов А.Н.,1991). В рамках настоящего исследования проведена сравнительная оценка четырёх методов получения липосом, отобранных нами по литературным данным как наиболее перспективных для получения ЛФИ: метода мягкого механического встряхивания, озвучивания с включением вещества на стадии замораживания - оттаивания, обращения фаз, дегидратации - регидратации (см. гл.2). В первой части экспериментов определяли процент включения кальцеина в липосомы, липидная фаза которых состояла из фосфатидилхолина (ФХ) и холестерина (Хол) (мольное соотношение 7 : 3), в зависимости от метода получения липосом и суммарной концентрации липидной смеси. Водный буферный раствор (PBS) содержал включаемое вещество - 5 мМ кальцеин, не-включенный в липосомы краситель удаляли гель - фильтрацией на сефадексе G -50. Степень захвата красителя в липосомы определяли, сравнивая величины флюоресценции фракций, содержащих невключенный кальцеин, и фракций, содержащих липосомы. При исследовании степени захвата кальцеина липосомами было установлено, что процент включения нарастал с увеличением концентрации липида, используемого для приготовления липосом. Это характерно для всех методов получения везикул, использованных нами. При суммарных концентрациях липидной смеси 100 и 200 мг/мл процент включения кальцеина в липосомы, полученные разными способами, существенно не различался. Наиболее высокую степень захвата красителя (более 40 %) удалось достичь при получении липосом методами обращения фаз и дегидратации - регидратации. Результаты экспериментов с кальцеином представлены в табл.3.
