Введение к работе
Актуальность темы. Бактерии рода Staphylococcus являются одной из основных причин пищевых отравлений. Причинами патогенности S. aureus считаются факторы вирулентности вырабатываемые бактерией - это и факторы адгезии, и разнообразные ферменты, играющие роль факторов "агрессии и защиты", и комплекс секретируемых экзотоксинов (Becker et al., 2003). Около 6% синтезируемого клеткой белка составляют энтеротоксины (Thomas et al., 2007; Lowy, 1998). На сегодняшний день описано более 25 различных энтеротоксинов, среди которых наиболее распространен SEA.
Энтеротоксины - семейство белков с молекулярной массой 23-30 кД, взаимодействующих с антигенами гистосовместимости (МНС-П) и Т-клеточным рецептором (TCR) (Thomas et al, 2009). В результате формируется комплекс двух видов клеток и молекулы SEA, провоцирующий гипериммунный ответ (Proft, Fraser, 2003; Descloux, Ferry, 2005).
Отравление пищевыми продуктами, содержащими энтеротоксины стафилококков, широко распространено и находится на втором месте после отравлений, вызываемых сальмонельными инфекциями (Lowy, 1998; Le Louir et al., 2003). При пищевых отравлениях возможны различные осложнения, включая развитие пневмонии (Cheng et al., 2012), аутоиммунных заболеваний, таких как ревматоидный артрит (Howell et al., 1991.), атопический дерматит (Ikezawa et al, 2010; Niebuhr et al, 2010), и аллергические заболевания. Синтезируемые бактериями энтеротоксины могут проникать в кровоток не только через ткани желудочно-кишечного тракта, но и через эпителиальные ткани дыхательных путей.
Таким образом, задача детекции и нейтрализации токсинов актуальна как для здравоохранения, так и для современной науки. Вакцинация пациентов природным антигеном осложняется ответной гиперреакцией организма. Применение рекомбинантных аналогов энтеротоксина и конкурентных молекул, блокирующих взаимодействие токсинов с рецепторами на компетентных клетках оказалось малоэффетивно. Показано, что антитела иммунных доноров способны нейтрализовывать энтеротоксины при пассивной вакцинации. Поэтому получение нейтрализующих антител или искусственных конструктов на их основе может быть одним из решений данной задачи. Один из основных способов получения антител человека - это конструирование библиотек антител на основе генетического материала антителопродуцирующих клеток доноров и отбор из этих библиотек антител с заданными свойствами.
Цель данной работы: получение рекомбинантных миниантител человека в формате scFv против стафилококковго энтеротоксина А с помощью технологии фагового дисплея и характеристика их взаимодействия с антигеном.
В задачи работы входило:
-
провести аффинное обогащение фаговой библиотеки на стафилококковом энтеротоксине А и определить уровень детекции SEA ;
-
экспрессировать антитела в клетках Е. coli и выделить очищенные препараты;
-
разработать способ хранения полученного препарата миниантител;
-
определить основные характеристики полученных миниантител: аффинность и специфичность;
-
провести картирование эпитопов стафилококкового энтеротоксина А, распознаваемых полученными миниантителами.
Основные положения, выносимые на защиту:
-
Используя библиотеку миниантител, сконструированную на основе анти-телопродуцирующих клеток неиммунных доноров с помощью методов аффинной селекции возможно получить миниантитела к стафилококковому энтеротоксину А. Антитела распознают SEA как в иммуно-ферментном анализе, так и в методе иммуно-ПЦР в фаговом формате .
-
Полученные рекомбинантные антитела эффективно экспрессируются в клетках Е. coli. Миниантитела синтезируются как в виде растворимого клеточного белка, так и виде телец включения. Рефолдинг миниантител методом гельфильтрации в присутствии аргинина позволяет успешно получать активный препарат миниантител из телец включения.
-
Полученные рекомбинантные антитела распознают эпитопы, локализованные на разных доменах стафилококкового энтеротоксина А. Эпитопы представляют собой линейные участки длиной 5-7 аминокислот.
Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе впервые были получены человеческие миниантитела в формате scFv против стафилококкового энтеротоксина А. На основе полученных фаговых антител разработан способ детекции SEA с использованием метода фагового иммуно-ПЦР. Предложен способ выделения и ренатурации миниантител из телец включения методом гельфильтрации через слой раствора аргинина. Впервые показана возможность хранения лиофилизованного препарата фаговых миниантител. Установлены эпитопы взаимодействия полученных антител со стафилококковым эн-
теротоксином А.
Полученные миниантитела можно использовать для создания диагностического набора на основе твердофазного ИФА или ПЦР. Также возможно использование антител для создания препарата, нейтрализующего стафилококковые энтеротоксины.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных конференциях: зимняя молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2013), 9th 1ST Asia Pacific meeting on animal, plant and microbial toxins (Vladivostok, 2011), 10-ом съезде Научного общества гастроэнтерологов России "Российские научные школы. Технологии качества" (Москва, 2010), на ежегодных Пущинских школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2010, 2011, 2012), V Международная конференция "Наука и образование для целей биобезопасности" (Пущино, 2008).
Диссертационная работа была апробирована на межлабораторном семинаре ФБУН ФИБХ РАН 14 марта 2013 и на семинаре секции "Молекулярная биология" Ученого совета ФГУП ГосНИИгенетика 28 марта 2013г.
Публикации. Основные результаты по теме диссертации изложены в 10 печатных работах, из которых 4 статьи в журналах, входящих в перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК, и 6 опубликованы в виде материалов конференций.
Объем и структура работы. Диссертация изложена на 131 странице и состоит из следующих разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Экспериментальная часть", "Результаты и обсуждение ", "Выводы", "Список сокращений" и "Список литературы". Работа содержит 37 рисунков и 9 таблиц.
