Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11
1.1. Современное состояние заболеваемости и эпидемиологическая ситуация по сифилису-
1.2 L-формы бактерий, особенности биотрансформа-ции в L-формы T.palludum 15
1.3. Методы лабораторной диагностики сифилиса 26
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 37
2.1. Штаммы микроорганизмов, взятые в работу 37
2.2. Питательные среды 37
2.3. Основные химические реактивы и оборудование 37
2.4. Получение антигенных комплексов микроорганизмов 37
2.5. Лабораторные животные, использованные в опытах 37 Получение гипериммунных сывороток 42
Физико-химические и иммунологические методы 42
Получение иммунофлуоресцирующих конъюгатов- 42
Иммунофлуоресцентный анализ 42
Иммуноферментный анализ 43
Сублимация МИБП 43
Статистическая обработка материала 43
ПОЛУЧЕНИЕ ИЗМЕНЕННЫХ ФОРМ БЛЕДНОЙ ТРЕПОНЕМЫ И ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССА ЕЁ БИОТРАНСФОРМАЦИИ 44
Подбор оптимальной питательной среды 45
Особенности биотрансформации культуральной бледной трепонемы in vitro по данным элек
тронной микроскопии 49
Получение биомассы L-форм бледной трепонемы 55
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОЙ СТРУКТУРЫ ТИПИЧНОЙ И ФОРМ БЛЕДНОЙ ТРЕПОНЕМЫ В НЕКОТОРЫХ СЕРОЛОГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ- 29
4.1. Выделение специфических антигенов из типичной и L-форм бледной трепонемы- 60
4.2. Получение гипериммунных сывороток крови 64
4.3. Сравнительное изучение антигенных взаимоот- 67 ношений L-вариантов бледной трепонемы с извитой формой Т.pallidum
Глава 5. ВЫЯВЛЕНИЕ ТРЕПОНЕМНЫХ L-АНТИТЕЛ В ЭКСПРЕССНЫХ МЕТОДАХ ИММУ-НОАНАЛИЗА В ЭКСПЕРИМЕНТЕ- 81
5.1. Модифицированный иммуноферментный анализ 81
5.2. Количественный иммунофлуоресцентный анализ с применением магноиммуносорбентов
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 94
ВЫВОДЫ 106
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 109
- Современное состояние заболеваемости и эпидемиологическая ситуация по сифилису-
- Штаммы микроорганизмов, взятые в работу
- Подбор оптимальной питательной среды
Введение к работе
Актуальность проблемы
Ежегодно в России регистрируется более 1 млн. инфекций , передаваемых половым путем, из них более 270 тыс. составляют больные сифилисом. По сравнению с 1989 г. число заболевших сифилисом выросло более чем в 33 раза. При этом произошло увеличение числа ежегодно регистрируемых больных сифилисом (все формы) в 37,7 раза, из них первичным - в 33,2 раза, вторичным - в 34,2 раза, ранним скрытым - в 57,1 раза, а прочими формами в - 4,6 раза, в том числе ранним врожденным с симптомами - в 47,7 раза (Онищенко Г.Г., 2002, 2002а; Яцуха М.В., Козырева Л.Т., Бобкова И.Н. и др., 2002).
Известно, что T.pallidum при определенных условиях, благодаря действию защитных сил организма, трансформируется в формы выживания (цисты и L-формы), что обусловливает развитие серорезистентности у больных, получавших специфическое лечение. Важное теоретическое и практическое значение имеют наблюдения авторов о L-трансформирующем влиянии на возбудителя сифилиса соответствующих иммунных сывороток, особенно если помимо антител сыворотка крови содержит пенициллин. Здесь прежде всего нужно думать о детях, рожденных от больных сифилисом матерей -как не леченных, так и леченных пенициллином во время беременности, так как дети с кровью матери получают антитела и пенициллин, которые являются мощным L-трансформирующим фактором (Беднова В.Н., 2001; Яро-винский Б.Г., Зурочка А.В., и др., 2001; Хамаганова И.В., Кошина М.В., Пи-вень А.П. и др., 2004). Результаты серологических исследований в данном случае помочь не могут, так как в настоящее время во всем мире антигены для всех специфических реакций на сифилис готовят из извитых форм возбудителя. В связи с этим, в последние десятилетия учеными неоднократно ставился вопрос о необходимости расширения экспериментальных исследований в отношении биологии возбудителя сифилиса как извитых, так и атипичных форм, в частности, совершенствовании его серодиагностики с разработкой антигенов из атипичных форм бледной трепонемы (Овчинников Н.М., 1970, 1974; Беднова В.Н., 2001; Дмитриев Г.А., Аковбян В.А., Тихонова Л.И., 2001).
Цель и основные задачи исследований
Цель диссертационной работы заключалась в получении L-форм бледной трепонемы и изучении возможности выявления антител к ним в экспрессных методах иммуноанализа в эксперименте.
Для достижения указанной цели предполагалось решить следующие задачи:
- подобрать рецептуру питательной среды, обеспечивающую стабильное образование L-форм бледной трепонемы и наращивание её биомассы;
- изучить процесс трансформации бледной трепонемы в L-форму методом электронной микроскопии;
- выделить специфические антигенные комплексы из типичной и L-форм Т.pallidum и изучить их в сравнительном аспекте;
- разработать технологию получения высокоактивной кроличьей гипериммунной антисыворотки против L-формы бледной трепонемы;
- разработать модифицированный вариант иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления трепонемных L-антител;
- разработать магноиммуносорбентный трепонемный L-антигенный диагностиком для количественного иммунофлуоресцентного анализа (КИФА).
Научная новизна работы
Разработана рецептура питательной среды с композицией индукторов L-трансформации, обеспечивающая стабильное получение L-форм бледной трепонемы.
С помощью электронной микроскопии изучен процесс биотрансформации Т.pallidum в L-форму. Для изолирования специфических антигенных комплексов из извитых и L-форм бледной трепонемы разработан ряд последовательных манипуляций, позволивший получить антигенные компоненты клеточной стенки и цитоплазмы.
Разработан методический подход к получению высокоактивной гипериммунной кроличьей сыворотки против антигена L-формы бледной трепонемы.
Сравнительное изучение антигенной структуры родительской (извитой) и L-формы T.pallidum показало потерю части антигенов, связанных, по всей вероятности, с клеточной стенкой микроорганизма.
Предложен модифицированный метод постановки ИФА для выявления в сыворотке крови специфических L-антител к атипичной форме бледной трепонемы.
Впервые разработан экспрессный метод определения L-антител в количественном иммунофлуоресцентном методе с использованием иммуно-сорбентной биотехнологии.
Приоритетность выполненных исследований подтверждена патентом РФ на изобретение «Способ культивирования Л-форм бледных трепонем» (положительное решение о выдаче патента от 5.12.2005 г. по заявке №2004130018).
Практическая значимость диссертации
Разработанный комплекс последовательных лабораторных приемов с использованием предложенной питательной среды позволяет получать чистую биомассу L-форм бледной трепонемы в достаточном количестве для научных и практических целей.
Получены высокоактивные специфичные трепонемные гипериммунные сыворотки в результате подбора эффективного способа иммунизации кроликов антигенным комплексом из L-форм T.pallidum, которые могут быть использованы в качестве положительного контроля при постановке серологических реакций.
Предложена модификация постановки иммуноферментного анализа на стекле для выявления L-антител, которая может способствовать совершенствованию серодиагностики сифилиса.
Использование трепонемных L-антигенных магноиммуносорбентов в количественной реакции иммунофлуоресценции позволило повысить диагностическую ценность этой реакции.
Материалы научных разработок легли в основу методических рекомендаций «Получение L-форм бледной трепонемы и определение антител к ним в иммуноферментном анализе», которые были одобрены Ученым советом ФГУЗ СтавНИПЧИ Роспотребнадзора (протокол №9 от 27 октября 2005г.) и утверждены директором института 27 октября 2005 г.
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы были доложены на заседании Ставропольского краевого научного общества дерматовенерологов (Ставрополь, 2003); XI Итоговой (межвузовской) научной конференции молодых ученых и студентов (Ставрополь, 2003); научно-практической конференции «Опыт работы учреждений Роспотребнадзора в Ставропольском крае по обеспечению санэпидблагополучия и защиты прав потребителей» (Ставрополь, 2005); Ставропольского филиала Общероссийской общественной организаии «Российское общество дерматовенерологов» (Ставрополь, 2005).
Основные положения, выносимые на защиту
1. Разработка рецептуры питательной среды для стабильного получения L-форм бледной трепонемы и изучение её изменчивости в процессе L-трансформации методом электронной микроскопии.
2. Получение антигенного комплекса из извитых и L-форм бледной трепонемы. 3. Технология получения специфичной гипериммунной кроличьей антисыворотки к L-форме бледной трепонемы.
4. Сравнительное изучение антигенной структуры извитой и измененной форм бледной трепонемы в некоторых серологических реакциях.
5. Модифицированный метод постановки ИФА для определения L-антител в сыворотке крови.
6. Магноиммуносорбентный L-антигенный диагностикум для КИФА.
Декларация личного участия автора
Экспериментальные исследования выполнялись лично автором или при непосредственном участии в составе научных групп в период с 2002 по 2005 гг. Обработка полученных данных, их интерпретация и оформление осуществлены автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад автора 50-70 %.
Публикации
Основное содержание диссертации, выполненной в рамках НИР «Получение и характеристика атипичных форм бледной трепонемы и их ревер-тантов» (№ ГР 01200311390) по Ставропольской государственной медицинской академии, отражено в 9 опубликованных научных работах (4 депонированные работы, 5 трудов в научных сборниках) .
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глава 1), 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы.
Она изложена на 142 страницах, содержит 8 таблиц, 17 рисунков. Список литературы включает 212 отечественных и 118 зарубежных литературных источников.
Современное состояние заболеваемости и эпидемиологическая ситуация по сифилису-
Заболеваемость инфекциями, передаваемыми половым путем (ИППП), продолжает увеличиваться во всем мире и представляет одну из основных социальных и медицинских проблем. По данным ВОЗ, в мире ежегодно регистрируется более 250 млн. случаев заболевания ИППП, в том числе сифилисом - 3,5 млн. (Мавров Г.И., Гебенко Т.В., 1998; Чеботарев В.В., Павлик Л.В., Земцов М.А. 1999; Еремин В.Ф., Барабанов Л.Ш., Гасич Е.Л. и др., 2002; Quinn Т.С., 1994; Chermesky М.А., 1999 и др.).
Уровень заболеваемости сифилисом в России достиг беспрецедентных по своим масштабам величин за всю послевоенную историю нашей страны: в 1996 году заболеваемость сифилисом составила 264,6 случая на 100000 населения (Горелова О.В., Аковбян Н.А., Фидаров А.А., 1999), а среди лиц в возрасте 20-29 лет - 900 случаев на 100000 (Young Н., 2001), в 1999 г. она достигла 186,7 случаев на 100000 населения (Ломоносов К.М., 2002). Лишь в 1925 году в разгар НЭПа показатель заболеваемости сифилисом был выше -683 случая на 100000 населения (Волкославская В.Н., 1998; Онищенко Г.Г., 2002, 2002а). Эпидемия сифилиса наносит в настоящее время в России большой ущерб как здоровью граждан, так и экономике страны (Лосева O.K., 1991; Аравийская Е.Р., 1999; Лосева O.K., Бабкова И.Н., 1999).
Значительный рост заболеваемости сифилисом отмечается во всех республиках бывшего Советского Союза (с увеличением заболеваемости среди подростков, беременных и сельского населения) (Капкаев Р.А., 1998; Еремин В.Ф., Барабанов М.Г.. Гасич Л.Е. и соавт., 2002; Юлдашев К.А., Магрунов Б.А., Парпиев З.А. и соавт., 2003). С повышением заболеваемости сифилисом отмечается «омоложение» этой болезни, причем, темпы роста заболеваемости у детей значительно опережают аналогичный показатель у взрослых. Если за 1995-1999 гг. показатель заболеваемости среди взрослого населения возрос в 2,5 раза, то среди детей в 5 раз, при этом доминирует (у детей) половой путь передачи, тогда как 10-12 лет назад - контактно-бытовой (Оли-сов А.Л., Комлев М.В., Левина Т.В., и др., 2005 ).
Как сообщает ряд исследователей, в Российской Федерации в последние годы регистрируется увеличение специфических поражений нервной системы среди всех форм сифилитической инфекции (Олисов А.О., Потека-ев Н.С., Дударев А.Ф. и соавт., 1997; Лосева O.K., Тактамышева Э.Д., Штульман Д.Р., 1999; Бакулев А.Л., Колоколов О.В., Суворов А.П., 2002; Кулагин В.И., Селисский Г.Д. , Богуш П.Г. и соавт., 2003; Хамидов Ш.А., Валиханов У.А., Балтабаев М.К., 2004).
Одним из ведущих эпидемических факторов, определяющих значительный рост инфекций, передаваемых половым путём (ИППП), в России является активизация способов передачи инфекции (Навроцкий А.П., 1989; Яцуха М.В., Аковбян В.А., 1994; Лосева O.K., Нашхоев М.П., 1999). В реальной жизни это означает появление массивных контингентов лиц, занимающихся коммерческим сексом, гомосексуализмом, наркоманией. Однако, это лишь одна из особенностей эпидемиологии сифилиса.
Общепринято, что распространение инфекционных заболеваний регулируется определёнными механизмами: свойствами возбудителя заболевания (вирулентность), иммунной структурой населения (восприимчивость к заболеванию), особенностями механизмов передачи возбудителя (активация, замедление, прекращение) (Лосева O.K., Нашхоев М.П., 1999). Вирулентность относится к фенотипическим характеристикам возбудителя инфекции и может изменяться в определённую сторону под влиянием различных факторов окружающей среды (например, условий культивирования). Патогенность микроба закреплена генетически. Попадая в восприимчивый организм человека, микроорганизм проявляет свою патогенность, которая реализуется в виде комплекса клинических симптомов, характерных для сифилитической инфекции (Лосева O.K., Доля О.В., Чиханатова А.Е., 1997; Гражданцева А.А., Сиволобова Г.Ф., Урманов И.Х., 1998; Иванов В.М., Ломоносов К.М., Стенина М.А., 1998; D Alessandro G., 1957; D Alessandro G., Dardanoni L., 1958; D Alessandro G., Del Carpio C.A., 1958).
Штаммы микроорганизмов, взятые в работу
Для выращивания трепонем использовали печеночную питательную среду (Гельтцер P.P., 1936); среду Китт-Тароцци, пептонный бульон из бычьих сердец (ПББС) (Овчинников Н.М. и др., 1970); тиогликолевую среду (Сержантова Т.П., 1979).
2.3. Основные химические реактивы и оборудование
Оборудование и химические реактивы, использованные при проведении исследований, представлены в таблице 1.
2.4. Получение антигенных комплексов микроорганизмов
В работе использовали ультразвуковой трепонемный антиген (УЗТА) производства ФГУП «Аллерген», г.Ставрополь.
Разрушение микробных клеток проводили на установке УЗДН-2Т при частоте колебаний 44 кГц и Х-прессе.
Водорастворимые антигенные комплексы микробных клеток и тканей органов экстрагировали 2,5 % раствором NaCl.
2.5. Лабораторные животные, использованные в опытах
В работе использовали 10 здоровых кроликов породы "Шиншилла", весом 2,5-3 кг.
В процессе содержания животных поддерживали рекомендуемый режим питания согласно приказу № 1179 (М., 1983).
Все процедуры по экспериментальным животным, включая эвтаназию, проводили согласно рекомендациям В.В.Карпенко, В.И.Сачкова (1985), С.А. Куфлиной, Т.Н.Павловой (1985).
2.6. Получение гипериммунных сывороток
Гипериммунные кроличьи сыворотки получали по разработанной И.С.Тюменцевой (1996) схеме иммунизации с использованием иммунокор-ректора - феракрила.
2.7. Физико-химические и иммунологические методы
Количественное определение белка проводили по методу O.Warburg и W.Christian (1941) сравниванием поглощения белка при 280 и 260 нм на спектрофотометре СФ-46 (Практическая химия белка, 1989).
Спектр поглощения микробных антигенов определяли на спектрофотометре «Specord» (ГДР) при длине волн X 210-300 нм.
Гельфильтрацию проводили на хроматографической установке «Mini-coldlab» (LKB, Швеция).
Реакцию иммунодиффузии в агаровом геле (1 %, Difco, USA) проводили по O.Ouchterlony (1949).
2.8. Получение иммунофлуоресцирующих конъюгатов
Конъюгацию иммуноглобулинов, фракционированных каприловой кислотой (по Steibuch G., Andran R., 1969), с ФИТЦ (C2iHnN05S) фирмы «Sigma» проводили по Х.Шторц (Storz, 1987). Культивирование бледной трепонемы на искусственных питательных средах представляет определенные трудности в силу её биологических свойств, тем более, если стоит задача получить L-формы этого микроба.
Универсальных сред для получения и пассирования L-форм разных видов бактерий не существует. Состав сред и условия культивирования (сроки, температура, условия аэро- и анаэробиоза или культивирование в атмосфере углекислого газа) зависят от вида бактерий, подвергающихся L-транс-формации. Основными средами чаще всего являются триптический перевар мяса, сердечной мышцы быка, экстракт мозга и сердца и т.д. В качестве дополнительных факторов роста используют дрожжевой гидролизат, печеночный, яичный экстракты и др. (Тимаков Г.Д., Каган Г.Я., 1973).
Часто в лабораторной практике в качестве источника азота употребляют пептоны - препараты, получаемые в результате неполного ферментативного гидролиза белков. Пептоны различаются как своим аминокислотным составом (зависящим от того, из каких белков они изготовлены), так степенью протеолиза. Типичные пептоны получаются из белков при помощи пепсина. Они содержат более 80% полипептидов, причем некоторые их этих пептидов обладают высоким молекулярным весом и напоминают своими свойствами белки. Свободных аминокислот в пептонах почти нет. Путем обработки трипсином можно добиться более глубокого протеолиза белковых молекул до низкомолекулярных пептидов. И, наконец, посредством кислотного гидролиза достигают полного расщепления белка до свободных аминокислот. Особенно часто применяется гидролизат казеина, содержащий весь набор аминокислот, за исключением триптофана, который под действием минеральных кислот разрушается (Карышева Л.П., 2002; Методические рекомендации по контролю пептидного состава гидролизатов для выращивания бактериальных культур: М., 1994; Скичко Н.Д., 1992; Hayaski К., Seino A.,KasumiT., 1981).
Пептоны, в которых имеется много высокомолекулярных фракций, хорошо усваиваются только протеолизирующими микроорганизмами, приближаясь в этом отношении к белкам. Пептоны с большим количеством свободных аминокислот и коротких пептидов находят себе больше потребителей среди микроорганизмов (Руководство по микробиологии, диагностике инфекционных болезней: М., 1973; Семенов СМ., 1988; Dimova Е., Nikolova S., Gousterova A. et al., 2001).
Непременным условием индукции L-вариантов микроорганизмов является включение в состав среды нормальной сыворотки млекопитающих. Сравнительное изучение сывороток разных видов животных (Dienes L., Weinberger Н.,1951; Edwad D.G., 1954; Minck R., 1955) выявило высокую эффективность нормальной сыворотки лошади.
Для индукции L-форм разных видов бактерий большое значение имеют состав и концентрация солей, стабилизирующих осмотическую концентрацию среды, в которой происходят индукция и последующее культивирование L-форм.
Указания на возможности L-трансформации бледной трепонемы и изучение её биологических свойств имеются у ряда авторов ( Вяселева СМ., 1954; Вяселева СМ., Устименко Л.М., 1964; Овчинников Н.М., 1955; Овчинников Н.М., Делекторский В.В., 1970; Устименко Л.М., 1964, 1965, 1972, 1974, 1975, 1975а; 1983).
При отработке оптимальной рецептуры питательной среды в качестве основы мы использовали перевар Мартена, триптический гидролизат казеина, пептонный бульон из бычьих сердец, печеночную питательную среду, Китт-Тароцци, в состав которых в различных сочетаниях и количествах дополнительно входили: нормальная лошадиная сыворотка (10-20 %), экстракт кормовых дрожжей (3-10 г/л), натрия хлорид (0,5-7,5 г/л), сернокислая магнезия (0,2-0,5 г/л), сахароза, глюкоза (3-7 г/л), кислота тиогликолевая (0,3-0,7 г/л).
В сериях опытов было испытано 15 вариантов питательных сред (таблица 2), на которые высевали VII штамм культуральной бледной трепонемы II иммунологической группы (Ставрополь VII). В разлитые по 5 мл стерильные питательные среды засевали по 10 капель маточной культуры, выращенной на среде Китт-Тароцци. Посевы выдерживали в термостате при температуре 37 иС в течение 4-5 суток. После извлечения пробирок из термостата для определения веса выращенной бактериальной массы их содержимое переносили в центрифужные стаканы и центрифугировали при 3000 об/мин в течение 30 мин. Результаты определяли по конечному накоплению трепонем. Для этого осажденную биомассу взвешивали на электронных весах «Sartorius» с последующим вычислением показателя прироста бактериальной массы. Показатель прироста биомассы вычисляли по формуле (Олифе-роваЭ.В., 1998):
2.9. Иммунофлуоресцентный анализ
Прямой метод окраски осуществляли по А.Н.Coons, М.Н. Kaplan (1950). Количественный иммунофлуоресцентный анализ проводили по методу К.Г. Стоева, В.А.Чибисовой, К.А.Шаханиной и др. (1981).
2.10. Иммуноферментный анализ
Постановку ИФА проводили в соответствии согласно «Инструкции попостановке ИФА на поверхности твердофазного носителя» (М.,1988) в нашей модификации, используя иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кролика производства НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи.
2.11. Сублимация МИБП
Лиофилизацию антигенов, сывороток, иммуноглобулинов и диагностических препаратов проводили в камере TG-5 (Германия). Жидкие препараты разливали в ампулы ШПВ-6 по 0,5-1 мл, замораживали в низкотемпературном столе типа NZ-280/75 при температуре минус (45+5) С не менее 16 ч и лиофилизировали.
Подбор оптимальной питательной среды
Похожие диссертации на Получение атипичных форм Treponema pallidum и детекция антител к ним в эксперименте
