Введение к работе
Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза (КФ 3.5.1.11, ПА) относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз и впервые была открыта как катализатор гидролиза амидной связи в антибиотиках пенициллинового ряда. ПА обнаружены в бактериях, дрожжах и низших грибах. Физиологическая роль фермента до конца не ясна. По-видимому, он служит для утилизации гетероциклических соединений в качестве источника углерода. На практике ПА применяется как для получения 6-аминопенициллановой кислоты - основного синтона для полусинтетических антибиотиков пенициллинового ряда, так и в самих процессах синтеза этих антибиотиков. Кроме того, ПА также применяется для кинетического разделения рацемических смесей с последующим использованием полученных оптически активных веществ в фармацевтической промышленности, для защиты гидроксильных и аминогрупп в пептидном синтезе и тонком органическом синтезе.
ПА изучается уже более 40 лет. По типу гид рол изуе мого субстрата ПА делят на 3 класса: ферменты класса I осуществляют предпочтительный гидролиз пенициллина V, а классов II и III - пенициллина G и ампициллина соответственно. Класс II, в свою очередь, делится на два подкласса: На и Мб. Относящиеся к ним ПА гидролизуют ароматические и алифатические амиды, соответственно. Для двух пенициллинацилаз G (класс Па) известны трехмерные структуры, в том числе, для фермента из Е.соН (ЕсПА*). Исторически так сложилось, что именно ЕсПА является наиболее изученной и широко используемой на практике. Однако данный фермент обладает рядом недостатков. В первую очередь это связано с тем, что фермент в ходе эволюции был оптимизирован под природные субстраты, в то время как для получения полусинтетических антибиотиков необходима высокая активность с неприродными аналогами. В случае кинетического разделения рацематов структура многих перспективных соединений также очень далека от природных. Поэтому для разработки новых процессов биокаталитического получения различных соединений с помощью ПА необходимо «оптимизировать» свойства фермента под каждый конкретный процесс. В первую очередь необходимо улучшение кинетических параметров фермента по отношению к некоторым субстратам, как для синтеза антибиотиков, так и для получения оптически-активных соединений. Наличие трехмерной структуры различных вариантов ЕсПА дикого типа и ее мутантов позволяет использовать для этой цели метод «рационального дизайна», основанный на введении в структуру фермента направленных аминокислотных замен, выбор которых осуществляется именно на основе анализа «рентгеновской» или модельной структуры.
* В работе использовали следующие сокращения: ЕсПА и Л/ПА - пенициллинацилазы из бактерий Е.соН и A.faecalis соответственно, ИПТГ - изопропил-р-Р-тиогалактозид, ФМСФ -фенилметилсульфонилфторид, NIPAB - л-нитро-м-карбоксианилид фенилуксусной кислоты, NIPGB - л-нитро-м-карбоксианилид фенилглицина, МК- миндальная кислота.
Другим очень перспективным ферментом является пенициллинацилаза из грам-отрицательных бактерий Alcaligenes faecalis (ЛЯПА). Она обладает повышенной термостабильностью, и более широким рН-оптимумом активности, смещенным по сравнению с БсПА в щелочную область. ЛЯПА также имеет некоторые отличия в спектре субстратной специфичности. Из всех известных пенициллинацилаз G данный фермент обладает самой высокой специфичностью по отношению к бензилпенициллину, а его специфичность по отношению к амиду D-фенилглицина на порядок выше, чем у ПА из E.coli. Имеются данные, что пенициллинацилаза из A.faecalis обладает более высокими каталитическими характеристиками при кинетическом разрешении ряда оптических изомеров. Однако, систематических исследований по изучению механизма действия, структуры, стабильности фермента и его белковой инженерии не проводилось. Кроме того, очень актуальной является проблема создания отечественного штамма - продуцента рекомбинантной ПА из A.faecalis, поскольку все три известные на настоящий момент нуклеотидные и аминокислотные последовательности этого фермента запатентованы.
Цель и задачи исследования. Целью данной работы было:
-
Клонирование гена ПА из E.coli, создание штамма-продуцента рекомбинантной ЕсПА.
-
Получение мутантных форм рекомбинантной ПА из E.coli с улучшенными каталитическими характеристиками для синтеза ампициллина и получения оптически-активных соединений.
-
Получение рекомбинантной ПА из бактерий Alcaligenes faecalis: клонирование гена, создание штамма-продуцента, оптимизация системы экспрессии, изучение каталитических свойств фермента и его термостабильности.
-
Моделирование структуры фермента из Alcaligenes faecalis.
Научная новизна. Впервые получены 13 мутантных форм E.coli (ЕсПА) с заменами в области субстрат-связывающего кармана и активного центра фермента. Показано, что введенные мутации по-разному влияют на каталитические параметры мутантов в реакциях синтеза ампициллина и реакциях стереоселективного гидролиза амидов.
Клонирован ген новой ПА из A.faecalis VKM-B1518 (ЛЯПА-VKM). Показано, что, несмотря на отличия в аминокислотной последовательности, клонированный фермент по своим кинетическим свойствам не отличается от ранее известных ЛЯПА. Нуклеотидная последовательность гена ЛЯПА-\/КМ-В1518 аннотирована в базу данных GenBank под номером FJ042491.
Впервые для ЛЯПА проведено систематическое исследование механизма термоинактивации. Показан мономолекулярный механизм и определены термодинамические активационные параметры процесса.
Построена компьютерная модель трехмерной структуры пенициллинацилазы из A.faecalis VKM-B1518. На основе полученной модельной структуры предложены варианты сшивок для получения пермутированного фермента.
Практическая значимость работы. Получены мутантные формы ЕсПА с улучшенными каталитическими характеристиками в реакциях синтеза ампициллина и амоксициллина и в реакциях стереоселективного синтеза/гидролиза амидов. Клонированный ген AfT\A является патентно чистым. На его основе создан штамм-продуцент рекомбинантного фермента. Оптимизированная система экспрессии рекомбинантной AfT\A в клетках E.coli позволяет получать до 5000 Ед с литра среды. Построение модельной структуры Л/ПА создало основу для проведения экспериментов по его белковой инженерии.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих Международных и российских конференциях: 8-ой Европейский Симпозиум Белкового Общества (Цюрих, Швейцария, 2009), 4-й и 5-й Московский Международный Конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007 и 2009 гг.), Международная конференция «Биокатализ. Фундаментальные основы и применение» (Москва, Санкт-Петербург, 2007 и Архангельск, 2009), Международная конференция «Ломоносов - 2007 и 2009» (Москва, Россия, 2007 и 2009), III Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 1 статья в журнале, входящем в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, опубликованный на сайте ВАК РФ, и 8 тезисов докладов Международных и Российских конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их
Похожие диссертации на Клонирование и экспрессия в E.coli пенициллинацилаз для получения мутантных форм с улучшенными свойствами
