Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы Гудков Денис Андреевич

Содержание к диссертации

Введение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 10

1.1. Фермент органофосфатгидролаза 10

1.1.1. Структура активного центра и центра связывания субстрата ОРН, а также механизм действия фермента 11

1.1.2. Пространственная структура ОРН 18

1.2. Создание гибридных белков 21

1.2.1. Гибридные партнеры, увеличивающие выход растворимой формы целевого белка в клетках 21 "

1.2.2. Флуоресцентные белки 22

1.2.2.1. Зеленый флуоресцентный белок 23

1.2.2.2. рН-чувствительные генетически модифицированные аналоги GFP 25

1.2.3. ОРН в составе гибридных белков 28

1.3. Рефолдинг белков из телец включения 32

1.3.1. Общие принципы проведения рефолдинга 34

1.3.2. Рефолдинг полигистидинсодержащих белков 35

1.4. Применение биотехнологических приемов усовершенствования культивирования клеток Е. соїі для увеличения выхода растворимой формы рекомбинантных белков 36

1.4.1. Культивирование микроорганизмов в периодическом режиме 36

1.4.2. Культивирование микроорганизмов в полупериодическом режиме 39

1.4.3. Аэрация среды, использование перфторуглеродных соединений для увеличения растворимости кислорода в среде культивирования 43

1.4.4. Экспрессия генно-инженерных конструкций в рекомбинантных клетках микроорганизмов 46

1.5. Применение растворимой формы фермента Hise-OPH 49

1.5.1. Применение ОРН в процессе обезвреживания реакционных масс, полученных в результате химического уничтожения ФОВ 49

1.5.2. Фильтрующесорбирующие материалы для средств индивидуальной защиты от воздействия ФОС 51

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 56

2.1. Материалы и приборы 56

2.1.1. Реактивы 56

2.1.2. Ферменты 57

2.1.3. Бактериальные штаммы 57

2.1.4. Питательные среды 57

2.1.5. Составы растворов 58

2.1.6. Синтетические олигонуклеотиды 59

2.1.7. Приборы 59

2.2. Методы 60

2.2.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона, катализируемой ОРН 60

2.2.2. Определение рН оптимума действия фермента 60

2.2.3. Исследование термостабильности 60

2.2.4. Приготовление компетентных клеток Е. coli 61

2.2.5. Трансформация компетентных клеток Е. coli 61

2.2.6. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli 61

2.2.7. Рестрикция ДНК и вьщеления фрагментов электрофорезом в агарозном геле 62

2.2.8. Цитирование фрагментов ДНК 62

2.2.9. Конструирование плазмид pTES-His6-deGFP4-(RA)5-OPH и pTES-His6-deGFP4-(AS)5-OPH 63

2.2.10. Определение уровня экспрессии генно-инженерных конструкций pTES-His6-deGFP4-(RA)5-OPH и pTES-His6-deGFP4-(AS)5-OPH и органофосфатгидролазной активности гибридных белков. Изучение кинетики роста клеток Е. coli DH5ct 64

2.2.11. Определение растворимости белка 64

2.2.12. Выделение и очистка полигистидинсодержащих белков с использованием металл-хелатирующих носителей 65

2.2.13. Подготовкакрио-ПААГ носителей 66

2.2.14. Очистка белка His6-deGFP4-(AS)5-OPH 66

2.2.15. Электрофоретический анализ белков в полиакриламидном геле (ДСН-

электрофорез) 67

2.2.16. Исследование флуоресцентных свойств гибридных белков 68

2.2.17. Компьютерное моделирование 68

2.2.18. Наработка препарата фермента Hisg-OPH для его применения в экспериментах прикладного характера 69

2.2.19. Приготовление фильтрующесорбирующего самодегазирующегося материала 70

2.2.20. Дезактивация РМ, полученных в результате химического гидролиза вещества типа Vx с применением рецептуры РД-ГД с использованием препарата фермента Hise-OPH 71

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 72

3.1. Создание гибридных белков, имеющих в своем составе флуоресцентный белок и фермент ОРН 72

3.1.1. Выбор межмолекулярных спейсеров 72

3.1.2. Создание генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4-(AS)5-OPH 73

3.1.3. Экспрессия полученных генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез гибридных белков His6-deGFP4-(RA)5-OPH и His6-deGFP4-(AS)5-OPH 75

3.1.4. Выделение и очистка новых гибридных белков 84

3.1.5. Физико-химические и каталитические характеристики генетически- модифицированных аналогов ОРН 88

3.1.6. Исследования структуры ОРН и полученных гибридных белков методами молекулярного моделирования 89

3.1.6.1. Моделирование структуры димера ОРН 89

3.1.6.2. Моделирование структуры мономера ОРН 95

3.1.7. Исследование термостабильности белка His6-deGFP4-(RA)5-OPH 100

3.1.8. Исследование флуоресцентных свойств полученных гибридных белков 103

3.2. Рефолдинг гексагистидинсодержащей органофосфатгидролазы 109

3.2.1. Зависимость эффективности солюбилизации ТВ от условий проведения

процесса ПО

3.2.2. Проведение рефолдинга Hise-OPH на металл-хелатирующем носителе 112

3.2.3. Активация фермента после рефолдинга 114

3.3. Оптимизация условий культивирования клеток Е. coli SG13009[pREP4],

трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, для увеличения

выхода растворимой формы фермента Hise-OPH 116

3.3.1. Влияние времени введения индуктора в среду культивирования клеток Я coli

SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-Hise-OPH, на их удельную органофосфатгидролазную активность 116

3.3.2. Влияние температуры культивирования на выход удельной

органофосфатгидролазной активности в клетках Е. coli SG13009[pREP4],

трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-His6-OPH 118

3.3.3. Культивирование клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-ffise-OPH, в периодическом режиме с внесением подпиток 121

3.3.4. Влияние перфторуглеводородов на выход активной биомассы клеток Е. coli SG13009[pREP4], трансформированных генно-инженерной конструкцией pTES-His6-OPH 124

3.4. Применение ферментного препарата 125

3.4.1. Исследование процесса разрушения клеток Е. coli SG13009[pREP4] -продуцентов His6-OPH ультразвуком 125

3.4.2. Длительное хранение ферментного препарата Hise-OPH в различных условиях. 127

3.4.3. Фильтрующесорбирующий самодегазирующийся материал, содержащий Hise-OPH, для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС 130

3.4.3.1. Разработка самодегазирующегося материала для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС 130

3.4.3.2. Испытание самодегазирующегося материала для использования в индивидуальных средствах химзащиты от воздействия ФОС 133

3.4.4. Детоксикация реакционных масс, полученных в результате химического

гидролиза ФОВ 135

ВЫВОДЫ 141

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143

• Структура активного центра и центра связывания субстрата ОРН, а также механизм действия фермента
• Реактивы
• Создание гибридных белков, имеющих в своем составе флуоресцентный белок и фермент ОРН

Введение к работе

На современном этапе развития сельского хозяйства интенсивное применение пестицидов, из которых более 40% составляют фосфорорганические соединения (ФОС), широко вошло в практику по всему миру. Несмотря на то, что применение химических средств защиты растений строго регламентируется ГОСТами (в России 4-6 кг/га) [1], низкая водорастворимость и низкая скорость биодеструкции ФОС приводят к их накоплению в почвах и сточных водах [2]. Кроме того, исследования свидетельствуют о наличии ФОС в различной сельскохозяйственной продукции, например в хлопке, собранном с обработанных пестицидами территорий [3], в мясомолочных продуктах питания, овощах, фруктах и продуктах их переработки [4-5].

Показано, что ФОС обладают сильным кумулятивным эффектом и оказывают мутагенное воздействие на млекопитающих. Так, у жителей территорий, прилегающих к сельскохозяйственным зонам, подвергавшимся когда-либо обработке ФОС, возникают хромосомные аберрации лимфоцитов [6].

Чрезвычайно высокую опасность для окружающей среды представляют складированные некондиционные пестициды. К настоящему времени в России накопилось несколько тысяч тонн таких веществ, причем некоторые места их хранения находятся в аварийном состоянии [7].

Помимо пестицидов к ФОС относятся и высокотоксичные агенты нервно-паралитического действия, фосфорорганические отравляющие вещества (ФОБ) - зарин, зоман, Vx, суммарные запасы которых на территории Российской Федерации, составляют 32,3 тыс. т [8].

Согласно Международной конвенции об уничтожении химического оружия запасы данных веществ должны быть полностью уничтожены к 2012 г. [9-10].

Согласно принятым в РФ методам уничтожения ФОБ [11], остаточные концентрации ФОБ в составе реакционных масс достигают 0,1%, кроме того, продукты разложения ОБ также являются токсичными для человека [12]. Важной составной частью процесса уничтожения химического оружия является обеспечение безопасности персонала, занятого в данном процессе, что предполагает использование средств защиты на объекте уничтожения ФОС [8].

В связи с этим поиск эффективных путей деградации ФОС, исключающих проведение процесса в «жестких» условиях (высокая температура, повышенное давление, сильные окислители), становится чрезвычайно актуальной проблемой. Ее решением может стать разложение ФОС с помощью биологических катализаторов.

Применение биокатализаторов, а именно, ферментов, предполагает использование неагрессивных сред для проведения гидролиза и использование температур в диапазоне 25-37С, что значительно расширяет спектр возможностей данного метода.

Ключевым ферментом в процессе биодеструкции ФОС является органофосфатгидролаза (ОРН, ЕС 3.1.8.1, арилдиалкилфосфатаза), катализирующая гидролиз эфирной связи в триэфирах фосфорной кислоты [2]. Фермент обладает широкой субстратной специфичностью и высокими каталитическими константами и может быть использован для разработки новых препаратов, непосредственно готовых к применению. С помощью сайт-направленного мутагенеза ОРН была изучена структура активного центра фермента, изменена его субстратная специфичность и увеличено сродство к соединениям, представляющим собой ФОВ [13-14].

Препараты, созданные на основе ОРН, могут быть предназначены для удаления и последующей детоксикации остаточных количеств пестицидов с различных поверхностей, например, сельскохозяйственного и садового оборудования и инвентаря, а также для применения в качестве эффективных средств индивидуальной защиты. Кроме того, данный фермент может быть использован в составе препаратов, применяющихся для дегазации различных поверхностей, подвергшихся заражению ФОС [15].

Возможность широкого применения фермента ОРН на практике стимулирует исследования, направленные на создание высокоэффективных систем для его синтеза в рекомбинантных клетках, упрощение процедуры его выделения и очистки. На Химическом факультете МГУ имени М. В. Ломоносова была создана новая высокоэффективная система для синтеза нативного фермента в клетках Е. coli [16], изучены свойства полученной рекомбинантной ОРН. Также были созданы генетические конструкции, кодирующие синтез рекомбинантных ферментов, содержащих гексагистидиновые последовательности на N-конце (Hise-OPH) [17] и С-конце молекулы ОРН [18]. Введение аффинной последовательности в структуру белка было обусловлено тем, что очистка и выделение такого фермента существенно проще в технологическом плане [19]. Наличие таких последовательностей на N- или С-конце молекулы белка позволяет проводить его выделение и очистку с использованием аффинных хроматографических носителей. Кроме того, оказалось, что введение последовательности из шести остатков гистидина на N-конец молекулы белка влияет на свойства фермента [17-18]. Для фермента Hise-OPH были характерны улучшенные константы эффективности действия по ряду субстратов по сравнению с ОРН [17]. Например, константа эффективности гидролиза вещества Vx ферментом Hise-OPH оказалась в 2 раза выше, чем

данная величина, характерная для ОРН, а константа эффективности гидролиза зарина — практически в 10 раз [20].

Данный факт делает масштабное использование фермента Hise-OPH для гидролиза ФОВ очень привлекательным. Однако, исследования синтеза His6-OPH в клетках Е. coli показали, что до 50% белка образуется в нерастворимой неактивной форме, в виде телец включения (ТВ), в результате чего его выход оказался сниженным по сравнению с ферментом ОРН более, чем в 2 раза [20].

Для увеличения выхода растворимой активной формы белка могут быть использованы различные методы. Во-первых, использование гибридного партнера, белка, связанного с целевым белком спейсером из нескольких аминокислот. Гибридный партнер синтезируется раньше целевого белка, проходит процедуру фолдинга и удерживает целевой продукт в растворенном состоянии. Кроме того, в данном случае работает принцип ингибирования процесса совместной агрегации белков [21-22]. Во-вторых, применение процедуры рефолдинга активного фермента из ТВ совместно с параллельным выделением активной растворимой формы белка из клеток может существенно увеличить суммарный выход целевого продукта из биомассы клеток. Следует отметить, что ранее рефолдинг белков Hise-OPH и ОРН никем не проводился. В-третьих, применение биотехнологического подхода, оптимизация условий культивирования штамма-продуцента может привести к снижению агрегации белка внутри клетки и увеличению выхода растворимой формы фермента. Кроме того, культивирование рекомбинантных микроорганизмов до высокой плотности биомассы позволит снизить затраты, связанные с обработкой клеток, полученных в процессе ферментации.

Целью данной работы являлось получение фермента Hise-OPH в растворимой активной форме с использованием различных подходов: генно-инженерного (создание гибридных белков), биохимического (проведение рефолдинга из телец включения) и биотехнологического (оптимизация условий культивирования штамма-продуцента Hise-ОРН).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Фермент органофосфатгидролаза

Арилдиалкилфосфатаза (Е.С.З.1.8.1.), более известная как фосфотриэстераза (РТЕ) или органофосфатгидролаза (ОРН), на сегодняшний день является лучше всего охарактеризованным бактериальным ферментом, осуществляющим эффективный катализ реакции гидролиза ФОС [23]. ОРН проявляет каталитическую активность по отношению к довольно широкому спектру ФОС (табл. 1). Впервые ОРН была выделена из Pseudomonas putida MG. Фермент представляет собой димер с молекулярной массой 72 кДа, состоящий из двух одинаковых субъединиц, содержащих по 336 аминокислотных остатков [24-25], и катализирует реакцию, принципиальная схема которой приведена на рис. 1.

Таблица 1. Структуры наиболее широко известных ФОС - пестицидов и боевых отравляющих веществ [2].

_{S x}

RO^II Фермент, H₂0 'RO^ II

"^TP Z"'R *- ^p О" + "'RZ

"RO _{x = os} "RO-^

Z = 0, S и F, когда '"R отсутствует

Рис. 1. Принципиальная схема реакции, катализируемой ОРН [23].

1.1.1. Структура активного центра и центра связывания субстрата ОРН, а также механизм действия фермента

Исследования молекулы ОРН методом рентгено-структурного анализа (кристаллы фермента были получены при рН 9,0) [26-29] показали, что четыре остатка гистидина (Hisss, His57, НІБгої и His23o)> а также остаток аспарагиновой кислоты Asp3oi, являются лигандами ионов металла в активном центре (рис. 2). Два иона металла координированы карбамилированным остатком лизина Lysi69, который образуется в присутствии высоких (более 40 мМ) концентраций бикарбоната в растворе, длительность данного процесса составляет более 100 мин. [30]. Методом ¹³С-ЯМР-спектроскопии было показано, что в образовании карбамилированного остатка Lysi69 может принимать участие диоксид углерода [31].

NH

His₂0l

АфзОІ

^'3.зА

HiS57

-.-"2.7Д

^ч^.зА

/ HIS230

NH-/

V2.1A J1.7A \ 2.7А .

_4.3

^4

Ч\л2к

²⁵V іза ^N

I Lys₁₆₉

2+

Рис. 2. Строение активного центра ОРН, образованного при участии ионов Cd

[26].

Вторым мостиковым лигандом между ионами металла служит молекула воды или гидроксид-ион. Данные рентгено-структурного анализа не позволяют однозначно определить форму мостикового лиганда в активном центре ОРН: молекула воды или гидроксид-ион. Определение плотности заряда в данной области экспериментальными методами является сложным [32]. Однако, исследования активного центра фермента, образованного различными ионами металлов, соединенных мостиковыми лигандами водой или гидроксид-ионом, теоретическими методами молекулярного моделирования и кватновой механики позволили более точно описать строение активного центра ОРН [32-39].

Методами квантовой механики и молекулярного моделирования было показано, что конфигурация активного центра фермента, образованного при участии гидроксид-иона в качестве мостикового лиганда, наиболее точно соответствует данным, полученным в результате рентгено-структурного анализа [33]. Очевидно, что форма данного лиганда зависит от рН среды [40], поэтому нельзя исключать возможности протонирования мостикового гидроксид-иона с образованием молекулы воды.

Предположения о возможных точках присоединения протона в активном центре ОРН, образованном ионами Мп²⁺, при изменении рН были сделаны при изучении спектров парамагнитного резонанса (ЭПР) фермента [39]. Показано, что протон может присоединяться к мостиковому гидр оксид-иону и кислороду остатка Asp3oi. Кроме того, было показано, что снижение активности фермента при значениях рН ниже 7,3±0,1 связано с присоединением протона к мостиковому гидроксид-иону с образованием воды.

Исследования каталитических характеристик ОРН, активный центр которой был образован ионами Со²⁺, показали, что при снижении рН раствора от 8,5 до 6,5 k_cat фермента снижается практически в 3 раза (от 2200 до 660 с"¹) [41].

Исследуя возможность протонирования активного центра ОРН, авторы [32] моделировали присоединение протона к мостиковому гидроксид-иону или аминокислотному остатку Asp3oi. Было показано, что структура активного центра

фермента, образованная ионами Zn и молекулой воды, в результате оптимизации с помощью квантово-химических методов переходит в структуру, образованную протонированным остатком Аэрзоь При использовании в качестве исходной структуры комплекс ионов Cd²⁺ с мостиковым гидроксид-ионом и протонированным остатком Asp3oi было показано, что оптимизированный таким образом активный центр фермента, находится в строгом соответствии с данными, полученными в результате проведения рентгено-структурного анализа.

Принимая во внимание тот факт, что кристаллы ОРН для рентгено-структурного анализа были получены при рН 9,0 [26-29], а также то, что рК_а для реакции Cd²⁺-H₂0 «-> СсЮЬҐ" составляет 7,6 [42], можно предположить, что в данном случае мостиковьтм лигандом являлся гидроксид-ион.

Следует отметить, что при формировании активного центра фермента происходит перераспределение электронной плотности между ионом металла и лигандами, в результате чего могут изменяться эффективные заряды элементов, участников процесса комплексообразования. При варьировании эффективного заряда иона Zn(II) в составе активного центра фермента ОРН методами квантовой механики и молекулярной динамики было показано, конфигурация активного центра фермента наиболее точно соответствует экспериментальным данным при эффективном заряде на ионах металла +1,5 [38].

В составе активного центра ОРН могут находиться различные ионы металлов. Роль ионов металла, находящихся в а - и р - положениях, в механизме гидролиза ФОС различна. Согласно современному представлению о механизме действия фермента, существует взаимодействие обоих ионов металла друг с другом в каталитическом акте [43-46].

В реакции гидролиза ФОС а-ион участвует в процессе активации молекулы воды, необходимой для осуществления нуклеофильной атаки фосфорного центра субстрата, второй отвечает за поляризацию связи Р=0 в субстрате при образовании фермент-субстратного комплекса. Сравнения ЭПР-спектров кристаллов ОРН, кристаллов комплексов ОРН с ингибиторами (диизопропил-метил-фосфонатом и триэтил-фосфатом), а также кристаллов комплексов ОРН с продуктом гидролиза ФОС (диэтил-фосфатом), все кристаллы получены при рН 8,0, подтвердили данное предположение [47].

Важные особенности механизма протекания процесса гидролиза параоксона и зарина, катализируемого ферментом ОРН, были выявлены с помощью молекулярного моделирования соответствующих фермент-субстратных комплексов [36]. Показано, что на начальном этапе реакции образуется прочная координационная связь между кислородом Р=0 субстрата и ионом Znp²⁺ активного центра фермента. Результаты были подтверждены рентгено-структурными данными, полученными для комплексов фермента с негидролизуемыми аналогами субстратов [29, 48], а также квантово-химическими исследованиями механизма реакции гидролиза параоксона [37] и других субстратов [49]. Кроме того, показано, что за ориентацию субстрата отвечают гидрофобные карманы, образованные аминокислотными остатками, находящимися в непосредственной близости

от активного центра фермента. Сделано предположение, что гидрофобный остаток Тгрзо9 предназначен для ограничения доступа молекул растворителя к активному центру.

Установлено, что реакция гидролиза ФОС, катализируемая ОРН, протекает по Sn2-механизму с инверсией конфигурации атома фосфора [37, 44, 50].

Схема механизма гидролиза параоксона ферментом ОРН [2], модифицированная согласно современным литературным данным, представлена на рис. 3.

.Asp301__H._s55

Н.Й7 Л 9^Г ,^NH

\\ vi _

-N...

OH"

NH-

ysl69 <Ч '.Л'Лу ₇

н₂о--Р<*Р H._N/ ^Bis23

о-

_{_0 н;0}

/~

Lysl

His201

+ H₂0

(EtO)₂P '

+ -0(C_f>H₄)N0₂

_]

Рис. 3. Модель механизма действия фермента ОРИ.

Помимо функциональных групп фермента, принимающих непосредственное участие в катализе, в структуре белковой глобулы присутствуют гидрофобные участки, влияющие на связывание субстрата и определяющие, таким образом, специфичность фермента. На основании рентгено-структурных исследований кристалла фермент-субстратного комплекса ОРН с негидролизуемым аналогом параоксона диэтил-4-метилфелнилфосфонатом [26] была построена модель связывающего субстрат домена ОРН [13, 51]. Уходящая группа негидролизуемого аналога параоксона располагается в полости, образуемой остатками His257» Leii27i, РЬезоб и Met3i7 (карман К1) (рис. 4). Одна из этоксигрупп взаимодействует с группой, образованной Тгрш, Пеюб, Ьеизоз, РЬезоб, Hiss7, Gly6o (карман К2), другая - с областью, содержащей Тгрш, РЬеш, Leu27i, РЬезоб и Тугзо9 (карман КЗ). Однако, для реализации S^2 механизма в активном центре фермента [44, 50],

субстрат должен располагаться таким образом, чтобы уходящая группа находилась с

противоположной стороны плоскости, образованной другими тремя атомами, связанными с фосфорным центром [53].

Рис. 4. Схема связывающего домена ОРН. Kl, К2 и КЗ — гидрофобные карманы, образованные следующими аминокислотными остатками: Kl - His257, Leii27i, РЬезоб и ~Met₃n; К2 - Тгрш, Пеюб, Ьеизоз, РЬезоб, His₅7, Gly₆o; КЗ - Тгрш, Phei₃2, Leu27i, РЬезоб и Тугзоэ. 1,2- заместители у фосфорного центра ('R и "R, согласно рис. 1), 3 - уходящая группа ('"R на рис. 1).

Анализ комплексов ОРН с параоксоном и зарином (S_p-) был сделан методами квантовой механики и молекулярного моделирования [36]. Были рассмотрены различные варианты расположений субстратов в активном центре фермента, и предложена наиболее вероятная модель образования фермент-субстратного комплекса (рис. 4). Показано, что К1 - достаточно эластичный карман и может принимать объемный, например, п-нитрофенильный ион, или малый (этил) заместитель атома фосфора субстрата. К2 -наиболее конформационно стабильный карман, который, вероятно, отвечает за стереоселективность. КЗ - наиболее эластичный карман, способный разместить объемную группу. Результаты экспериментов свидетельствуют о том, что уходящая группа координируется именно в кармане КЗ. Кроме того, было подтверждено предположение о том, что субстрат диффундирует к связывающему домену ОРН через карман КЗ. В отсутствии субстрата канал кармана КЗ открывается до 18А в диаметре. Степень

раскрытия кармана КЗ, а также К2, зависит от субстрата или, более точно, от заместителя у фосфорного центра субстрата, которые координируются в КЗ и К2.

Кинетические исследования действия ОРН показали, что процесс диссоциации продуктов реакции гидролиза и фермента является скорость-лимитирующей стадией гидролиза ФОС [54]. Данный процесс может зависеть от конформационных изменений в структуре фермента и скорости диффузии продуктов в раствор. Показано, что фенильный остаток Рдезоб исполняет роль «створки», перекрывающей доступ веществ в активный центр ОРН, кроме того, гидроксильная группа аминокислоты РЬезоб образует водородную связь с N0₂-rpynnofi параоксона и продукта его гидролиза и-нитрофенола [36]. Образование и разрыв данной связи при конформационных изменениях в структуре фермента может лимитировать процесс гидролиза ФОС. Данное предположение косвенно подтверждается исследованиями гидролиза ФОС с различными уходящими группами [54].

В ряде работ [30, 55-56] было детально исследовано влияние ионов различных металлов на каталитическую активность ОРН и показано, что фермент, активный центр которого образован с участием ионов Zn²", Со²", Cd²", Мп²⁺ или Ni²" является; каталитически активным. В табл. 2 приведены значения k_cat и К_т для фермента, содержащего катионы различных металлов в активном центре, определенные для модельного субстрата ОРН - параоксона (диэтил-4-нитрофенилфосфата), из которых следует, что Со²"-содержащий фермент проявляет наибольшую каталитическую активность по отношению к триэфирам ортофосфорной кислоты.

Таблица 2. Кинетические параметры реакции гидролиза параоксона, катализируемой органофосфатгидролазой, содержащей различные ионы металлов в активном центре [55]. Условия: 25С, 150 мМ CHES-буфер, рН 9,0, фермент выделен из клеток Е. coli PJK33.

Исследование субстратной специфичности ОРН [13, 24-25] позволило установить, что фермент в разной степени способен катализировать гидролиз Р-О, P-F и P-S связей в

триэфирах ортофосфорной и фосфоновой кислот. В табл. 3 приведены кинетические параметры реакций гидролиза различных ФОС, катализируемых ОРН. Видно, что наименьшую специфичность ОРН проявляет по отношению к P-S-связи.

Таблица 3. Кинетические параметры реакций гидролиза фосфорорганических пестицидов и боевых отравляющих веществ, катализируемых органофосфатгидролазой. Условия: 22С, 50мМ CHES-буфер, рН 9,1, Со²⁺-содержащий фермент выделен из клеток Е. coli DH5a [23].

Была исследована стереоспецифичность ОРН по отношению к серии производных параоксона, содержащих различные комбинации заместителей [52], а также зарина и зомана [57]. Исследование закономерностей гидролиза такого рода соединений, по-видимому, было обусловлено тем, что тиоловые эфиры производных фосфоновых кислот, к которым относятся Vx, зарин и зоман, содержат оптически активный фосфорный центр. Индивидуальные изомеры этих соединений характеризуются различным ингибирующим воздействием на ацетилхолинэ стер азу (AChE). Так, например, все четыре стереоизомера зомана являются потенциальными ингибиторами, однако результаты исследования ингибирования AChE свидетельствуют, что (Бр)-энантиомер на 2-4 порядка (в зависимости от источника выделения AChE) быстрее инактивирует фермент, чем (Rp)-энантиомер. Величина k_cat уменьшается для всех замещенных фосфотриэфиров в ряду Me>Et>i-Pr.

Из сопоставления полученных данных по гидролизу ФОС органофосфатгидролазой

Следует, ЧТО ВеЛИЧИНЫ Kcat И Ксаг^-т

для <5р(-)-энантиомеров, содержащих объемные

заместители, превышают аналогичные величины для /?р(+)-изомеров, что свидетельствует о более предпочтительной ориентации іУ-изомера в активном центре для последующей нуклеофильной атаки [52].

1.1.2. Пространственная структура ОРН

Согласно литературным данным, большое число белков состоит из 2-х субъединиц (~50% всех олигомерных белков), из них ~80% - гомодимеры [58], к таким белкам относится и ОРН. Исследования гомодимерных белков показали, что в формировании комплексов участвуют идентичные области поверхности белковой глобулы, исключающие неспецифическое взаимодействие с другими белками.

Площадь поверхности контакта для разных белков составляет приблизительно 6 -30% от всей поверхности мономера, и может колебаться от 550 до 4900 А² [59]. Обычно область контакта представляет собой небольшие участки вторичных структур, поверхность контакта включает от 1 до 15 таких участков. Гидрофобное взаимодействие часто рассматривается как главная движущая сила стабилизации белок-белкового комплекса. Предложенная оценка гидрофобного взаимодействия колеблется от 25 до 50 ккал/моль/А².

Исследования структуры ОРН методами рентгено-структурного анализа [27] показали, что площадь поверхности белка, скрытая при образовании димера, составляет 3200 А (11% от общей площади поверхности). Показано, что в образовании димера участвуют четыре остатка ароматических аминокислот (Phees, Тгрбэ, Phe72 и РЬв7з): Показано, что ароматическое кольцо Phees взаимодействует с Metns и РИецм второй субъединицы, а Тгрвэ образует связи с РЬемэ соседней молекулы. Также в образовании димера участвуют многочисленные электростатические взаимодействия. Структура ОРН, полученная по данным рентгеноструктурного анализа, приведена на рис 5.

При исследовании денатурации димерных белков были выявлены различия в механизмах протекания процесса для разных белков [58, 60-63]. Для димерных белков было выделено три механизма денатурации (рис. 6) [58, 64]. Показано, что по 3-му механизму, наиболее сложному, процесс денатурации протекает для 13% белков, по 2-му - 26%, а 1-й механизм реализуется для 61% димерных белков.

Согласно литературным данным, при денатурации ОРН, активный центр которой образован ионами Zn²⁺, увеличение концентрации денатурирующего агента приводит к образованию димерного интермедиата (уравнение Ш на рис. 6), состоящего из частично денатурированных мономерных субъединиц, которые, при дальнейшем увеличении концентрации денатурирующих веществ, диссоциируют на неактивные мономеры [58,

63]. Энергия AG, рассчитанная для первой стадии процесса, составила 4,3 ккал/моль, а для второй - 40 ккал/моль. Замещение ионов Zn²⁺ на Со²⁺ в активном центре фермента приводит к снижению энергии AG до 25,3 ккал/моль [14], которая, однако, остается на достаточно высоком уровне. Величина энергии диссоциации димера на мономеры для большинства белков составляет 20 - 30 ккал/моль [61]. Например, для люциферазы [65], денатурация которой в мочевине также протекает по механизму III на рис. 6, AG диссоциации димера составляет 19,7 ккал/моль. Энергия димера триптофанового репрессора из Е. coli составляет 24 ккал/моль [66]. Высокое значение энергии гомодимера ОРН означает, что поверхность соприкосновения, скрытая между субъединицами белка, играет значительную роль в стабилизации фермента.

Рис. 5. Структура димера органофосфатгидролазы с отмеченными Ы-(синий цвет) и (.'-(красный цвет) концами.

Многочисленные литературные данные свидетельствуют о структурных изменениях, протекающих в молекулах белков при формировании белковых комплексов или их диссоциации. Такие изменения называют эффектом «индуцированного соответствия» [59]. Процесс может быть описан уравнением III, представленным на рис.6. Показано, что в процессе формирования комплекса, белки взаимно «стимулируют» изменения своих пространственных структур, необходимые для оптимального взаимодействия. Например, уменьшение локальной гибкости было обнаружено у

шаперона српбО из Е. coli при образовании комплекса с частично свернутым белком [67]. Белок-белковое взаимодействие может «стимулировать» изменение в положении аминокислотных остатков боковых цепей; движение главной цепи (особенно если это петля); движение доменов [59].

(I) N₂ &2U

(П) N₂&2Ic?2U

(Ш) N₂ <=>I₂ <=>2U

Рис. 6. Схема денатурации гомодимерных белков. N2 - активный димер; І2 -частично денатурированный димер; U - полностью денатурированный мономерный полипептид; I — частично денатурированный мономерный полипептид.

Таким образом, очевидно, что в результате процесса димеризации ОРН образуется структура с повышенной стабильностью (AG = 40 ккал/моль), а ее диссоциация на мономерные субъединицы может приводить к значительным конформационным изменениям в молекуле фермента.

Были проведены исследования стабильности фермента ОРН, активный центр которого был образован при участии различных ионов металла, и его полигистидин-содержащих производных при различных температурах с использованием очищенных ферментов [68-70] и клеточного дезинтеграта [71].

Было показано, что наиболее стабильным ферментом является нативная ОРН, активный центр которой содержит ионы Zn²⁺ [68]. Кроме того, стабильность фермента зависит от рН раствора, в котором проводится термоинактивация. На рис. 7а представлена зависимость термостабильности ОРН от рН.

Введение полигистидиновых последовательностей на N- конец молекулы ОРН привело к изменению характера зависимости стабильности фермента ОРН от температуры [70]. Показано, что увеличение длины полигистидинового тага приводит к снижению термостабильности фермента, активный центр которого образован ионами Со²⁺ (рис. 76).

Исследования термоинактивации отдельных димерных белков показали, что, схема протекания процесса денатурации димерного белка в присутствии денатурирующих агентов [65] не обязательно соответствует схеме температурной инактивации того лее димерного белка [72].

О,

(2

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

Температура, С

Рис. 7. а - Зависимость термостабильности ОРН от рН раствора. Активный центр

.2+

2+

,2+

фермента образован ионами Zn^z+ (A), Co^z+ () или С<Г () [68]. б - Зависимость относительной активности ОРН ( ^А), His6-OPH () и Hisi2-OPH (О) от температуры [72].

1.2. Создание гибридных белков

В настоящее время на практике широко применяется генетическая модификация белков низкомолекулярными полипептидными последовательностями, называемыми тагами, а также полипептидами, образующими полноценные функциональные белки. Введение тагов на N- или С- конец молекулы белка, в основном, связано с необходимостью упрощения процедур выделения и очистки белков, а также возможностью координационной иммобилизации данных белков.

В ряде исследований было показано, что локализация в молекуле белка и аминокислотный состав генетически введенной дополнительной последовательности оказывает влияние на третичную структуру и биологическую активность гибридного белка [20, 73]. Кроме того, оказалось, что введение гибридного партнера на N- или С-конец молекулы белка оказывает влияние на процесс формирования активной формы белка в клетке, часто увеличивает выход растворимой формы целевого белка.

1.2.1. Гибридные партнеры, увеличивающие выход растворимой формы целевого белка в клетках

Использование в качестве гибридного партнера мальтозо-связывающего домена (МСД, 40 кДа) привело к увеличению выхода в растворимой форме шести различных белков с массами 14 - 29 кДа (до 90%) при получении их с использованием клеток Е. coli BL21 (DE3) при 37С и 1 мМ индуктора синтеза белка изопропил-p-D-тиогалактопиранозида (ИПТГ) [74]. Сравнение МСД, выделенных из различных микроорганизмов [75], показало, что при синтезе полученных гибридных белков в клетках Е. coli при 37С использование любого варианта МСД приводит к увеличению выхода целевых белков в растворимой форме на 30 - 80%. Однако, показано, что белки МСД с

повышенной термостабильностью более эффективно снижают агрегацию своих партнеров [75]. Введение мутаций, снижающих стабильность МСД, приводят к уменьшению его способности удерживать связанный с ним белок в растворимой форме [76-77]. Длина и состав межмолекулярного спейсера [78], а также выбор N- или С-конца молекулы целевого белка для введения гибридного партнера [74, 77-78] оказывают значительное влияние на способность МСД предотвращать агрегацию своих партнеров. Показано, что увеличение выхода белков в растворимой форме достигается при введении МСД на N-конец молекулы целевого белка, а длина и состав межмолекулярного спейсера является индивидуальным для каждого из белков.

Помимо МСД способность поддерживать целевой белок в растворимой форме в клетках Е. coli проявляют белки тиоредоксин (12 кДа) [74, 79] и глутатион-Б-трансфераза (26 кДа) [74-75], однако в меньшей степени, чем МСД.

В качестве гибридного партнера для повышения выхода растворимой формы тиосульфатсульфотрансферазы (TS) в клетках Е. coli BL21(DE3) использовался FK506 -связывающий белок из клеток Thermococcus sp. KS-1 (TcFKBP18), массой 16 кДа [80]. С-конец TcFKBP18 и N-конец TS были соединены линкером, состоящим из 34 аминокислотных остатков. Экспрессию генно-инженерной конструкции проводили при 37С и 1мМ ИГПТ. Было показано, что 90% гибридного белка было синтезировано в растворимой форме, а выход тандема от общего количества растворимых белков клетки составил 28%.

Другой белок DsbA (катализирует образование дисульфидных связей в периплазме), сшитый с С-концом молекулы проинсулина спейсером из 6 аминокислотных остатков (-GHy₅-Arg-), был синтезирован с использованием клеток Е. coli SF131 при 25С и 1 мМ ИГПТ [81]. Было показано, что выход активной растворимой формы проинсулина вырос в 1000 раз по сравнению с выходом индивидуального белка.

Таким образом, различные белки способны повышать выход растворимой формы партнера в составе гибридного белка. Часто для создания гибридных продуктов в качестве партнеров выбирают белки, обладающие полезными свойствами. Например, использование зеленого флуоресцентного белка (GFP) или его мутантных форм позволяет помимо увеличения выхода растворимой формы целевого белка визуализировать его присутствие в клетке [82].

1.2.2. Флуоресцентные белки

На данный момент получены искуственно или выделены из природных источников

многочисленные флуоресцентные белки, гомологичные GFP, такие как, например, Blue

FP, Pink FP, Purple FP, Red FP, Yellow FP, Cyan FP и другие. Показано, что все эти белки

имеют много общего и являются эволюционно близкими, их объединяют в семейство GFP- подобных белков [83-85]. Генетически модифицированные аналоги GFP обладают массой 25-30 кДа и покрывают область длин волн флуоресценции 442-645 нм [86].

1.2.2.1. Зеленый флуоресцентный белок

Зеленый флуоресцирующий белок (GFP) был открыт в 1961 году при изучении биолюминесценции медузы Aequorea victoria. Ген GFP был выделен и эксперссирован в других организмах. Появление флуоресценции свидетельствовало о том, что ген содержит всю информацию, необходимую для посттрансляционного синтеза хромофора [87].

Процесс посттрансляционного созревания GFP заключается в образовании л-гидроксибензилиденимидазолинона благодаря реакции конденсации между карбоксильным углеродом Ser65 и азотом аминогруппы Gly67 и дегидрирования в присутствии растворенного кислорода метиленового мостика Тугбб (рис. 8) [83].

GFP является компактным глобулярным белком с массой мономера примерно 27 кДа, состоящим из 238 аминокислот. Молекула GFP представляет собой почти. совершенный, компактно упакованный цилиндр диаметром около 24А и высотой 42А. Хромофор GFP находится близко к геометрическому центру цилиндра, приблизительно на середине нерегулярной а-спирали [83]. Необходимым условием флуоресценции я-гидроксибензилиденимидазолинона является наличие окружающей хромофор белковой оболочки (Р-бочонка) [72]. Благодаря уникальной структуре белка его хромофор оказывается совершенно изолированным от окружающего молекулу GFP растворителя, что позволяет избежать доступа внутрь хромофора молекул кислорода и других веществ и предотвращает диссипацию энергии хромофора путем изомеризации связей или за счет колебательных процессов [88]. На флуоресценцию GFP практически не оказывают влияние такие классические тушители, как акриламид, галогены и молекулярный кислород [87].

Флуоресценция GFP зависит от рН раствора [87]. В слабощелочных растворах (рН 8,0) максимум возбуждения для GFP находится при 395 и 498 нм, а максимум флуоресценции в области 510 нм. В обоих случаях в спектрах возбуждения имеется плечо при X — 470 нм. Флуоресценция GFP в кислом растворе (рН 4-6) уменьшается. В диапазоне рН 10,0 - 12,2 интенсивность флуоресценции резко возрастает, при этом наблюдается большой сдвиг спектра поглощения и возбуждения. Максимум при 395 нм уменьшается по интенсивности, а плечо при 475 нм увеличивается в три раза. Такой рН -зависимый сдвиг спектров поглощения и возбуждения в экстремально щелочном диапазоне рН может быть результатом ионизации Тугбб в хромофоре и/или

депротонирования Argge, который стабилизирует енольную форму имидазолидона хромофора. После кислотной (рН 1) или щелочной (рН 13) денатурации флуоресценция GFP восстанавливается (t\n= 10 с) в слабо щелочном растворе (рН 8) только до 80%. При стоянии на воздухе денатурированный белок медленно окисляется, после чего восстановления флуоресценции не происходит.

Туг 66

О Gly 67

_и

Туг 66

₀ Gly 67

-Н*

Туг 66

О Gly 67

Ser65 NH ^он

Рис. 8. Предполагаемый механизм образования хромофора GFP [87].

Несмотря на то, что GFP дикого типа и его аналоги имели изменения флуоресценции в зависимости от рН, использование таких белков в качестве маркеров процессов, происходящих с изменением рН, считается проблематичным, так как GFP

имеет практически неизменную флуоресценцию в области рН 5,5 - 10 и долгий отклик на возбуждение флуоресценции.

1.2.2.2. рН-чувствительные генетически модифицированные аналоги GFP

Особый интерес представляют флуоресцентные белки, чувствительные к изменениям рН раствора [85]. Рентгено-структурный анализ кристаллов мутантов GFP S65T, полученных при рН 8,0 и 4,6, показал, что рН - чувствительность GFP и его аналогов определяется протонированием фенольной группы Туг₆б [89], а также изменением структуры белковой глобулы, которая влияет на флуоресценцию GFP и его аналогов [90]. Однако, в широком диапазоне рН (от 5,5 до 10,0) спектр флуоресценции белков меняется незначительно, несмотря на динамичный обмен протонами между хромофором и его окружением [91].

Показано, что лимитирующей стадией протонирования хромофора является процесс переноса протона от растворителя к хромофору [92]. Изучение мутантных форм GFP [83, 93], а также анализ рентгено-структурных данных [89], позволили выявить семь наиболее значимых аминокислотных остатков (GI1194, Arg96, His^s, Неіб7, Th^r203, Ser205, Q11222), оказывающих влияние на свойства флуоресцентного белка [94]. Введение точечных мутаций в непосредственной близости с этими аминокислотными остатками позволило создать несколько вариантов рН-чувствительных белков, названных флюоринами (pHluorm) [94].

Белок Ratiometric pbfluorin (r-pH) содержит мутации S202H, E132D, S147E, N149L, N1641, K166Q, I167V, R168H, L220F. Другой белок Ecliptic pHluorme (е-рН) содержит замены S147D, N149Q, T161I, S202F, Q204T, А206Т [94]. Белки имеют две длины волны возбуждения (X = 410 и 480 нм) при длине волны флуоресценции X = 508 нм. В процессе снижения рН раствора от 7,5 до 5,5 белки обратимо (в разной степени) теряют флуоресценцию (рис. 9). Так r-рН демонстрирует постепенные снижение интенсивности эмиссии при возбуждении X = 410 нм, одновременно с этим флуоресценция, вызванная возбуждением X = 480 нм, пропорционально возрастает. Белок е-рН, напротив, показывает одновременный рост флуоресценции, возбужденной светом с X = 420 и 480 нм, при увеличении рН от 5,5 до 7,5. Отклик белков на изменение рН раствора составлял < 20 мс. Авторы показали возможность синтеза данных белков в клетках Е. coli, а также успешно продемонстрировали возможность их использования в качестве флуоресцентной метки для мембранных белков [94-95].

к флуоресценции, НМ

Рис. 9. Спектр флуоресценции белков: а - GFP дикого типа, б - r-рН, в - е-рН [94].

Другой рН-чувствительный флуоресцентный белок, Superecliptic pHluorine (e-pH_s) [96] отличается от своего предшественника е-рН [94] аминокислотными заменами F64L и S65T, сделанными в области хромофора. Данный белок проявляет свойства, характерные для е-рН, при этом он обладает в ~9 раз более высокой эмиссией флуоресценции, чем его прототип [85, 97]. Данный белок был использован для создания сенсора, визуализирующего синаптическую активность в нервных окончаниях млекопитающих [96-97].

Относительно недавно был создан новый класс рН—чувствительных флуоресцентных белков, обладающих двумя длинами волн возбуждения и эмиссии, полученные белки были названы deGFP [90, 98]. Свойства полученных белков представлены в табл. 4.

При исследовании флуоресцентных свойств белка deGFP4 в зависимости от рН раствора было показано, что при увеличении рН в интервале 6-9 абсорбция при А 400 нм незначительно уменьшается, а при А = 509 нм увеличивается, при этом белок независимо от изменения рН поглощает свет при А = 280 нм (рис. 10). Интенсивность флуоресценции в том же интервале рН также меняется. При возбуждении светом с А 400 нм при рН < 7,0 наблюдается широкий пик флуоресценции в голубой области с максимумом при А = 460 нм. Увеличение рН приводит к смещению А. флуоресценции в зеленую область с максимумом при А. = 515 нм и увеличению интенсивности свечения в 5 раз (рН 9,02).

При изучении эмиссии при А, = 530 нм было показано, что deGFP4 имеет две длины волны возбуждения (А = 400 и 510 нм) и при увеличении рН раствора интенсивность флуоресценции в разной степени увеличивается. Отмечено, что флуоресценция при А = 460 нм имеет те же длины волн возбуждения, однако, при этом зависимость от рН раствора оказывается противоположной.

Таблица 4. Характеристики белков deGFP* [90].

* - коэффициенты молярного поглощения и квантовые выходы были измерены для полос поглощения А (УФ) и Б (видимая) при рН 5,5 - 6 и 9,0.

^аЯ.„оы - положение максимумов в спектре поглощения (нм) для полос А и Б.

^бє_Л и 5б - коэффициенты молярного поглощения при 400 нм (полоса А) и 505 нм (полоса Б), єб был рассчитан из єд и отношения сб /сд

^вОтношение коэффициентов молярного поглощения полосы Б к полосе А, определено экспериментально по производным кривым рН-титрования.

%)мис. — положение максимумов в спектре флуоресценции, соответствующих возбуждению при длине волны максимума поглощения полос А и Б, соответственно.

^ДФ - квантовый выход флуоресценции. Значения приведены для флуоресценции при возбуждении 400 нм (рН 5,5-6,0 (Фдь) и рН 9,0 (Флн)) и для флуоресценции анионного хромофора (рН 9,0) при возбуждении 496 нм (Фб).

^ерКа - кажущаяся центральная точка кривой рН-титрования хромофора; средние значения были определены из независимых титрований двух полос поглощения при 400 и 505 нм и двух полос излучения при 460 и 515 нм. Число в скобках - наблюдаемое стандартное отклонение в последней цифре среднего значения.

^ж - отношение максимальной интенсивности флуоресценции при 460 нм к максимальной интенсивности флуоресценции при 515 нм.

рН - зависимость каждого максимума флуоресценции очень точно описывается теоретической кривой, соответствующей титрованию одной группы:

I(pH) = C + D/(1 + ww^Ka-^pfi)),

где I - сигнал (поглощение или флуоресценция в максимуме), D - динамический диапазон, С - базовая линия.

Пригодность белка deGFP4 в качестве индикатора, применяемого in vivo, для измерения рН в клетках млекопитающих была подтверждена путем транзитной экспрессии в PS120 фибропластах, с использованием конфокальной и двухфотонной микроскопии [90, 99].

440 460 480 S0O 520 540 560 580 600 280 320 360 400 440 480 520
X, НМ X, НМ

Рис. 10. Поглощение (а) и относительная флуоресценция при Явозб. 400 нм (б) и Ао_М. 530 нм (в) белка deGFP4 в зависимости от рН [90].

1.2.3. ОРН в составе гибридных белков

Создание высокоэффективной системы экспрессии гена, кодирующего синтез рекомбинантной ОРН, позволило получать фермент в больших количествах (12 мг с 1 г клеток или ~0,18 г/л) в клетках Е. coli DH5a при 30С и 0,2 мМ ИПТГ [16]. Для выделения и очистки фермента с использованием хроматографических носителей на N- конец молекулы белка была введена гексагистидиновая последовательность (Нівб) [18]. Уровень

синтеза Hise-OPH в клетках Е. coli, снизился по сравнению с уровнем синтеза ОРН, и составил 5,1 мг на 1 г клеток Е. coli SG13009[pREP4] (~80 мг/л) при тех же условиях культивирования (30С и 0,2 мМ ИПТГ). Фермент был успешно выделен с помощью макропористых носителей на основе полиакриламидного криогеля, заряженных ионами Со ⁺ [19]. При этом было показано, что каталитические характеристики модифицированного фермента изменились по сравнению с ОРН [17].

Увеличение длины полигистидиновой последовательности на N-конце белка до 12 остатков гистидина [70] также привело к изменению каталитических характеристик фермента, а также привело к появлению у белка склонности к олигомеризации.

Гибридный белок, содержащий ОРН и целлюлозо-связывающий домен ЦСД-ОРН (ЦСД из клеток Clostridium sp.), был синтезирован в клетках Е. coli BL21(DE3) при 37 или 30С и 1 мМ ИПТГ [100]. Максимальный выход белка (10 мг/л среды культивирования) был достигнут в течение 2-3 ч культивирования при 30С. В данных условиях 60% белка синтезировалось в растворимой форме. Увеличение температуры или времени культивирования приводило к интенсивному образованию ТВ. Анализ каталитических характеристик полученного гибридного фермента показал, что величина К_т по параоксону гибридного белка увеличилась в 2 раза (0,126 мМ) по сравнению с индивидуальным белком, a k_cat увеличилась на 10% (3480 с"¹). Фермент ЦСД-ОРН, иммобилизованный на жестком носителе, катализировал гидролиз параоксона: К_т = 0,220 мМ, k_cat = 2840 с"¹. Полученный гибридный белок был выделен и иммобилизован на твердом носителе из целлюлозного материала и использован для разложения параоксона и кумафоса в течение 2-х месяцев без потери активности [101].

Гибридный белок МСД-ОРН (82 кДа) был синтезирован в клетках Е. coli DH5ct (DE3) при 20С и 0,4 мМ ИПТГ [71]. Максимальный выход активной формы белка составил всего 4 мг/л, так как в данных условиях более 95% белка синтезировалось в неактивной нерастворимой форме. Анализ каталитических характеристик полученного гибридного фермента показал, что К_т по параоксону гибридного белка в растворе по сравнению с нативной ОРН не изменился, a k_cat снизилась почти в 3 раза (780 с"¹).

Для локализации ОРН на поверхности клеточной стенки в клетках Е. coli [102-104], P. putida [103, 105], Maraxella sp. [106] и Synechococcus [107] фермент был модифицирован якорными системами INP (белок, индуцирующий образование микрокристаллов льда) или Lpp-OmpA (белок, обеспечивающий транспорт и локализацию на клеточной стенке растворимых белков в Е. coli), обеспечивающими синтез ОРН в клетке, транспорт гибридного белка из клетки и «заякоривание» его на клеточной стенке. Генетическая модификация ОРН якорной системой INP привела к снижению активности

клеточного лизата более, чем в 50 раз [107], однако, К_т, определенная для рекомбинантных клеток, оказалась ниже в случае белка IMP-OPH более чем в 2 раза. Исследование экспрессии генно-инженерных конструкций, кодирующих синтез белков INP-OPH (85 кДа) и индивидуального фермента ОРН (36 кДа), в клетках Е. coli XL/blue при 30С и 1 мМ ИПТГ не выявили существнных различий в уровнях синтеза белков [108]. Снижение концентрации ИПТГ до 0,05 мМ приводило к увеличению выхода активной формы INT-OPH в 2 раза в клетках Е. coli, по-сравнению с концентрацией индуктора 1 мМ [104]. Кроме того, был осуществлен параллельный синтез и локализация на поверхности клеточной стенки белков IMP-OPH и Lpp-OmpA-ЦСД, что позволило провести иммобилизацию клеток Е. coli на целлюлозный носитель для проведения деградации ФОС [104].

Следует отметить, что прием параллельного синтеза двух белков в рекомбинантных клетках часто способствует увеличению выхода растворимой формы целевого белка. Например, параллельная экспрессия участков генно-инженерной конструкции, кодирующих синтез ОРН и Vitreoscilla гемоглобина [109-110] в клетках Е. coli BL21 и W3110 привела к увеличению органофосфатгидролазной активности клеток в 2 раза. Однако, совместный синтез ОРН и карбоксилэстеразы из Culex pipiens (65 кДа) привел к снижению активности клеток в 2 раза [111].

Другим примером конструирования гибридных белков с ОРН-акивностью является работа, в которой в качестве гибридного партнера использовался эластинподобный полипептид [112]. При этом гидрофобность рекомбинантного белка резко увеличивалась, что расширило возможности создания новых иммобилизованных форм фермента с использованием гидрофобных носителей. У гибридного белка наблюдалось снижение каталитических характеристик на 5-10%, однако, стабильность полученного фермента резко увеличилась.

Была создана генетическая конструкция, кодирующая синтез гибридного белка GFP-OPH, в котором молекулы GFP и ОРН были соединены последовательностью из 5-ти аминокислотных остатков (-(Asp)4-Lys-) [113-114]. На N- конец молекулы гибридного белка была введена гексагистидиновая последовательность для его выделения с помощью координационной иммобилизации на металл-хелатирующих носителях. Было показано, что уровень синтеза гибридного белка в клетках Е. coli BL21 (DE3) при 37С в присутствии 1 мМ ИПТГ оказался ниже выхода нативной ОРН и составил 1,4 мг/л против 11,1 мг/л. Однако, доля растворимой фракции модифицированного фермента оказалась выше, чем для немодифицированной ОРН. Было показано, что простым измерением флуоресценции модифицированной таким образом ОРН можно определить очень малые

количества образовавшейся активной формы ОРН в клетках, а также следить за процессом очистки гибридного белка.

Было показано, что введение в среду культивирования 2 мМ хлорида кобальта в процессе роста клеток приводит так же, как и в случае нативной ОРН, к существенному увеличению активности фермента. В ходе этих исследований впервые было установлено отсутствие линейной зависимости между концентрацией индуктора, введенного в среду, и уровнем синтеза ОРН [115].

С целью увеличения уровня синтеза ОРН был сконструирован гибридный белок, в котором GFP был последовательно соединен с двумя молекулами ОРН: GFP-OPH-OPH [116]. В результате наблюдался более высокий выход ОРН по сравнению с аналогичной конструкцией, кодирующей синтез одной копии фермента в гибридном белке.

Для локализации гибридного белка, состоящего из молекул ОРН и GFP, на поверхности клеточной стенки была разработана система экспрессии, кодирующая синтез белка OPH-(Asp)4-Lys-GFP-AIDA, где AIDA - белок, осуществляющий транспорт и «заякоривание» растворимых белков на клеточной стенке Е. coli [117]. При культивировании клеток Е. coli, трансформированных данной конструкцией, в присутствии 0,5 мМ ИПТГ было показано, что в течение 24 ч накапливается органофосфатгидролазная активность и достигает ~12,5 ед/(г клеток). Параллельно с этим, было отмечено увеличение интенсивности флуоресценции. Следует отметить, что в данной работе авторы использовали порядок расположения гибридных партнеров друг относительно друга, отличный от описанного ранее (С-конец молекулы ОРН был через спейсер соединен с N-концом молекулы GFP). Однако, существенного улучшения выхода гибридного белка отмечено не было.

Была создана еще одна генно-инженерная конструкция, кодирующая синтез гибридного белка, содержащего одновременно, гексагистидиновую последовательность, GFP, последовательность из 5-ти аминокислотных остатков (-(Asp)4-Lys-) и ОРН [118]. Однако, разработчикам не удалось упростить процедуру очистки основного белка и контроль над этим процессом.

Следует отметить крайне низкие уровни экспрессии описанных генно-инженерных конструкций. Данный факт, в первую очередь, вероятно, был связан с экстремальными условиями культивирования рекомбинантных микроорганизмов (37С, 0,5 - 1 мМ ИПТГ). Снижение температуры и концентрации индуктора, несомненно, должно было увеличить выход гибридных белков в растворимой форме, однако, этого сделано не было. Кроме того, низкий уровень выхода белка в целом, в том числе и в растворимой форме, мог быть

связан с недостаточной эффективностью системы экспрессии, разработанной для данных белков.

Тем не менее, бьшо продемонстрировано, что в связке с GFP каталитическая активность ОРН сохраняется. Вместе с тем, бьшо отмечено, что флуоресценция GFP была строго пропорциональна каталитической активности ОРН, что давало разработчикам таких гибридных белков возможность определения очень малых количеств фермента в анализируемых средах.

Использование вместо GFP его рН- чувствительных аналогов (e-pH_s или deGFP) может позволить осуществлять контроль синтеза гибридного белка, а главное оценивать эффективность действия ОРН в реакциях гидролиза ФОС, протекающих с изменением рН среды.

Таким образом, создание новых гибридных белков на основе ОРН и рН-чувствительных аналогов GFP является весьма перспективной областью для исследования, с точки зрения увеличения доли растворимой фракции белка с органофосфатгидролазнои активностью, а также получения целевого белка с новыми полезными свойствами.-

1.3. Рефолдинг белков из телец включения

Синтезированный на стадии трансляции полипептид подвергается фолдингу с образованием функционально активного белка. Согласно современным представлениям образование нативной структуры белковой глобулы протекает по различным механизмам, зависящим от природы самого белка. При этом небольшие, однодоменные белки, у которых гидрофобные остатки находятся в глубине белковой молекулы, сворачиваются в результате одностадийного процесса, без образования интермедиатов, в нативную конформацию менее, чем за 1 с [119], тогда как фолдинг мультидоменных белков обычно протекает с образованием одного или более интермедиатов [120]. Поскольку достижение нативного состояния многими мультидоменными белками сопряжено с преодолением кинетического барьера [121], белки могут оказаться в локальном энергетическом минимуме. Таким образом, процесс фолдинга мультидоменных белков является весьма сложным и сопровождается активными взаимодействиями расплавленной белковой глобулы с внутриклеточными шаперонами, которые стабилизируют растущую полипептидную цепь на рибосоме, поддерживая ее в неагрегированном состоянии [119].

Высокая скорость экспрессии генно-инженерных конструкций в рекомбинантных микроорганизмах; в основном, контролируемая «жесткими» промоторами, приводит к образованию большого количества целевого продукта. В условиях избытка

рекомбинантного белка клеточных ресурсов часто оказывается недостаточно для осуществления правильного фолдинга с образованием активного продукта, в результате чего получаются неправильно или не полностью сфолдированные интермедиаты, склонные к агрегации [122].

Считается, что агрегация белков происходит при «ошибочных» взаимодействиях, возникающих в основном посредством контактов гидрофобных поверхностей полностью или частично развернутых белковых молекул [123]. В клетках у многих неправильно свернутых или несобранных белков на поверхности экспонированы в цитозоль гидрофобные области, которые в нативных белках обращены в глубину молекул, в результате чего в белках возрастает число участков, способных взаимодействовать между собой с образованием агрегатов. Образующиеся структурированные или аморфные агрегаты называются тельцами включения (ТВ) [124]. Они характеризуются низкой растворимостью в воде или детергентах и ненативной вторичной структурой.

Имеются доказательства того, что в системе, содержащей более одного белка, агрегация происходит лишь между идентичными или очень похожими полипептидами, и в результате специфического домен-обменного взаимодействия могут формироваться когезионные (способные к сцеплению) агрегаты [21-22]. В этом случае непохожие, совместно агрегирующие полипептиды не взаимодействуют и скорее ингибируют, а не ускоряют агрегацию [125].

В то же время имеются данные о том, что в состав ТВ помимо основного белка могут входить другие белки, склонные к агрегации, продукты протеолиза, нефункциональные полипептиды [124].

Образование ТВ в клетках бактерий представляет собой обратимый процесс, тесно связанный с механизмами, направленными на преодоление стресса, вызванного изменениями условий культивирования микроорганизмов [119]. В процесс формирования ТВ могут вовлекаться клеточные механизмы, которые действуют в специфических, стрессовых условиях, способствуя временному накоплению неправильно свернутых полипептидов, пока они не подвергнутся рефолдингу или протеолизу. Изменение условий среды культивирования (рН, температуры [126], ионной силы, окислительно-восстановительных свойств [127], введение индуктора [128-129]), а также ингибирование системы деградации белков могут приводить к образованию неправильно сфолдированых интермедиатов. Кроме того, возможность образования нативной структуры из развернутой полипептидной цепи, а также гидрофобность поверхности белковой глобулы играют важную роль в количестве образования ТВ.

Таким образом, образование ТВ является существенным барьером для получения активной формы белка внутри клетки.

Применение процедуры рефолдинга активного фермента из ТВ совместно с выделением активной формы белка из клеток может существенно увеличить выход целевого продукта. К данному моменту времени в биотехнологии процедуру рефолдинга активно используют для получения различных рекомбинантных белков [130].

1.3.1. Общие принципы проведения рефолдинга

Считается, что ренатурация белка in vitro протекает по пути, в основном, повторяющему природный, но в искусственной среде путь может разветвляться, приводя в итоге к неприродному складыванию полипептидных цепей и их агрегации [122]. Правильное протекание процесса зависит от условий среды (внешних факторов), которые не должны препятствовать реализации нативной структуры белка. Состав, температура и рН среды оказывают наиболее сильное влияние на молекулу белка. От этих параметров зависит общий заряд и степень гидратации молекулы, величина и соотношение её заряженных участков, степень их взаимодействия, что и определяет её конформацию.

Так, например, изучение спектров кругового дихроизма денатурированного в 8 М растворе мочевины белка EL-3, снятых при разных значениях рН, показало, что вторичная структура белка наиболее близка к нативной при рН 8,5 [131]. Эффективность рефолдинга, проведенного при данном значении рН оказалась самой высокой и составила 85%.

Поскольку нативная конформация белка является наиболее термодинамически выгодной, то при пониженной температуре образование нативной структуры предпочтительно. При снижении температуры проведения процесса рефолдинга белка EL-3 с 20 до 8С было достигнуто дополнительное увеличение выхода ренатурированного белка [131]. Однако, применение низких температур при проведении процесса значительно увеличивает время протекания процесса формирования структуры белковой глобулы. Считается, что в большинстве случаев оптимальная температура проведения рефолдинга белков составляет 15С[130].

Поскольку в состав ТВ помимо основного белка могут входить другие белки, склонные к агрегации, продукты протеолиза, нефункциональные полипептиды [124], перед проведением денатурации ТВ для проведения рефолдинга необходимо провести тщательную очистку ТВ. Для этих целей часто используют реагент Triton Х-100 в концентрации до 2% [132].

Для солюбилизации ТВ используют денатурирующие агенты мочевину или гуанидиний гидрохлорид [130]. Следует отметить, что сохранение вторичной структуры белка в процессе его денатурации является важным фактором с точки зрения эффективности рефолдинга, так как это связано с функциональной способностью молекулы ренатурировать в правильном направлении [122].

Процесс, собственно, рефолдинга проводят резким или постепенным снижением концентрации хаотропного агента [130,132].

1.3.2. Рефолдинг полигистидинсодержащих белков

Считается, что проведение рефолдинга белков, содержащих полигистидиновые последовательности, имеет ряд существенных преимуществ в техническом плане перед белками, которые не содержат таких последовательностей [133]. Это обусловлено тем, что становится возможным применение металл-хелатирующей хроматографии, в основе проведения которой лежит образование прочного комплекса, образующегося между введенной на один из концов молекулы белка НІБб-последовательностью и ионами металла (чаще всего Ni²⁺ или Со²⁺), которыми заряжен хроматографический носитель, предварительно модифицированный хелатирующими лигандами. Показано, что образование таких металлокомплексов возможно даже в растворах с большими концентрациями таких хаотропных агентов, как мочевина или гуанидиний гидрохлорид [131, 134-137]. В результате молекулы фермента оказываются прочно иммобилизованными на носителе, что позволяет, во-первых, существенно упростить процедуру очистки ТВ от клеточного дебриса, а во-вторых, осуществить распределение молекул белка в объеме носителя и удерживать их на определенном расстоянии друг от друга, и тем самым снизить возможность их агрегации в процессе рефолдинга.

В качестве носителя для металл-хелатирующей хроматографии чаще всего применяется агароза, модифицированная нитрилотриуксусной кислотой и заряженная ионами Ni²⁺ [131, 134-137], а в качестве денатурирующих агентов - мочевина [131, 133-137] и гуанидиний гидрохлорид [136-137]. Оптимальные условия проведения рефолдинга не поддаются строгой систематизации и являются уникальными для каждого конкретного белка.

К настоящему моменту разработаны носители для иммобилизации полигистидинсодержащих белков на основе полиакриламидного криогеля (крио-ПААГ), получаемого при замораживании полимеризующейся системы. Крио-ПААГ модифицируют остатками иминодиуксусной кислоты (IDA) [138-139] и заряжают ионами Со²⁺ (Со²⁺-ША -крио-ПААГ) [19]. Данный носитель обладает существенно большим

размером пор по сравнению с агарозой [138-139], что способствует улучшенному пространственному разделению молекул белка по сравнению с низкопористыми носителями на основе агарозы. В связи с этим применение крио-ПААГ для проведения рефолдинга полигистидинсодержащих белков было бы крайне интересным, но до сих пор не было никем апробировано.

Таким образом, с помощью рефолдинга белка His6-OPH из телец включения с использованием металл-хелатирующих носителей, полученных на основе крио-ПААГ, можно было бы увеличить выход Hise-OPH в растворимой активной форме. Следует отметить, что ранее рефолдинг белков Hise-OPH и ОРН никем не проводился.

1.4. Применение биотехнологических приемов усовершенствования культивирования клеток Е. coli для увеличения выхода растворимой формы рекомбинантных белков

Известно, что культивирование клеток до получения высокой плотности биомассы в среде позволяет достигать высокой продуктивности системы на единицу объема по целевому белку.

Величина максимальной плотности клеточной культуры, которая может быть достигнута в реакторе, бьша оценена различными способами. Согласно расчетам одних исследователей [140], максимально достижимая концентрация клеток составляет 400 г/л. По другим данным максимально достижимая концентрация клеток составляет 160-200 г/л [141]. Известные экспериментальные данные подтверждают последнее значение [141-142]. Поскольку вязкость культуральной жидкости резко возрастает, когда концентрация клеток достигает 200 г/л, а при концентрациях выше 220 г/л культуральная жидкость практически теряет текучесть [142], можно сделать вывод о том, что максимально достижимая плотность клеток К coli действительно составляет 200 г/л.

Для достижения высокой плотности биомассы микроорганизмы можно выращивать в реакторе периодического действия, в реакторе периодического действия с добавлением субстрата или в реакторе непрерывного действия [143].

1.4.1. Культивирование микроорганизмов в периодическом режиме

Периодическое культивирование клеток представляет собой рост биомассы в питательной среде, исходно содержащей в избытке необходимые для роста субстраты, в аэробных условиях при определенной температуре и интенсивности перемешивания.

Рост микроорганизмов в периодической культуре подразделяется на ряд последовательных фаз [143]: лаг-фаза, логарифмическая фаза (или фаза

экспоненциального роста), фаза замедления роста, стационарная фаза и фаза отмирания. В течение некоторого периода, называемого лаг-фазой, микроорганизмы адаптируются к новым условиям, подготавливаются к размножению, их численность при этом не меняется. В ходе такой адаптации может происходить включение ранее не проявившихся путей метаболизма, накопление в клетках микроорганизмов достаточного числа рибосом, способного обеспечить сбалансированный рост в новых условиях. Продолжительность лаг-фазы зависит от фазы роста и концентрации клеток в инокуляте, от времени, в течение которого клетки посевного материала находились, например, в стационарной фазе, и от того, как сильно по составу отличалась среда, в которой росла культура, от новой, свежей питательной среды. Если же посевным материалом служит культура, находящаяся в экспоненциальной фазе роста, то выраженная лаг-фаза может отсутствовать и рост начнется немедленно после инокуляции.

Между лаг- и экспоненциальной фазами роста есть короткий период, называемый фазой ускорения, когда скорость роста клеток увеличивается до достижения постоянной величины.

Во время экспоненциальной фазы роста при достаточном количестве субстратов в питательной среде и в отсутствии соединений, ингибирующих рост клеток, удельная скорость роста (/л) не зависит от концентрации субстратов, является максимальной для всего процесса (/л_тау) и остается постоянной на протяжении всей логарифмической фазы.

Прирост клеточной массы во времени вследствие деления клеток dX/dt равен произведению удельной скоростью роста ju на количество биомассыX:

dX/dt = juX Для условий, в которых удельная скорость роста представляет постоянную величину, прямым интегрированием находится изменение численности популяции во времени, подчиняющееся экспоненциальному закону:

гдеХо - численность популяции к моменту времени t₀.

Очевидно, что по зависимости 1пХ от времени можно определить максимальную скорость роста популяции fi_max.

Иногда вместо удельной скорости роста используют время удвоения, или время генерации td = ln2/fi. Для одноклеточных микроорганизмов величина /w обычно находится в диапазоне от 2,1 до 0,086 ч"¹, что соответствует времени удвоения примерно от 20 минут до 8 часов.

Удельная скорость роста микроорганизмов зависит от концентраций субстратов, необходимых для роста клеток S(n) (г/л или М), констант Кф) (г/л или М), определяющих скорость их усваивания клетками, и максимальной удельной скорости роста /Апах-

ф) = MmaxS(n) / (Кф) + S(n))

Когда субстрат присутствует в избытке (S(n) » Кф)), [л(п) = /^,^ и достигается максимальная скорость роста биомассы в экспоненциальной фазе при соответствующих условиях культивирования. При S(n) < Кф) быстро наступает фаза замедления.

В фазе замедления скорость роста клеток снижается, тогда как в последующей стационарной фазе находится на примерно постоянном уровне. Снижение // обычно связано со снижением концентраций тех или иных субстратов в среде культивирования, однако, возможно и прямое ингибирование роста продуктами метаболизма бактерий. Во время стационарной фазы количество биомассы остается постоянным, однако, метаболизм часто претерпевает кардинальные изменения [143].

В фазе отмирания энергетические запасы клеток оказываются исчерпанными, метаболизм прекращается, и численность популяции снижается.

Для эффективного культивирования состав среды роста клеток должен быть тщательно сформулирован и проверен, так как он оказывает существенное влияние на внутриклеточный метаболизм, синтез белка и рост клеток.

Существует два типа питательных сред: минимальная среда для роста клеток и комплексная (богатая питательная) среда [142]. Минимальная среда, в основном, состоит из минеральных солей, содержащих элементы, необходимые для роста микроорганизмов, и субстратов - источников углерода (глюкоза, глицерин, лактоза и др.) [144-148]. Питательные вещества в комплексной среде, такие как триптон или дрожжевой экстракт, могут отличаться по составу и качеству, что делает ферментацию на этих средах менее воспроизводимой. Однако, комплексная среда состоит из легко усваиваемых компонентов и ее применение необходимо для увеличения выхода целевого продукта [149-152].

Субстраты, включая источники углерода и азота, могут ингибировать рост клеток, если они присутствуют в среде культивирования в концентрациях, выше необходимых [142, 153]. Например, рост клеток Е. coli ингибируется глюкозой в концентрациях более 50 г/л или фосфатами более 10 г/л [140]. Кроме того, простое увеличение концентраций питательных веществ в периодическом культивировании не приводит к достижению плотности культуры выше определенных значений, характерных для исследуемой среды культивирования [142, 153], что ограничивает возможность применения данного метода ферментации для получения культур с высокой плотностью.

1.4.2. Культивирование микроорганизмов в полупериодическом режиме

При культивировании клеток в полупериодическом режиме биомассу растят до истощения запасов питательных веществ, а затем в среду культивирования периодически вносят дополнительные количества субстратов в концентрациях, необходимых микроорганизмам для поддержания внутриклеточного метаболизма в активном состоянии, что приводит к удлинению экспоненциальной и стационарной фаз роста. Однако, поскольку в стационарной фазе роста микроорганизмы часто синтезируют протеолитические ферменты, процесс роста клеток, обычно, останавливают до их перехода в эту фазу роста.

Прямое измерение концентрации субстрата в ходе ферментации часто бывает затруднено, особенно при использовании богатых питательных сред, состоящих из дрожжевого экстракта или тритона, поэтому для определения времени очередного внесения питательных веществ используют показатели, коррелирующие с изменением концентраций питательных веществ, например, рН среды [144-145, 149, 154-157], концентрацию СОг или ( [142, 154, 157-159] в отводимом от реактора воздухе.

Увеличение рН среды культивирования связано с секрецией микроорганизмами ионов аммония, осуществляемое в связи с нарушением внутриклеточного метаболизма из-за истощения запасов углеродного субстрата [155]. Аналогично, резкое возрастание содержания кислорода в отводимом от ферментера воздухе, свидетельствует о насыщении питательной среды кислородом, что, в свою очередь, указывает на нарушения в цепи переноса электронов и снижение потребности клетки в кислороде. Последний факт свидетельствует о недостатке основного углеродного субстрата в среде культивирования [158-159].

С помощью многочисленных экспериментальных данных [142, 153-154, 157] были получены математические зависимости, отражающие связь удельной скорости роста микроорганизмов с концентрацией питательных веществ в среде культивирования. Использование таких зависимостей для расчета скорости внесения дополнительного количества субстратов в среду культивирования позволяет достигать плотности влажной биомассы 70 - 150 г/л [146-147, 150].

Величину рН среды или концентрацию Ог в отводимом из реактора воздухе часто используют для определения начала введения субстрата в среду культивирования, что означает конец периодического режима культивирования и начало полупериодического режима.

Экспоненциальный метод введения питательных веществ, основанный на математических зависимостях, отражающих связь /г с концентрацией питательных

веществ в среде культивирования, является простым и широко описанным в литературе [142, 153-154]. Данный метод использует динамические показатели популяции микроорганизмов (//) и показатели выхода клеток на единицу субстрата (в основном, источника углерода), на основании которых по известным закономерностям вычисляется скорость внесения субстратов в среду культивирования для поддержания ц на заранее определенном уровне:

M_sft) = F(t) S_F(t) = ((л/ Y* + т) X(t) V(t) =(ju/ Y* + m) X(t₀) V(t₀) ^(Ш)

где M_s(t) - массовая скорость внесения источника углерода в момент времени t (г/ч), F(t) - объемная скорость внесения подпитки (л/ч), Sp(t) - концентрация субстрата (источника углерода) в подпитке (г/л), pi — специфическая скорость роста клеток (ч'¹), Yx/s - выход клеток на 1г субстрата (г/г), т - специфический коэффициент (г/г-ч), X(t) -концентрация клеток (г/л), V(t) - объем культуры (л), to - время начала внесения питательного вещества (ч).

В качестве углеродных субстратов наибольшее применение находят соединения, в основном, являющиеся исходными веществами или промежуточными продуктами биохимических процессов в клетке (гликолиз, цикл трикарбоновых кислот и т.п.). В большинстве случаев используют глюкозу [147-152, 159].

С точки зрения метаболизма клетки, глюкоза - наиболее удобный источник углерода и энергии,^ необходимой для жизнедеятельности бактерий, однако, высокая скорость ее утилизации приводит к образованию большого количества побочных продуктов, присутствие которых в среде культивирования, в конечном счете, приводит к ингибированию роста биомассы. Данный факт во многом связан с разной скоростью процессов расхода и синтеза АТФ, сопряженного с переносом электронов на кислород и наличием достаточной концентрации последнего в среде культивирования. Выходом из данной ситуации может служить применение жесткого контроля удельной скорости роста микроорганизмов или использование других субстратов - источников углерода, например, глицерина, сорбитола и др.

Так, для получения полигидроксиалканата клетки Е. coli XL-blue выращивали на среде LB, содержащей 20 г/л глюкозы, в периодическом и полупериодическом режиме [149]. Было показано, что введение дополнительного количества глюкозы в среду культивирования увеличивает выход биомассы в 10 раз. В процессе роста клеток было зафиксировано выделение в среду культивирования ацетата (до 5,5 г/л), что свидетельствовало о недостаточной сбалансированности внутриклеточного метаболизма.

При культивировании клеток Е. coli RV308 (мутант К12) при 2бС на минимальной среде [148] с использованием глюкозы в качестве источника углерода выход биомассы на

33 часу процесса составил 145 г/л. Содержание глюкозы в среде поддерживалось на уровне 1,5 г/л в течение всего процесса.

Культивирование клеток Е. coli W, осуществляющих синтез полигидроксиалканата, проводили в полупериодическом режиме на минеральной среде, содержащей сахарозу в качестве источника углерода [145]. Подпитки вносили по 10, 20 и 40 г при увеличении рН выше значения 6,9, выходы биомассы при этом составляли 114, 105 и 57 г/л, соответственно, через 45 - 50 ч культивирования. Применение математических закономерностей [142, 153-154] для расчета скорости внесения сахарозы в реактор позволило достигнуть колоссального количества биомассы за более короткое время при 37С (ПО г/л за 20 ч при// = 0,2 ч"¹) [146].

Культивирование клеток Е. coli TG1 осуществляли в полупериодическом режиме на минимальной среде [145] при температуре 28С с использованием глюкозы или глицерина в качестве углеродных субстратов [147]. Скорости внесения субстратов рассчитывались математически [142, 146, 153-154] для поддержания //ниже критического значения, при достижении которого начинается интенсивное образование побочных продуктов клеточного метаболизма, в частности, ацетата. Сигналом для начала внесения питательных веществ в реактор являлось резкое увеличение содержания растворенного кислорода в среде культивирования [158-159]. В результате ферментации были достигнуты следующие выходы биомассы: 128 г/л при использовании глюкозы и 148 г/л -глицерина.

Для получения коллагена [150] клетки Е. coli BL 21 культивировали на среде LB с добавлением минеральных солей и глюкозы при 32С до получения биомассы 40 г/л. Скорость введения питательных веществ рассчитывали по известным математическим зависимостям для поддержания [X на уровне 0,1, 0,15, 0,2 и 0,25 ч'¹. После проведения индукции с помощью нагрева реактора до 42С в течение 2 ч,// снижали до 0,05+0,01 ч"¹ и культивировали в течение 6 - 8 ч при 39С. Выход биомассы, независимо от режима культивирования микроорганизмов, составил 69 г/л, однако продуктивность клеток оказалась на разных уровнях: 168,197,181 и 139 мг коллагена / г клеток, соответственно ju до индукции. Кроме того, показано, что при увеличении // от 0,1 до 0,2 ч"¹, концентрация ацетата в среде находится на уровне 1,5 г/л, в то время как увеличение скорости до 0,25 ч"¹ приводит к образованию ацетата 3 г/л. Таким образом, высокие скорости роста микроорганизмов приводят к расходу глюкозы на образование побочных продуктов, в частности, ацетата, а также необходимости обеспечения среды культивирования большим количеством кислорода, что в некоторых случаях не представляется возможным.

Культивирование клеток Е. coli RB791 (мутант Е. coli W3110) [151] проводили при 37С в течение 23-25 часов на богатой питательной среде с глицерином в качестве основного источника углерода. Было показано, что при непрерывном введении дополнительного количества питательных веществ в реактор достигаемый выход биомассы был на 30% меньше, чем выход, получаемый при внесении того же количества субстратов дробным методом. Кроме того, показано, что внесение глицерина до концентрации 25 г/л является оптимальным для поддержания ju на высоком уровне и достижения выхода биомассы 20-25 г/л. Накопление побочных продуктов внутриклеточного метаболизма в среде культивирования исследовалось в периодическом режиме с использованием глюкозы или глицерина в качестве единственных источников углерода. Было показано, что через 24 часа концентрация ацетата в среде с глицерином составляла ~1/3 концентрации ацетата в среде с глюкозой, что, предположительно, являлось одной из причин, по которой глицерин в высоких концентрациях оказывал меньший ингибирующий эффект на рост микроорганизмов в полупериодическом режиме культивирования, чем глюкоза.

Полупериодическую культуру (Е. coli ЕРІ) [152] вырашивали при 28С на богатой питательной среде, используя глюкозу, сорбитол или глицерин в концентрациях 0,5 -5,0% в качестве основных источников углерода, для получения пенициллин-G- ацилазы (ПГА). Во всех экспериментах конечная концентрация клеток при 3,0 % (для глюкозы) или 5,0 % (для сорбитола и глицерина) содержании источников углерода в среде культивирования была практически в 2 раза выше, чем при 0,5 %. При использовании глицерина биомасса клеток накапливалась быстрее, чем при использовании глюкозы. Наибольший выход общей и внутриклеточной активности ПГА был отмечен при использовании глицерина.

При увеличении концентраций фосфатов в среде культивирования и использовании для аэрации чистого кислорода авторам удалось добиться за 12 часов культивирования увеличения выхода биомассы клеток до 162 г/л, имеющих ПГА активности до 37 ед/г клеток.

Таким образом, при культивировании клеток в полупериодическом режиме с добавлением углеродного субстрата (глюкоза, глицерин, сахароза и др.) можно добиться несравнимо более высоких концентраций биомассы, чем при культивировании в периодическом режиме. При этом, использование глицерина в качестве единственного источника углерода является наиболее предпочтительным. Снижение температуры культивирования способствует рациональному расходу питательных веществ и уменьшению количества образующихся в процессе роста клеток побочных продуктов,

накопление которых в среде культивирования приводит к ингибированию роста биомассы. Для определения времени внесения очередной порции питательных веществ в среду культивирования можно использовать показатели, коррелирующие с изменением концентраций субстратов в среде или руководствоваться заранее определенными математическими зависимостями, отражающими динамику изменения концентрации того или иного субстрата в среде культивирования в процессе роста клеток.

1.4.3. Аэрация среды, использование перфторуглеродных соединений для увеличения растворимости кислорода в среде культивирования

При выращивании аэробных микроорганизмов насыщение среды культивирования кислородом является одним из важнейших факторов, определяющих продуктивность процесса накопления биомассы и синтеза целевого продукта.

Растворимость кислорода при 0,1 МПа и 30С віл дистиллированной воды составляет 7,5 мг/л, в питательной среде -2-5 мг/л [160-161]. От интенсивности аэрации

ЗаВИСИТ Цтах [160]:

Umax = (dX/dt)_max = aYo₂

где X — масса клеток, Уш - масса клеток, получаемых на 1 г Ог при прочих оптимальных условиях роста, а - максимальная скорость растворения кислорода при данных условиях культивирования.

Для получения 1 г биомассы клеток Е. coli W необходимо 0,94 г кислорода при культивировании на среде с глюкозой при 30С, то есть Yo₂ составляет 1,06. [160].

Справедливо и обратное утверждение: потребность микроорганизмов в кислороде определяется удельной скоростью роста /л. При культивировании клеток Е. coli [162] было показано, что при увеличении ц скорость абсорбции кислорода увеличивается.

Также потребность в кислороде зависит от штамма клеток Е. coli. Было показано, что при культивировании клеток Е. coli В и К12-3300 при 25 и 30С константы Yo₂ были относительно близкими и находились в диапазоне 0,47 - 0,77. При культивировании клеток Е. coli W константы Yo₂ при 20 и 30С имели значения в 1,5 - 2 раза выше и составляли 1,14 и 1,28, соответственно [163].

Установлено, что для роста клеток со скоростью 1 г/ч віл среды культивирования необходимо ~1,06 г/л/ч Ог. При максимальной растворимости Ог в питательной среде 5 мг/л, скорость его подачи должна составлять 212 л/ч или 3,5 л/мин на 1 л среды культивирования или 17,7 л/мин воздуха, с учетом того, что содержание кислорода в атмосферном воздухе составляет 20,95% [161]. Очевидно, что для реакторов больших

объемов аэрация микроорганизмов является настоящей проблемой, требующей применения различных подходов к ее решению.

При использовании для аэрации чистого кислорода его растворимость в среде культивирования составляет порядка 35 г/л [160], что значительно выше, чем в случае применения атмосферного воздуха. Такие биотехнологические ферментационные системы при 25С могут обеспечивать среду культивирования 27 г Ог /л/ч [153], и теоретический выход клеток Е. coli может составлять 350 r/л при ц 0,2 ч"¹, при соблюдении других необходимых условий. Данное значение выше предельной концентрации 220 г/л, рассчитанной на основании данных о текучести. Таким образом, при использовании чистого кислорода скорость переноса кислорода в жидкую культуру не представляется лимитирующим фактором.

Однако, применение чистого кислорода в ферментативных системах большого объема может значительно увеличить конечную стоимость целевого продукта. Использование веществ, активно растворяющих кислород, представляется привлекательным способом, который может решить проблему недостатка кислорода в среде культивирования. К таким веществам относятся перфторуглеродные соединения.

Перфторуглероды (ПФУ) - углеводороды, в молекулах которых большинство атомов водорода замещено на атомы фтора [164]. Замещение водорода на фтор приводит к значительному увеличению молекулярной массы, таким образом, перфторуглероды намного тяжелее углеводородов и обычно в 2 раза плотнее воды. Перфторуглероды имеют исключительную химическую инертность и термостабильность, что дает возможность их широкого использования в качестве переносчиков кислорода не только в биотехнологии, но и в медицине в виде эмульсий различного состава [164-166].

Одним из важнейших свойств перфторуглеродов является то, что они могут растворять большие объемы атмосферных газов. Например, перфтордекалин способен растворить 35,5 ммоль 0₂ /л при 0,1 МПа и 25С (растворимость Ог в воде составляет 2,2 ммоль/л).

Показано, что при выращивании грибов Panus tigrinus для получения лакказы, введение в среду культивирования 0,5% и 1% перфторана, приводит к увеличению выхода целевого продукта в 2 и 1,8 раз, соответственно [167]. Аналогичные результаты были получены при культивировании бактерий различных родов (Pseudomonas, Rhodococcus, Bacillus) на минимальной среде с добавлением неочищенной нефти и мазута [168]. Показано, что добавление в среду культивирования перфтордекалина в концентрации 5% приводит к увеличению выхода биомассы в 4,5-10,2 раз и скорости утилизации нефтяных продуктов в 8,7-12,7 раз у всех исследованных микроорганизмов.

При культивировании клеток Azotobacter chroococcum АСВ 121 [169] добавление 5% перфтордекалина приводило к увеличению выхода биомассы более, чем в 5 раз, нитрогеназной активности - в 3,4 раза по сравнению с культивированием в отсутствии перфторуглерода. Влияние карбогала и перфторметилдекалина на выход биомассы и активность нитрогеназы оказалось ниже, чем у перфтордекалина.

Похожие результаты были получены при выращивании различных видов псевдомонад и клеток Plesiomonas shigelloides на минимальной среде [170] с добавлением перфторуглеродов (перфтордекалина, карбогала и перфторметилдекалина). Добавление 5% перфтордекалина приводило к увеличению выхода биомассы, причем увеличение концентрации перфторуглеродов до 25% имело негативный эффект.

При культивировании клеток Е. coli В РР01 на минимальной среде с глюкозой [171], авторам удалось повысить общий выход биомассы и удельную скорость роста микроорганизмов практически в 2 раза при добавлении перфторметилдекалина в среду.

Добавление в богатую питательную среду культивирования 15-30% эмульсии перфтордекалина не привело к значительным изменениям в динамике роста популяций клеток Е. coli НВ101 при 37С [172]. Более того, авторами было отмечено незначительное снижение удельной скорости роста клеток при увеличении концентрации перфтордекалина в среде культивирования.

Таким образом, применение перфторуглеродов более целесообразно при культивировании микроорганизмов на минимальных средах, где потребность клеток в кислороде выше по сравнению с их ростом на богатых питательных средах. Данный факт связан с тем, что необходимость синтеза аминокислот, азотистых оснований, углеводов и т.п. de novo для существования микроорганизмов и их размножения на минеральных питательных средах сопряжена с потреблением большого количества АТФ и NAD⁺, на производство которых требуется большое количество кислорода. Данная необходимость частично снижается при использовании богатых питательных сред культивирования, так как в них уже присутствует достаточное количество готовых компонентов для эффективного функционирования клетки. Тем не менее, использование перфторуглеродных соединений для поддержания удельной скорости роста клеток на высоком уровне в культурах высокой плотности представляется перспективным направлением даже при использовании богатых питательных сред.

1.4.4. Экспрессия генно-инженерных конструкций в рекомбинантных клетках микроорганизмов

Культивирование рекомбинантных микроорганизмов для получения белков, синтез которых кодируют гены, регулируемые индуцибельными промоторами в генно-инженерных конструкциях, является более сложной задачей по сравнению с выращиванием бесплазмидных клеток. Если в последнем случае для достижения высоких плотностей клеток достаточно поддерживать удельную скорость роста с помощью постепенного введения питательных веществ в среду культивирования, то для достижения высокого выхода целевого продукта в рекомбинантных клетках необходимо более точно оптимизировать температуру процесса. При высоких температурах синтезированный полипептид может не успевать правильно сворачиваться и агрегировать в виде телец включения, а низкие температуры приведут к значительному снижению ju, что приведет к снижению общего выхода белков.

В многочисленных экспериментальных исследованиях было обнаружено, что длительное культивирование плазмид-содержащих штаммов микроорганизмов часто приводит к элиминированию рекомбинантных клеток и замене их на бесплазмидные варианты [173-176].

Неустойчивость штаммов микроорганизмов, содержащих рекомбинантные плазмиды, обусловлена тремя основными причинами:

1. сегрегацией гшазмид, когда часть клеток популяции утрачивает плазмиды при делении;

2. нестабильностью генетической структуры плазмид, при которой плазмиды сохраняются в популяции, но в измененном виде;

3) отличием /и штамма, содержащего активно функционирующие генно-
инженерные конструкции, по сравнению с /л бесплазмидного штамма, либо штамма,
содержащего измененные плазмиды. Например, /j. клеток Е. coli НВ101,
трансформированных высококопийной генно-инженерной конструкцией (408 копий в
клетке), в 1,3 раза меньше, чем ju бесплазмидных клеток [143].

Отличие кинетических характеристик служит своеобразным "усилителем" нестабильности рекомбинантных клеток, поскольку благодаря ему создается селективное преимущество в скорости размножения бесплазмидного штамма. Если же в экспериментах при длительном культивировании наблюдается практически 100%-ная стабильность рекомбинантного штамма, то это означает либо низкую вероятность образования сегрегатов или измененных плазмид, либо неконкурентоспособность этих вариантов по сравнению с исходным штаммом.

Так, при культивировании клеток Е. coli К12 [177], трансформированных генно-инженерными конструкциями pUR 290 и pFR 99, на минимальных и богатых питательных средах без добавления антибиотика и индуктора выход клеток составил 45-50 г/л. Количество копий генных конструкций в клетках при их культивировании в течение 8 ч при 37С увеличилось с 50 до 200 и 400, соответственно составу питательной среды.

Культивирование клеток до высокой плотности является довольно длительным процессом, в течение которого потеря экспрессионнои конструкции некоторыми клетками является весьма вероятной. В связи с этим для предотвращения доминирования бесплазмидных клеток над рекомбинантными в среде необходимо проводить селекцию микроорганизмов на протяжении всего времени культивирования, например, путем введения дополнительного количества антибиотика, которая позволяет снизить вероятность увеличения количества бесплазмидных клеток.

При индукции экспрессии генно-инженерной конструкции, кодирующей синтез целевого белка в рекомбинантных клетках, их специфическая скорость роста изменяется в степени, зависящей от многих факторов, но прежде всего, от концентрации индуктора, вносимого в среду культивирования, а также от времени его внесения. Данный факт является прямым следствием перераспределения потоков основных субстратов (углеродных, азотных и фосфорных) в биохимических процессах внутри клетки.

Было показано, что при введении ИПТГ в среду культивирования клеток Е. coli MG1655 первые 10 минут клетки испытывали стресс, аналогичный нагреву клеточной культуры до 42С, сопровождающийся выделением белков, характерных для данного процесса или репрессированием синтеза других [128]. Кроме того, было показано, что незначительные концентрации ИПТГ (0,05 мМ) увеличивают удельную скорость роста клеток примерно в 1,2 раза как на минимальной, так и на богатой питательной среде. Более высокие концентрации индуктора приводят к незначительному уменьшению удельной скорости роста клеток.

На примере синтеза лакказы грибом Panus tigrin [167] было показано, что выходы фермента в значительной степени зависят от времени внесения индуктора (2, 4 -диметилфенола) в среду культивирования. При прочих равных условиях синтеза фермента, внесение индуктора в среду в момент инокулирования увеличивало выход целевого продукта в 2 раза по сравнению с процессом, проводимым без добавления индуктора. При этом проведение индукции на 4-ые сутки культивирования клеток приводило к увеличению выхода фермента в 6 раз.

При экспрессии Р-лактамазы в клетках Е. coli RB791 (мутант/і. coli W3110) [151] было показано, что выход активного фермента зависит от концентрации индуктора

(ИГГГГ), вносимого в культуральную среду, а также от концентрации клеток в культуральной среде, при которой проводится индукция. Авторами было установлено, что конечная концентрация ИГПТ в среде 1мМ является достаточной для достижения максимальной ферментативной активности клеток в процессе их культивирования. Кроме того, бьшо установлено, что внесение индуктора в суспензию клеток с ODeoo-75 приводит к увеличению выхода активной Р-лактамазы в 10 раз по-сравнению с культивированием, в котором индукция синтеза фермента проводилась при СЮбоо=30, и в 1,25 раз по-сравнению с индукцией синтеза при СЮбоо⁼50.

При синтезе димерных миниантител scFv.425dhlx под действием индуктора ИПТГ в клетках Е. coli [148], было выявлено, что продукт образуется в активной или агрегированной формах. Показано, что при проведении индукции 1 мМ ИПТГ на 26-ом часу культивирования при 26С и концентрации клеток 40 г/л начинает образовываться неактивная форма димерных миниантител, тогда как при концентрации клеток 90-110 г/л (через 3 часа) практически весь продукт синтезируется в активной форме.

При экспрессии пеницилин-О-ацилазы в клетках Е. coli ЕРІ (мутант Е. coli АТСС 9637) [152] было показано, что внесение в среду культивирования индуктора (фенилуксусной кислоты) после 3-х часов культивирования приводит к снижению выхода биомассы, а также активного фермента в 2 и более раз по сравнению с культивированием клеток без внесения индуктора.

Таким образом, для повышения выхода белка, синтезируемого рекомбинантными микроорганизмами, необходимо поддерживать скорость экспрессии кодирующей его конструкции на среднем уровне, но максимально увеличивать плотность культуры, снижая при этом вероятность доминирования бесплазмидных клеток. Для этого необходимо оптимизировать следующие условия: температуру культивирования, интенсивность аэрации, концентрацию индуктора в питательной среде и время его введения, введение добавок антибиотиков, скорость внесения питательных веществ в среду культивирования и метод контроля их концентраций. Особенно важно не допустить возникновения стрессовых ситуаций для клеток, вызванных нехваткой субстратов, поскольку в данном случае включается синтез протеаз, под действием которых происходит быстрая деградация рекомбинантного белка, сопровождающая лизис клеток.

Как следует из представленного обзора литературы, культивирование рекомбинантных клеток является более сложным процессом, требующим варьирования большего числа факторов, чем культивирование бесплазмидных клеток. В связи с этим, выход биомассы рекомбинантных микроорганизмов в большинстве случаев существенно ниже, чем выход бесплазмидных клеток, выращенных в тех же условиях. Таким образом,

при культивировании рекомбинантных микроорганизмов плотность биомассы редко превышает 45-50 г/л.

Следует отметить, что ранее процесс культивирования штаммов-продуцентов His6-OPH с учетом всех факторов, описанных в данном обзоре литературы, исследован не был. Возможность широкого применения данного фермента для гидролиза различных ФОС требует разработки эффективных и экономически оправданных способов получения фермента Hise-OPH. Таким образом, оптимизация процесса культивирования штаммов-продуцентов His6-OPH с целью получения максимального количества активной растворимой формы фермента на данный момент является крайне актуальной задачей.

1.5. Применение растворимой формы фермента Hise-OPH

Проявление ферментом His6-OPH активности по отношению к широкому спектру ФОС открывает возможности применения данного фермента для утилизации ФОС в различных крупномасштабных системах, например, для детоксикации реакционных масс, содержащих вещество типа Vx в остаточных концентрациях до 10"² М, а также для деградации остаточных концентраций пестицидов в различных природных и народнохозяйственных объектах. Кроме того, растворимая форма фермента может быть использована для создания иммобилизованных активных препаратов, предназначенных для деградации ФОС.

1.5.1. Применение ОРН в процессе обезвреживания реакционных масс, полученных в результате химического уничтожения ФОВ

Согласно Международной конвенции об уничтожении химического оружия запасы ФОВ должны быть полностью уничтожены к 2012 г [9-10].

Вещество Vx является самым токсичным из трех основных ФОВ (летальные дозы для зомана, зарина и Vx составляют 0,14 мг/кг, 0,05 мг/кг и 0,008 мг/кг, соответственно).

На данный момент времени принято к применению две рецептуры (методики) уничтожения ФОВ. Первая рецептура (РД-4М) [178] предназначена для дегазации и уничтожения ФОВ в местах их хранения, а также для дегазации различного технологического оборудования, емкостей и снаряжения после эвакуации из них указанных ФОВ [179]. Вторая рецептура (РД-ГД) предназначена для дегазации ФОВ непосредственно в боеприпасах [180]. Согласно принятым в РФ методам уничтожения ФОВ, остаточные концентрации ФОВ в составе реакционных масс (РМ) достигают 0,1%. Такие концентрации вещества типа Vx, безусловно, являются высоко токсичными как для человека, так и для окружающей среды и нуждаются в дальнейшем уничтожении. Кроме

того, продукты разложения ФОВ также являются токсичными для человека [12]. Состав РМ, полученных после дегазации ФОВ с использованием рецептур РД-4М и РД-ГД представлен в табл. 5.

Таким образом, дегазация реакционных масс, получаемых в процессе уничтожения ФОВ, является крайне актуальной задачей. Следует отметить, что снизить токсичность данных РМ не удается ни одним из разработанных химических способов разложения ФОВ.

Таблица 5. Реакционные массы, полученные в результате детоксикации вещества типа Vx (образцы предоставлены ГОСНИИОХТ).

В последнее время быстро растет интерес к экологически безопасным, легко реализуемым и экономически выгодным способам детоксикации ФОВ, основанным на применении ферментов, способных катализировать гидролиз зарина, зомана и Vx при температурах окружающей среды и атмосферном давлении [181-185]. Вместе с тем, до сих пор проводились исследования по разложению ФОВ преимущественно в виде чистых веществ, а не в составе сложных смесей, называемых реакционными массами (РМ).

Известно, что ОРН катализирует гидролиз всех трех основных ФОВ (зарина, зомана и Vx). Каталитические константы, рассчитанные для гидролиза Vx, составляют: К_т = 0,47 мМ, V_max = 2,1 мкмоль/мг/мин) [184].

Сегодня известно, что фермент ОРН может быть введен в состав забуференной композиции с пенообразующим веществом, например, пожарной пеной, для устранения химической угрозы в виде ФОВ [185]. Концентрация фермента при этом составляет до 700 мг/л при обработке объекта, зараженного ФОВ. Показано, что за 60 мин фермент может гидролизовать чистое вещество зарин на 99% при использовании 8 мг высокоочищенного препарата ОРН для обработки 1л 10"⁸ М раствора вещества (рН 7,5-8,0).

Гидролиз чистых веществ (зарина и зомана) может быть осуществлен с помощью растворимой формы ОРН [186]. Для этого к реакционной смеси, состоящей из буферного раствора (рН 7,0-8,5) и ФОВ (зарина или зомана), добавляют ОРН. Например, 5-Ю"³ М зарина или зомана, при использовании, соответственно, 1 мг и 10 мг фермента на 1 л раствора отравляющего вещества в 20 мМ PJPES-буфере (рН 7,0) или 20 мМ Трис-буфере (рН 8,5), содержащих 390 мМ КС1 и 40 мМ NaCl, гидролизуется в течение 30 мин.

Установлена эффективность применении фермента His₆-OPH в виде высокоочищенного растворимого или регидратированного лиофилизованного препарата, полученного из гомогената клеток Е. coli SG13009[pREP4], для разложения ФОВ в виде чистых веществ [187]. В частности, гидролиз ФОВ осуществляется введением ферментного препарата His₆-OPH к отравляющему веществу, находящемуся в растворе прирН 7,5-11,0 в концентрации 10'⁸-10"²М.

Демонстрация возможности использования ферментного препарата Hise-OPH для окончательной дегазации ФОВ не в виде чистых веществ, а в виде компонента реакционных масс, полученных в результате утилизации, например, наиболее токсичного вещества типа Vx химическим способом, является крайне актуальной задачей. При этом, для крупномасштабного применения фермент целесообразно использовать в неочищенном виде, что, несомненно, должно удешевлять процесс его применения.

1.5.2. Фильтругощесорбирующие материалы для средств индивидуальной защиты от воздействия ФОС

На сегодняшний день широко известны различные фильтрующесорбирующие материалы химзащитного действия, подавляющее большинство из которых основано на использовании активированного угля или активированных углеродных волокон в качестве фильтрующего и сорбирующего компонента [73, 188-191]. Материалы, в основном,

состоят из нескольких слоев углеродсодержащих волокон и армирующего слоя, создающего механическую прочность материала. Для термозакрепления сорбента (активированного угля) используются водонерастворимые полимерные соединения, что приводит к частичной потере им сорбционной емкости.

Следует отметить, что независимо от способа получения защитных материалов на основе активированного угля их общим существенным недостатком является возможность десорбции абсорбированного отравляющего вещества из угольного слоя. Кроме того, сорбционная емкость материала ограничивает по длительности период времени, в течение которого гарантируется отсутствие паров ядовитого вещества, проникшего сквозь образец. Этот период времени, как правило, не превышает 24 ч.

В связи с этим наиболее эффективными для использования в средствах химзащиты являются материалы, обеспечивающие не только эффективную сорбцию и удержание отравляющих веществ, но и осуществляющие их разложение (дегазацию).

Известны различные фильтрующесорбирующие защитные материалы, действие которых основано на применении сорбентов, содержащих различные вещества, катализирующие разложение сорбированных отравляющих веществ до существенно менее токсичных продуктов. В таких материалах в качестве сорбентов и одновременно катализаторов разложения ОВ используются химически активированные оксиды алюминия, цинка, магния, титана, церия, серебра (до 65% от массы сорбента) с добавлением монопероксифталата магния (до 35% от массы сорбента) [192-193] или комплексные соли тех же металлов (полиоксометаллаты) [194].

Такие защитные материалы обеспечивают при нанесении на их поверхность вещества Vx или зомана в концентрации 10 г/м² их нейтрализацию на 59% и 98% (до первичных продуктов разложения), соответственно, за 24 ч.

Однако, использование таких химических катализаторов в составе защитных материалов приводит к колоссальному удорожанию самих материалов, так как для эффективного гидролиза необходима высокая концентрация катализаторов и высокая степень их измельчения (размер гранул до 250 мкм).

Возможную альтернативу химическим катализаторам, вводимым в сорбенты в составе защитных материалов, могут составить ферменты, способные катализировать гидролиз ФОБ. Известно, что эффективность действия ферментов по отношению к ФОС значительно выше, чем эффективность действия неорганических катализаторов [23]. Это может обеспечивать ту же степень разложения отравляющих веществ за тот же период времени, что и в случае химических катализаторов, но при этом может позволить существенно снизить концентрации катализаторов, вводимых в состав сорбентов.

Очевидно, что наиболее целесообразным является использование ферментов в иммобилизованной форме, которая обеспечивает длительное сохранение каталитической активности ферментов и упрощает процедуру их введения в структуру защитных материалов. Следует отметить, что каталитическая эффективность действия иммобилизованных ферментов, введенных в состав защитных материалов, определяется выбором самого фермента и способом его иммобилизации.

Сегодня уже известны первые попытки создания фильтрующесорбирующих самодегазирующихся материалов на основе ферментов. Так, известен защитный материал, представляющий собой полиуретановую губку, содержащую ковалентно иммобилизованный фермент ОРН и частицы активированного угля [195]. Включение активированного угля в сорбент и иммобилизация фермента осуществляется непосредственно в процессе полимеризации и формирования полиуретанового носителя. Полученный материал хранят в герметичной упаковке при 4С. Максимальная концентрация фермента в составе такого материала составляет 8 мг/см². Материал предназначен для детоксикации ФОВ (зарина, зомана и Vx) и может быть помещен между несколькими слоями из полиэстера при использовании его в составе индивидуальных средств защиты [196].

При нанесении на поверхность такого материала параоксона в концентрации 0,9 г/м² происходит нейтрализация последнего до первичных продуктов разложения на 100% за 1 ч [181, 197-199]. Поскольку каталитическая эффективность действия фермента ОРН, использованного в составе данного материала, в отношении вещества Vx в 10 раз меньше по сравнению с параоксоном [2, 182], то для нейтрализации такого же количества (0,9 г/м²) вещества Vx или зарина требуется, соответственно, в 10⁵ и 10⁴ часов больше, то есть порядка 4167 и 417 суток, соответственно.

Низкая эффективность действия материала в отношении ФОВ объясняется тем, что в результате ковалентной иммобилизации ОРН в процессе формирования носителя происходит множественное образование ковалентных связей между карбоксильными и аминогруппами белка с преполимером, в результате чего фермент существенно инактивируется. Кроме того, низкая концентрация водной фазы (не более 1% масс. [195]) в составе полученного материала в микроокружении фермента приводит к наличию затрудненного катализа.

Другой известный фильтрующесорбирующий самодегазирующийся защитный материал состоит из нескольких слоев:

верхний слой выполнен из полипропилена, поликарбоната или бутилированного каучука; он контактирует с каплями отравляющего вещества и изолирует внутренние слои материала от проникновения отравляющих веществ в виде жидкости;

нижний слой состоит из целлюлозосодержащего материала и предназначен для контакта с кожным покровом;

средний слой состоит из резины или вспененного пластика с импрегнированными частицами активированного угля, ферментом фосфорилфосфатазой и ортойодбензойной кислотой; данный слой предназначен для сорбции паров ОВ и их детоксификации [200].

В составе материала используется фермент, характеризующийся крайне низкой каталитической активностью в отношении ФОВ, сопоставимой с действием химических реагентов при рН 8,0 [201]. Косвенно неэффективность действия фермента подтверждается введением в состав защитного материала ортойодбензойной кислоты, обладающей мощными окислительными свойствами в отношении различных ФОВ и применяемой в качестве дегазатора на практике [202-203]. Кроме того, при введении ортойодбензойной кислоты (рН <7) указанный фермент теряет свою каталитическую активность, и, таким образом, его введение в состав защитного материала становится совершенно бесполезным, а дегазирующее действие сводится к действию химического агента (ортобензойной кислоты).

Наличие в микрооркружении иммобилизованного фермента резины или вспененного пластика, и, следовательно, отсутствие удерживаемой этими материалами воды в микроокружении фермента, также отрицательно влияет на эффективность его действия.

Таким образом, разработка самодегазирующегося защитного материала на основе фермента, каталитически активного в отношении ФОВ, является крайне актуальной задачей.

Как следует из обзора, ферментативный гидролиз ФОС представляет собой весьма перспективную область исследований с колоссальными возможностями широкого применения полученных результатов на практике. Возможность использования ферментов, обладающих органофосфатгадролазной активностью, для утилизации ФОС в различных системах в неэкстремальных условиях (в первую очередь в температурных интервалах, в которых возможно функционирование биологических катализаторов) стимулирует новые исследования, направленные на изучение и осознанное изменение свойств этих ферментов. Кроме того, широкое использование данных ферментов требует разработки высокоэкспрессионных систем, способных обеспечить получение активной

формы ферментов в количествах, необходимых для решения многочисленных прикладных задач.

Чтобы такие методы нашли свое применение на практике, необходимы технологически реализуемые, экономически оправданные, эффективные способы получения ферментов в растворимой активной форме. Как правило, такие способы предполагают создание системы для экспрессии гена, кодирующего синтез фермента, включающей плазмиду и штамм-продуцент, увеличение уровня синтеза фермента за счет оптимизации условий культивирования рекомбинантных штаммов-продуцентов, оптимизации процессов выделения и очистки белка с применением минимального количества стадий, а также, если это возможно и экономически оправданно, проведение рефолдинга фермента из ТВ.

В связи с этим основной целью данной работы было получение фермента Hise-OPH в растворимой активной форме с использованием различных подходов: генно-инженерного (создание гибридных белков), биохимического (проведение рефолдинга из телец включения) и биотехнологического (оптимизация условий культивирования штамма-продуцента Hise-OPH).

На основании информации, изложенной в литературном обзоре, для достижения основной цели в работе необходимо было решить ряд основных задач:

разработать генно-инженерные конструкции, кодирующие синтез гибридных белков, состоящих из молекул deGFP4 и ОРН, соединенных спейсерами различного состава, для увеличения выхода растворимой активной формы ОРН в клетках Е. coli;

провести оптимизацию условий синтеза модифицированных аналогов ОРН в клетках Е. coli и определить условия, обеспечивающие наибольшие выходы белка в растворимой форме, выделить полученные белки и исследовать их свойства;

провести рефолдинг фермента Hise-OPH из телец включения с использованием макропористых носителей на основе криогеля ПААГ, модифицированного иминодиуксусной кислотой, заряженного ионами Со²⁺;

провести оптимизацию условий синтеза Hise-OPH в клетках Е. coli, подобрать условия, обеспечивающие наибольшие выходы белка в растворимой форме;

разработать защитные самодегазирующиеся материалы длительного действия на основе фермента Hise-OPH и показать возможность применения фермента Hise-OPH для детоксикации остаточных количеств вещества типа Vx в составе реакционных масс, полученных после химического уничтожения ФОВ.

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2.1. Материалы и приборы 2.1.1. Реактивы

Параоксон (Sigma) - препарат перед использованием очищался следующим образом: 1 мл препарата растворяли в 250 мл дихлорметана, продукты гидролиза экстрагировали ЮмМ CHES буфером (рН 9,0), отделяли органическую фазу, добавляли осушитель - MgSC>4 и отфильтровывали. Дихлорметан упаривали на роторном испарителе. Очищенный параоксон растворяли в бидистилированной воде до концентрации 1-10" М. Полученный раствор хранили при температуре 0 - 4 С.

Органические растворители: этанол, этилацетат - препараты марки ч.д.а. («Реахим»), дихлорметан - препарат марки х.ч. («Реахим») использовались без дополнительной очистки.

Имидазол (Sigma) использовался без дополнительной очистки;

CHES (2-р<Г-циклогексиламино]этансульфоновая кислота, рК_а 9,3), буферное вещество (Sigma);

TRIS (Трис[гидроксиметил]аминометан, рК_а 8,1), буферное вещество (ICN Pharmaceuticals);

гидр оксид калия, препарат марки ч.д.а. (Reanal);

гидроксид калия, препарат марки ч.д.а. (Reanal);

карбонат натрия кислый, препарат марки ч.д.а. («Реахим»);

фосфаты натрия, калия одно- и двузамещенные. препараты марки ч.д.а. («Реахим»);

перфтордекалин. препарат марки ч.д.а. («Реахим»);

хлорид кобальта шести водный (Sigma);

акрил амид, бис акрил амид (Merck);

агароза (Bio-Rad);

этилендиаминтетрауксусная кислота ОПТА) (Merck);

бромистый этидий (Sigma):

глицерин (Sigma);

бромфеноловый синий (Sigma);

триптон. дрожжевой экстракт (Difco);

додецилсульфат натрия (ДСН), препарат марки ч.д.а. (Reanal);

N.N.N',N'-тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), препарат марки ч.д.а. (Reanal);

изопропил-В-Р-тио-галактопиранозид (ИГТГГ) (Serva);

дезоксинуклеозидтрифосфаты, дидезоксинуклеозидтрифосфаты. (Fermentas);

DEAE NA - 45 мембрана (мембрана, изготовленная на основе целлюлозы,
модифицированной путем замены некоторых гидроксильных групп

диэтиламиноэтильньши радикалами) (Schleicher and Schuell);

краситель кумасси Brilliant blue R (Sigma);

Маркеры молекулярного веса для белкового электрофореза (Fermentas - набор белков с молекулярными массами 14,4; 18,4; 25,0; 35,0; 45,0; 66,2; 116,0 кДа или 26,0; 34,0; 43,0; 55,0; 72,0; 95,0; 130,0 кДа);

ДНК-маркеры молекулярного веса (Fermentas);

Макропористые носители IDA крио-ПААГ для металл-хелатирующей хроматографии бьши любезно предоставлен проф. Бо Маттиассоном (Университет Лунда, Швеция).

Все остальные реактивы марки ч.д.а были приобретены в фирмах "Лабтехника" и «Химмед».

2.1.2. Ферменты

Эндонуклеазы рестрикции: ВатШ, Sad, Nhe\, Sail, ДНК - лигаза фага Т4 (1 ед/мкл) (Fermentas),

ДНК-полимераза фага Т7 (Apbiotech).

2.1.3. Бактериальные штаммы

В работе использовались следующие генно-инженерные штаммы Е. coli:

XLl-Blue: F' proAB lad^qA(lacZ)M15 Tnl 0(tef)/recAl endA2 gyrA96(Nal^r) thil hsdR17(r"_km⁺k) supE44 relAl lac

DH5a: F" (km⁺_k) supE44 relAl deoR A(lacZYA-argF) U169

SG13009[pREP4]: Nal^s Str⁵ rif, lac" ага" gal" mtl" F" recA⁺ uvr⁺

2.1.4. Питательные среды

В работе использовались стандартные питательные среды LB и TYE. При выращивании устойчивых к антибиотику клеток в среду добавляли ампициллин до концентрации 70 - 100 мкл/мл. Агаризованные питательные среды содержали 1,7% бакто агара.

Состав среды LB:

триптон -10,0 г/л

дрожжевой экстракт- 5,0 г/л

NaCl-10,0 г/л Состав среды TYE: триптон -12,0 г/л дрожжевой экстракт — 24,0 г/л глицерин - 4,0 мл/л КН₂Р0₄ - 6,95 г/л К₂НР0₄ *3 Н₂0- 12,54 г/л рН среды 7,0

2.1.5. Составы растворов

1. Среднесолевой буфер для рестрикции (Orange): 33 мМ Tris-ацетат (рН 7,9), 10 мМ MgCb, 66 мМ ацетат калия

2. Высокосолевой буфер для рестрикции (Yellow): 50 мМ Tris-HCl (рН 7,5), 10 мМ MgCl₂, ЮОмМКСІ

3. Буфер для лигирования: 40 мМ Tris-HCl (рН 7,8), 10 мМ MgCl₂, 10 мМ ДТТ, 0,5 мМ АТФ

4. Буфер для выделения ДНК на мембране (hs NET): 1,0 М NaCl, 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ Tris-HCl (рН 8,0)

5. Буфер ТАЕ для электрофореза ДНК в агарозном геле: 40 мМ Tris-ацетат (рН 8,0), 20 мМ ацетат натрия, 1 мМ ЭДТА

6. Буфер для замораживания компетентных клеток (FSB): 100 мМ КС1, 45 мМ хлорид марганца, 10 мМ хлорид кальция, 3 мМ гексаминкобальтхлорид, 10 мМ ацетат калия, 10% глицерин

7. Буфер для ультразвуковой дезинтеграции клеток: 0,1 М NaH₂P04 (рН 7,5), 0,05 М NaHC0₃, 0,3 М NaCl, Ю^-3 М ионов Со²⁺

8. Probing-буфер: 0,5М Tris-HCl (рН 6,8) 1 мл, глицерин 0,8 мл, 10%ДСН 1,6 мл, 2-меркаптоэтанол 0,4 мл, 1% бромфеноловый голубой 0,4 мл, деионизованная вода 3,8 мл.

9. Приготовление агарозного геля для разделения фрагментов ДНК:

Агарозу растворяли до концентрации 0,8 - 1,4 % (в зависимости от длины разделяемых фрагментов) в буферном растворе ТАЕ при добавлении бромида этидия (до 0,05%) нагревании, заливали в прибор для горизонтального электрофореза, вставляли гребенку и давали гелю заполимеризоваться.

2.1.6. Синтетические олигонуклеотиды

Все использованные в работе олигонуклеотиды были синтезированы фосфамидийным методом на приборе «Applied Biosysteras DNA Synthesizen>.

Ниже указаны последовательности используемых праймеров в направлении 5'—> 3'

pH-F (Ватт) AGGAGAGGATCCAGTAAAGGAGAAGAACTTTT (33)

RA-R (Мер AGGAGTGCTAGCGCTTGCACTGGCTTTGTATAGTTCATCCATGC (45)

AS-R (Sad) AGGAGCGAGCICGCGCTCGGGCTCTTTTGTATAGTTCATCCATGC (45)

RA-F (Nhel) AGGAGTGCTAGCGCCAGTGCAAGCATCGGCACAGGCGATCGGAT (45)

AS-F (Sad) AGGAGCGAGCTCGAGCAAGGGCCATCGGCACAGGCGATCGGAT (45)

OPH-R (Sail) TCGAAAGTCGACACATCGACAATCGTTCGCAC (33)

2.1.7. Приборы

Культивирование клеток проводили на термостатируемой качалке «Adolf Kuhner AG» (Швейцария) и ферментере (10 л) «В. Braun» (Германия).

Дезинтеграцию клеточной биомассы проводили с помощью ультразвукового излучателя Brenson Sonifier (США).

Для отделения клеток от культуральной жидкости и при выделении и очистке белка использовали центрифугу Beckman J-2-21 (США).

Спектрофотометрические исследования проводились на спектрофотометре «Agilent UV-853» (Германия), оборудованном термостатируемой ячейкой.

Секвенирование проводили на аппарате «Macrophor», LKB (Швеция).

Цепную полимеразную реакцию проводили на амплификаторе «Perkin-Elmen>, (США).

Гомогенность очищенных ферментов контролировали методом электрофореза в неденатурирующих и денатурирующих условиях (в присутствии додецилсульфата натрия, ДЦС-ЭФ) в 12% ПААГ на приборе Mini Protean П «Bio-Rad» (США), согласно инструкции, прилагающейся к прибору.

Определение флуоресценции проводили на микроскопе Биомед-бЛ (Россия) и спектрофлуориметре Shimadzu (Япония).

Определение концентрации вещества Vx и вещества типа Vx проводили проводили на хроматографе Knauer (Германия), используя анионообменнуго колонку Anion/R (Alltech) (Юмкм, 4,1x250мм) с кондуктометрической детекцией и изократическим элюированием. В качестве элюентов использовали 5 мМ раствор 4-гидроксибензойной

кислоты/LiOH (рН 8,5). Скорость подачи элюента - 1 мл-мин" , температура ячейки детектора 35С. Объём вводимой пробы - 20 мкл.

2.2. Методы

2.2.1. Кинетические исследования реакции гидролиза параоксона,
катализируемой ОРН

За скоростью исследуемой реакции следили спектрофотометрически на спектрофотометре Agilent UV-853, снабженных термостатируемыми кюветными отделениями, по накоплению продукта 4-нитрофенолят аниона (s=18000 моль^см"¹, рН 10,5, X = 405 нм). Для определения каталитической активности белков с активностью органофосфатгидролазы использовали 0,1 М буферы: фосфатный (рН 7,0 - 8,0; 11,0 -12,0), CHES (рН 8,5 - 10,0), карбонатный (рН 10,0 - 11,0). В качестве запасного раствора субстрата использовали 10 мМ водный раствор параоксона.

В типичном эксперименте в спектрофотометрическую кювету, содержащую буферный раствор, добавляли различные аликвоты запасного раствора субстрата. Реакцию инициировали внесением в кювету аликвоты запасного раствора белка с активностью органофосфатгидролазы в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,5), содержащем 0,05MNaHCO₃Hl0"³M ионов Со ⁺. Концентрация фермента в кювете составляла 10"¹⁰-10"⁹М.

За единицу ферментативной активности принимали концентрацию фермента, осуществляющую гидролиз 1 мкмоля субстрата в минуту при 25С.

Расчет скоростей ферментативной реакции проводили по начальным линейным участкам кинетических кривых (v₀ = tga). Максимальную скорость ферментативной реакции (V_max) и константу Михаэлиса (К_т) определяли с использованием двойных обратных координат l/vo-l[S] (Лайнуивера-Берка).

2.2.2. Определение рН оптимума действия фермента

Определяли активность His6-deGFP4-(RA)₅-OPH и His₆-deGFP4-(AS)₅-OPH в ОД М буферах с перекрывающимися значениями рН, указанными в п.2.2.1.

2.2.3. Исследование термостабильности

Образец препарата фермента (0,5 мл) в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,5) или в 0,1 М карбонатном буфере (рН 10,5) помещался в термостат при разных температурах и через определенные промежутки времени отбирались пробы объемом 10 мкл. Интервал

между отбором проб подбирался таким образом, чтобы за время эксперимента активность фермента в образцах упала в 2-10 раз. Пробы помещались в спектрофотометрические кюветы, содержащие 1890 мкл 0,1 М карбонатного буфера. Реакцию инициировали добавлением 100 мкл раствора параоксона (5,0 мМ). Концентрация параоксона в кювете при измерении составляла 0,5 мМ.

Константу скорости термоинактивации определяли по тангенсу угла наклона прямой на графике зависимости натурального логарифма остаточной ферментативной активности от времени.

2.2.4. Приготовление компетентных клеток Е. coli

Клетки высевали из глицеринового стока на чашку Петри и подращивали в течение ночи при 37 Ссогласно [204]. Затем 2-3 колонии с чашки переносили в 10 мл LB среды и растили 16-18 часов. После чего 500 мкл ночной культуры переносили в 40 мл среды LB и выращивали до оптической плотности 0,3 - 0,4 (Ая=540 нм), в зависимости от штамма. После охлаждения до 4С культуру центрифугировали при 2600 об/мин 12 минут при 4С, суспендировали осадок в 12 мл FSB буфера, помещали на 15 мин в лед и снова центрифугировали (4 С, 2600 об/мин, 12 мин). Супернатант удаляли, осадок растворяли в 4 мл FSB буфера и аликвотировали по пробиркам по 200 или 400 мкл, после чего быстро замораживали при - 70С.

2.2.5. Трансформация компетентных клеток

Медленно во льду размораживали компетентные клетки, к 200 мкл клеточной суспензии добавляли 5-10 мкл литерованного материала или плазмиды (1 - 10 нг ДНК), как описано в [205]. Смесь инкубировали во льду 40 мин, а затем проводили тепловой шок при 42С в течение 90 секунд, после чего быстро помещали пробирки в лед на 2 мин. Затем к каждой аликвоте трансформированных клеток добавляли по 800 мкл среды LB, содержащей 10 мМ MgCb, 10 мМ MgSCU, 20 мМ глюкозы и инкубировали при 37С 1 ч. После чего клетки высевали на чашку Петри с агаризованной средой LB (1,7% агара), содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,4% глюкозы.

2.2.6. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е. coli

Выделение плазмидных ДНК из 6 - 10 мл ночной кульуры клеток Е. coli проводили с использованием специального набора для выделения ДНК «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» (Fermentas, Латвия), согласно инструкции, прилагающейся к набору.

Для анализа выделенной плазмиды использовали электрофорез в агарозном геле, содержащем до 0,05% бромида этидия, с соответствующими маркерами молекулярного веса.

2.2.7. Рестрикция ДНК и выделение фрагментов электрофорезом в агарозном
геле

Рестрикцию проводили в реакционной смеси объемом 10 мкл следующего состава: 1 мкл плазмиды, 1 мкл буфера для рестрикции (10 - кратного), 0,5 - 0,8 мкл ферментов-рестриктаз и бидистиллированной воды до 10 мкл. Полученную смесь помещали на 1 ч в термостат при 37С.

Структура активного центра и центра связывания субстрата ОРН, а также механизм действия фермента

Вторым мостиковым лигандом между ионами металла служит молекула воды или гидроксид-ион. Данные рентгено-структурного анализа не позволяют однозначно определить форму мостикового лиганда в активном центре ОРН: молекула воды или гидроксид-ион. Определение плотности заряда в данной области экспериментальными методами является сложным [32]. Однако, исследования активного центра фермента, образованного различными ионами металлов, соединенных мостиковыми лигандами водой или гидроксид-ионом, теоретическими методами молекулярного моделирования и кватновой механики позволили более точно описать строение активного центра ОРН [32-39].

Методами квантовой механики и молекулярного моделирования было показано, что конфигурация активного центра фермента, образованного при участии гидроксид-иона в качестве мостикового лиганда, наиболее точно соответствует данным, полученным в результате рентгено-структурного анализа [33]. Очевидно, что форма данного лиганда зависит от рН среды [40], поэтому нельзя исключать возможности протонирования мостикового гидроксид-иона с образованием молекулы воды.

Предположения о возможных точках присоединения протона в активном центре ОРН, образованном ионами Мп2+, при изменении рН были сделаны при изучении спектров парамагнитного резонанса (ЭПР) фермента [39]. Показано, что протон может присоединяться к мостиковому гидр оксид-иону и кислороду остатка Asp3oi. Кроме того, было показано, что снижение активности фермента при значениях рН ниже 7,3±0,1 связано с присоединением протона к мостиковому гидроксид-иону с образованием воды.

Исследования каталитических характеристик ОРН, активный центр которой был образован ионами Со2+, показали, что при снижении рН раствора от 8,5 до 6,5 kcat фермента снижается практически в 3 раза (от 2200 до 660 с"1) [41].

Исследуя возможность протонирования активного центра ОРН, авторы [32] моделировали присоединение протона к мостиковому гидроксид-иону или аминокислотному остатку Asp3oi. Было показано, что структура активного центра фермента, образованная ионами Zn и молекулой воды, в результате оптимизации с помощью квантово-химических методов переходит в структуру, образованную протонированным остатком Аэрзоь При использовании в качестве исходной структуры комплекс ионов Cd2+ с мостиковым гидроксид-ионом и протонированным остатком Asp3oi было показано, что оптимизированный таким образом активный центр фермента, находится в строгом соответствии с данными, полученными в результате проведения рентгено-структурного анализа.

Принимая во внимание тот факт, что кристаллы ОРН для рентгено-структурного анализа были получены при рН 9,0 [26-29], а также то, что рКа для реакции Cd2+-H20 «- СсЮЬҐ" составляет 7,6 [42], можно предположить, что в данном случае мостиковьтм лигандом являлся гидроксид-ион.

Следует отметить, что при формировании активного центра фермента происходит перераспределение электронной плотности между ионом металла и лигандами, в результате чего могут изменяться эффективные заряды элементов, участников процесса комплексообразования. При варьировании эффективного заряда иона Zn(II) в составе активного центра фермента ОРН методами квантовой механики и молекулярной динамики было показано, конфигурация активного центра фермента наиболее точно соответствует экспериментальным данным при эффективном заряде на ионах металла +1,5 [38].

В составе активного центра ОРН могут находиться различные ионы металлов. Роль ионов металла, находящихся в а - и р - положениях, в механизме гидролиза ФОС различна. Согласно современному представлению о механизме действия фермента, существует взаимодействие обоих ионов металла друг с другом в каталитическом акте [43-46].

В реакции гидролиза ФОС а-ион участвует в процессе активации молекулы воды, необходимой для осуществления нуклеофильной атаки фосфорного центра субстрата, второй отвечает за поляризацию связи Р=0 в субстрате при образовании фермент-субстратного комплекса. Сравнения ЭПР-спектров кристаллов ОРН, кристаллов комплексов ОРН с ингибиторами (диизопропил-метил-фосфонатом и триэтил-фосфатом), а также кристаллов комплексов ОРН с продуктом гидролиза ФОС (диэтил-фосфатом), все кристаллы получены при рН 8,0, подтвердили данное предположение [47].

Реактивы

Параоксон (Sigma) - препарат перед использованием очищался следующим образом: 1 мл препарата растворяли в 250 мл дихлорметана, продукты гидролиза экстрагировали ЮмМ CHES буфером (рН 9,0), отделяли органическую фазу, добавляли осушитель - MgSC 4 и отфильтровывали. Дихлорметан упаривали на роторном испарителе. Очищенный параоксон растворяли в бидистилированной воде до концентрации 1-10" М. Полученный раствор хранили при температуре 0 - 4 С.

Органические растворители: этанол, этилацетат - препараты марки ч.д.а. («Реахим»), дихлорметан - препарат марки х.ч. («Реахим») использовались без дополнительной очистки.

Имидазол (Sigma) использовался без дополнительной очистки;

CHES (2-р Г-циклогексиламино]этансульфоновая кислота, рКа 9,3), буферное вещество (Sigma);

TRIS (Трис[гидроксиметил]аминометан, рКа 8,1), буферное вещество (ICN Pharmaceuticals);

гидр оксид калия, препарат марки ч.д.а. (Reanal);

гидроксид калия, препарат марки ч.д.а. (Reanal);

карбонат натрия кислый, препарат марки ч.д.а. («Реахим»);

фосфаты натрия, калия одно- и двузамещенные. препараты марки ч.д.а. («Реахим»);

перфтордекалин. препарат марки ч.д.а. («Реахим»);

хлорид кобальта шести водный (Sigma);

акрил амид, бис акрил амид (Merck);

агароза (Bio-Rad);

этилендиаминтетрауксусная кислота ОПТА) (Merck);

бромистый этидий (Sigma):

глицерин (Sigma);

бромфеноловый синий (Sigma);

триптон. дрожжевой экстракт (Difco);

додецилсульфат натрия (ДСН), препарат марки ч.д.а. (Reanal);

N.N.N ,N -тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), препарат марки ч.д.а. (Reanal);

изопропил-В-Р-тио-галактопиранозид (ИГТГГ) (Serva);

дезоксинуклеозидтрифосфаты, дидезоксинуклеозидтрифосфаты. (Fermentas);

DEAE NA - 45 мембрана (мембрана, изготовленная на основе целлюлозы,

модифицированной путем замены некоторых гидроксильных групп

диэтиламиноэтильньши радикалами) (Schleicher and Schuell);

краситель кумасси Brilliant blue R (Sigma);

Маркеры молекулярного веса для белкового электрофореза (Fermentas - набор белков с молекулярными массами 14,4; 18,4; 25,0; 35,0; 45,0; 66,2; 116,0 кДа или 26,0; 34,0; 43,0; 55,0; 72,0; 95,0; 130,0 кДа);

ДНК-маркеры молекулярного веса (Fermentas);

Макропористые носители IDA крио-ПААГ для металл-хелатирующей хроматографии бьши любезно предоставлен проф. Бо Маттиассоном (Университет Лунда, Швеция).

Все остальные реактивы марки ч.д.а были приобретены в фирмах "Лабтехника" и «Химмед».

Эндонуклеазы рестрикции: ВатШ, Sad, Nhe\, Sail, ДНК - лигаза фага Т4 (1 ед/мкл) (Fermentas),

ДНК-полимераза фага Т7 (Apbiotech).

Бактериальные штаммы

В работе использовались следующие генно-инженерные штаммы Е. coli:

XLl-Blue: F proAB ladqA(lacZ)M15 Tnl 0(tef)/recAl endA2 gyrA96(Nalr) thil hsdR17(r"km+k) supE44 relAl lac

DH5a: F" ( P80dA(lacZ)Ml 5) recAl endAl gyrA96 thil hsdR17(fkm+k) supE44 relAl deoR A(lacZYA-argF) U169

SG13009[pREP4]: Nals Str5 rif, lac" ага" gal" mtl" F" recA+ uvr+

Питательные среды

В работе использовались стандартные питательные среды LB и TYE. При выращивании устойчивых к антибиотику клеток в среду добавляли ампициллин до концентрации 70 - 100 мкл/мл. Агаризованные питательные среды содержали 1,7% бакто агара.

Состав среды LB:

триптон -10,0 г/л

дрожжевой экстракт- 5,0 г/л NaCl-10,0 г/л Состав среды TYE: триптон -12,0 г/л дрожжевой экстракт — 24,0 г/л глицерин - 4,0 мл/л КН2Р04 - 6,95 г/л К2НР04 3 Н20- 12,54 г/л рН среды 7,0

Создание гибридных белков, имеющих в своем составе флуоресцентный белок и фермент ОРН

К началу данной работы были проведены предварительные эксперименты, целью которых было исследование влияния длины спейсера между молекулами белков в составе гибридного белка с ОРН на уровень синтеза гибридного белка в клетках и его свойства.

Были созданы гибридные белки, имеющие в своем составе молекулы ОРН и флуоресцентного белка e-pHs, соединенные аминокислотными спейсерами -RS- или -GRGGPGGGGR-. Был проведен синтез данных гибридных белков в клетках Е. coli различных штаммов. Клетки проявляли флуоресцентные свойства под действием ультрафиолетового света, что свидетельствовало о накоплении в них гибридных белков.

Однако, при культивировании клеток Е. coli, осуществлявших синтез данных белков, даже в относительно «мягких» условиях (26С, 0,10 мМ ИГПТ в среде культивирования), органофосфатгидролазную активность по параоксону на клеточном уровне зафиксировать не удавалось.

Моделирование структур полученных белков методами молекулярной динамики (МД) показало, что в молекуле гибридного белка His6-e-pHs-RS-OPH происходит сильное искажение третичной структуры белковой глобулы ОРН, возникающее в результате влияния молекулы e-pHs, усиленное недостаточной длиной межмолекулярного спейсера. Очевидно, что двух аминокислотных остатков, находящихся в составе спейсера между молекулами белков, было недостаточно для сохранения высокой каталитической активности ОРН. С другой стороны, анализ оптимизированной структуры белка Hise-e-pHs-GRGGPGGGGR-OPH показал, что молекулы белков, находящихся в составе гибрида сближаются до контакта поверхностями своих глобул, что вызывает изменение их конформаций.

В рамках данной работы было решено использовать такие межмолекулярные спейсеры, которые бы с одной стороны, удерживали молекулы белков на расстоянии друг от друга, а с другой, обладали достаточной гибкостью, чтобы вызывать минимум искажений в конформациях белковых глобул.

Анализ литературных данных, описывающих результаты исследований гибридных белков, имеющих в своем составе различные межмолекулярные спейсеры, показал, что, например, спейсер состава -PASASASASPGS- формирует свободную структуру (петлю) [210]. С другой стороны, многократно повторяющееся сочетание аминокислотных остатков Arg и Ala приводит к образованию устойчивой а-спирали [211-212]. Вместе с этим анализ известных результатов показал, что исследование влияния различных по свойствам межмолекулярных спейсеров на эффективность синтеза полученных с их использованием белков в клетках Е. coli, а также на свойства гибридных белков, несомненно, представляет большой научный и практический интерес.

В данной работе для создания гибридных белков, состоящих из молекул ОРН и deGFP4, было решено использовать спейсеры -(RA)s- и -(AS)5-

Похожие диссертации на Получение растворимой формы белков с активностью органофосфатгидролазы

Изучение роли алкилоксибензолов в стабилизации и модуляции активности ферментных белковМартиросова Елена Игоревна

Разработка технологии получения и исследование биологической активности меланинсодержащих препаратовСкорбина Елена Александровна

Использование соевого шрота для получения биологически активных веществ и оценка их функциональной активностиХабибулина, Наталья Викторовна

Химический состав и биологическая активность пантов, вторичного сырья пантового оленеводства и их использование в технологии получения кормовых добавокИванкина Наталья Федоровна

Химический состав и биологическая активность пантов, вторичного сырья пантового оленеводства и их использование в технологии получения кормовых добавок Иванкина Наталья Фёдоровна

Получение биорегулятора из лимфатических узлов крупного рогатого скота и характеристика его иммунобиологической активности Битуева Анна Викторовна

Технология получения биопрепаратов растительного происхождения на основе методов культивирования тканей и исследование их биологической активностиМазницына Любовь Васильевна

Совершенствование и применение метода культуры ткани для получения форм ярового ячменя, устойчивых к кислым почвам Шуплецова Ольга Наумовна

Технология получения таблетированной формы препарата "биоспорин" для энтерального примененияСкворцов Андрей Эдуардович

Использование методов биотехнологии в получении исходных форм моркови, устойчивых к патогенному грибу Alternaria radicina M., Dr. Et E.Раскалиева Велина Абдрахмановна