Введение к работе
Актуальность проблемы. Ферментные белки являются одними из наиболее эффективных участников технологий в пищевой промышленности, в производстве премиксов, фармацевтических препаратов, в кожевенной, текстильной и других отраслях промышленности. Однако, невысокая стабильность белковых макромолекул, ограничивает область их практического применения, что диктует необходимость стабилизации ферментов. Другой фундаментальной проблемой современной биотехнологии, решения которой востребованы практикой, является целенаправленное изменение функциональной активности ферментных белков в сторону, как повышения, так и понижения их активности.
В последние годы большое внимание уделяется стабилизации белковых молекул с помощью химических шаперонов (ХШ), представленных низкомолекулярными соединениями, выполняющими такую же функцию, что и молекулярные шапероны [Welch, Brown, 1996; Tatzelt et al., 1996]. В отличие от молекулярных, химические шапероны стабилизируют белки неспецифически к структуре макромолекул в их совместных комплексах, образующихся за счет слабых взаимодействий (гидрофобных, ван-дер-ваальсовых, водородных связей). К наиболее изученным химическим шаперонам относятся глицерин, некоторые аминокислоты, сахара (трегалоза), многоатомные спирты. Химическими шаперонами являются и алкилированные оксибензолы (АОБ), что было обнаружено при изучении механизмов действия микробных ауторегуляторных факторов d\ (фсії) - аутоиндукторов анабиоза, представленных у ряда бактерий и дрожжей алкилоксибензолами [Беспалов с соавт., 2000; Колпаков с соавт., 2000], и участвующих в развитии стрессового ответа клетки [Ильинская с соавт., 2000] и образовании покоящихся форм [Мулюкин с соавт., 1996]. Важным свойством АОБ является показанная для одного из гомологов - С12-АОБ, способность повышать устойчивость модельных ферментов к рН-, UF-, Т-воздействиям [Колпаков с соавт., 2000]. Однако, как правило, стабилизация белка сопровождается ингибированием его каталитической активности [Goller, Galinski, 1999]. Поэтому, разработка приемов и выяснение молекулярных механизмов модификации ферментных белков, приводящей к их функциональной стабилизации одновременно с направленным изменением каталитической активности (стимуляция -ингибирование), представляет фундаментальный интерес и имеет важное практическое значение.
Цель работы — изучить роль алкилоксибензолов - химических аналогов микробных ауторегуляторных факторов d\, в процессах стабилизации и модуляции
активности ферментных белков и разработать приемы модификации ферментов в промышленных препаратах. Задачи исследований
Изучить эффекты взаимодействия индивидуальных модельных ферментов с гомологами и изомерами алкилоксибензолов (С7-АОБ, С12-АОБ и тирозолом) как химическими шаперонами.
Разработать приемы модификации алкилоксибензолами ферментных белков в промышленных препаратах с целью их стабилизации и направленной регуляции активности.
3. Изучить механизмы действия АОБ в процессах модификации структуры
белков.
Научная новизна
1. В опытах in vitro впервые показана способность химических аналогов фсіі
(С7-АОБ, С12-АОБ и тирозола) направленно модифицировать структуру ферментных
белков, что приводит к повышению их функциональной стабильности и изменению
каталитической активности в сторону, как активации, так и ингибирования.
Установлено, что вектор изменения каталитической активности модифицированных
АОБ ферментных белков зависит от структуры и концентрации АОБ как модификатора.
2. Показано эффективное модифицирующее действие АОБ на
концентрированные (жидкие) промышленные ферментные препараты, обеспечивающее
повышение их устойчивости к тепловой денатурации и стимуляцию каталитической
активности в широком диапазоне рН и температур.
3. Обнаружено, что структурно различающиеся гомологи АОБ по-разному
влияют на характер изменений каталитической активности белков и их
физико-химические свойства, такие как вязкость, набухание, взаимодействие с водным
окружением. Выявлена корреляция между изменением степени гидрофобности
модифицированных алкилоксибензолами ферментных белков и модуляцией их
активности.
4. На основании данных динамики и внутримолекулярной реорганизации белков
(лизоцима), модифицированных АОБ, предложены гипотезы, объясняющие изменение
активности и стабилизацию ферментов в их комплексах с АОБ.
Практическая ценность работы
1. Разработан способ стабилизации и направленной модуляции каталитической активности ферментов для сухих и жидких промышленных препаратов, основанный на
использовании алкилоксибензолов в качестве структурных модификаторов белков. Способ позволяет увеличить скорость катализа и глубину превращения промышленных полимерных субстратов (крахмала, углеводных полимеров солода, казеина), а также повысить каталитическую активность в широком диапазоне рН и температур. Предложен прием эффективной модификации концентрированных ферментных препаратов алкилоксибензолами за счет дробного внесения АОБ.
2. На основе использования С12-АОБ предложен способ ингибирования
ферментативной активности для производств, включающих стадии консервации, в
частности, таких как прекращение брожения при производстве пива, кумыса, кваса и др.
3. Полученные в работе результаты могут быть использованы для: оптимизации
технологий получения высокоактивных и стабильных препаратов ферментов;
повышения эффективности производств, основанных на ферментативных процессах;
разработки эффективных способов защиты материалов от микробных биоповреждений,
а также для консервации.
Апробация работы и публикации. Результаты работы были представлены на 3-ей Международной конференции по стабилизации белка «Biocatalyst stability» (Тулуза, Франция, 2002); 1-ом и 2-ом Международных конгрессах «Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003); Всероссийской научно-технической конференции-выставке «Высокоэффективные пищевые технологии, методы и средства для их реализации» (Москва, 2003); 2-ой Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь-Казань-Пермь, 2005); Всероссийской Молодежной школе-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2005). По материалам диссертации опубликовано 10 работ, из них 4 статьи и 6 тезисов.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка литературы, включающего 186 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 5 таблицами и 43 рисунками.
