Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время трансгенные растения широко используются как модели для изучения фундаментальных исследований по изучению физиологической роли растительных генов и для решения прикладных задач по созданию устойчивых форм сельскохозяйственных культур, а также для продукции рекомбинантных белков в растениях. Успех в этих направлениях, прежде всего, связан с эффективностью экспрессии перенесенного гена (трансгена) в растениях. Эффективность экспрессии трансгена обуславливается рядом факторов: кодоновым составом трансгена; регуляторными элементами, контролирующими его экспрессию; интеграцией трансгена в определенные участки генома растений и рядом других. Сейчас, помимо стабильной экспрессии целевых генов исследователями широко используется транзиентная экспрессия этих генов как эффективный подход для изучения регуляторных элементов и физиологической роли генов растений, а также для использования растений как продуцентов целевых белков. При транзиентной экспрессии с использованием агробактерий, в основном, используют обычные экспрессионные векторы, полученные на основе бинарных Ti-плазмид, которые, помимо целевого гена содержат и селективные гены. Для преодоления эффекта «замолкания» трансгена исследователи используют подход, основанный на ко-трансформации растений вектором, несущий ген белка р19 вируса томатов, супрессор посттранскрипционного замолкания генов. Несмотря на значительные успехи в области создания и изучения трансгенных растений, наши познания в отношении генетических факторов, которые оказывают влияние на эффективность экспрессии генов в растениях, еще весьма ограничены. Следует подчеркнуть, что решение важных научных и прикладных задач с использованием экспрессии гетерологичных генов в растениях затруднено, прежде всего, за счет значительных пробелов в понимании генетических детерминант, которые обуславливают эффективную экспрессию гетерологичных генов в растениях. Следует также отметить, что важную роль в исследованиях по созданию и изучению трансгенных растений играют экспрессионные вектора, используемые для трансформации растений. Сейчас предложены и используются целый спектр экспрессионных векторов для трансформации растений, однако, наряду с преимущества эти вектора имеют и недостатки, которые могут сказаться на эффективности экспрессии трансгена.
Цель исследования: провести сравнительное изучение экспрессии гетерологичных генов в растениях различных родов и выяснить, какие генетические детерминанты являются ключевыми в обеспечении эффективности экспрессии гетерологичных генов в растениях.
Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:
-
Провести поиск генетических детерминант, которые потенциально способны влиять на уровень экспрессии гетерологичных генов с использованием биоинформатических подходов.
-
Провести модификацию нуклеотидных последовательностей модельных генов и клонирование новых регуляторных элементов.
-
Сконструировать серию модульных экспрессионных векторов дл изучения экспрессии гетерологичных генов в растениях.
-
Провести апробацию модульных векторов, в которых экспрессия модельных генов с различным кодоновым составом контролируется различными регуляторными элементами.
Научная новизна работы. Проведен сравнительный анализ генетических детерминант, которые потенциально способны влиять на уровень экспрессии гетерологичных генов в растениях. Впервые экспериментально показано, что GC-богатые последовательности в 5’-концевой области генов вносят значительный вклад в уровень экспрессии гетерологичных генов в растениях. Показана возможность достоверного увеличения экспрессии гетерологичных генов за счет использования лидерных сигналов транспорта и локализации их белковых продуктов в эндоплазматическом ретикулуме. Показана взаимосвязь между кодоновым составом гетерологичных генов и уровнем их экспрессии в растительных клетках.
Апробация результатов работы. Результаты проведенных исследований были представлены на международных и российских конференциях: Международная научная конференция «Генетика и биотехнология на рубеже тысячелетий» (Минск, 2010), III Всероссийский симпозиум «Физиология трансгенного растения и проблемы биобезопасности» (Москва, 2010), 2-я Международная школа-конференция молодых ученых «Генетика и селекция растений, основанная на современных генетических знаниях и технологиях» (Звенигород, 2011), International conference «Plant Transformation Technologies II» (Vienna, 2011); конференция «Современные аспекты генетической инженерии растений» (Киев, 2011); 12-я научная конференция молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2012); Международная научная конференция «Генетика и биотехнология XXI века: проблемы, достижения, перспективы» (Минск, 2012).
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, а также выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, включая 12 таблиц и 60 рисунков. Список цитируемых литературных источников включает 269 наименований.
