Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12
1.1. Классификация методов иммобилизации биологически активных веществ 12
1.2. Липосомы 14
1.3. Микрокапсулы 16
1.3.1. Основные преимущества и недостатки процесса микрокапсулирования 18
1.3.2. Полимерные материалы для микрокапсулирования биологически активных веществ 19
1.3.3. Методы микрокапсулирования биологически активных веществ 23
1.3.3.1. Физические методы микрокапсулирования 23
1.3.3.1.1. Напыление в псевдоожиженном слое 23
1.3.3.1.2. Микрокапсулирование экструзией 24
1.3.3.1.3. Микрокапсулирование путем конденсации паров 25
1.3.3.2. Химические методы микрокапсулирования 25
1.3.3.2.1. Микрокапсулирование поликонденсацией 26
1.3.3.2.2. Метод полимеризации 27
1.3.3.2.3. Дубление мембран микрокапсул 28
1.3.3.3. Аэрозольный метод микрокапсулирования 29
1.3.3.4. Физико-химические методы микрокапсулирования 30
1.3.3.4.1. Методы эмульгирования 30
1.3.3.4.2. Микрокапсулирование в расплавы 31
1.3.3.4.3. Высушивание распылением 31
1.3.3.4.4. Методы основанные на простой и сложной коацервации 32
1.4. Полиэлектролитные микрокапсулы, полученные методом послойной адсорбции 33
1.4.1. Интерполиэлектролитные комплексы 33
1.4.2. Интерполиэлектролитные комплексы для микрокапсулирования биологически активных веществ 35
1.4.3. Подбор полиэлектролитов для формирования микрокапсул 36
1.4.4. Технология послойной адсорбции полиэлектролитов 39
1.4.5. Формирование полых микрокапсул 41
1.4.6. Полиэлектролитные микрокапсулы как способы доставки биологически активных веществ 44
1.4.6.1. Инкапсулирование высомолекулярных биологически активных веществ 44
1.4.6.2. Некоторые подходы к регулированию выхода биологически активных веществ из микрокапсул 45
1.4.6.2.1. Ферментативная деструкция полиэлектролитных микрокапсул 47
1.5. Заключение 51
Глава 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 52
2.1. Материалы и реагенты 52
2.2. Методы 53
2.2.1. Получение микрокапсул методом простой коацервации. 53
2.2.2. Получение СаСОз микрочастиц 53
2.2.3. Включение биологически активных веществ в СаСОз микрочастицы методом сорбции в порах 54
2.2.3.1. Включение химотрипсина 54
2.2.3.2. Включение экстрактов подорожника и календулы 54
2.2.4. Включение биологически активных веществ в СаСОз микрочастицы методом соосаждения 55
2.2.4.1. Включение проназы 55
2.2.4.2. Включение ДНК и проназы 55
2.2.4.3. Включение экстрактов подорожника и календулы 55
2.2.5. Получение микрокапсул методом послойной адсорбции 56
2.2.6. Определение содержания биологически активных веществ в микрокапсулах и в растворах 57
2.2.6.1. Определение проназы 57
2.2.6.2. Определение ДНК 57
2.2.6.3. Определение химотрипсина 57
2.2.6.4. Определение экстрактов подорожника и календулы 58
2.2.7. Измерение эстеразной активности химотрипсина 58
2.2.8. Получение полиэлектролитов и белков, меченных флуоресцентной меткой 58
2.2.9. Изучение кинетики выхода биологически активных веществ из микрокапсул 59
2.2.9.1. Выход ДНК 59
2.2.9.2. Выход химотрипсина 59
2.2.9.3. Выход экстрактов подорожника и календулы 60
2.2.10. Исследование времени деструкции (PAsp/PArg)3PAsp микрокапсул 60
2.2.11. Исследование морфологии (PAsp/PArg)3PAsp микрокапсул...61
2.2.12. Измерение Z-потенциала СаС03 микрочастиц 61
2.2.13. Исследование распределения микрочастиц по размерам 61
2.2.14. Исследование эффектов инкапсулированных экстрактов на процесс заживления язвы желудка у крыс 62
Глава 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 63
3.1. Получение и исследование микрокапсул полученных методом простой коацервации 63
3.2. Получение и исследование микрокапсул полученных методом послойной адсорбции 69
3.2.1. Основные принципы конструирования биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул 69
3.2.2. Подходы к биодеструкции микрокапсул 73
3.2.2.1. Выбор полиэлектролитов 75
3.2.2.2. Выбор ферментов для разрушения мембраны микрокапсул 78
3.2.3. Получение и исследование микрокапсул на основе полипептидов с включенной в них ДНК 82.
3.2.3.1. Включение ДНК в PAsp/PArg микрокапсулы 82
3.2.3.2. Исследование деструкции полипептидных микрокапсул под действием инкапсулированной проназы 84
3.2.3.3. Исследование кинетики выхода ДНК из микрокапсул 89
3.2.4. Получение и исследование микрокапсул на основе полипептидов и полисахаридов с включенным в них белком 91
3.2.4.1. Включение химотрипсина в Alg/PLL микрокапсулы 91
3.2.4.2. Изучение активности инкапсулированного химотрипсина.93
3.2.4.3. Исследование кинетики выхода химотрипсина из микрокапсул 95
3.2.5. Получение и исследование микрокапсул на основе полисахаридов с включенным в них биологически активными веществами лекарственных растений 97
3.2.5.1. Включение экстрактов подорожника и календулы в Хит/Кар микрокапсулы 97
3.2.5.2. Исследование кинетики выхода экстрактов подорожника
и календулы 99
3.2.5.3. Исследование возможности использования Хит/Кар
микрокапсул для репарации тканей 100
ВЫВОДЫ 105
БЛАГОДАРНОСТИ 107
ЛИТЕРАТУРА 108
- Классификация методов иммобилизации биологически активных веществ
- Материалы и реагенты
- Получение и исследование микрокапсул полученных методом простой коацервации
Введение к работе
Сегодня трудно назвать область науки или производства, где микро- и нанотехнологии не нашли бы своего применения или эффективность их использования не была бы очевидна или принципиально доказана. Нанобиотехнологии все более широко используются в биотехнологии и биомедицине. В биомедицине особое внимание уделяется нано- и микрокапсулам. Это связано с тем, что микрокапсулирование позволяет:
защитить биологически активные вещества (БАВ), такие как витамины, антибиотики, ферменты, вакцины и др. от окисления под воздействием внешней среды;
Классификация методов иммобилизации биологически активных веществ
Физические методы иммобилизации БАВ реализуются посредством адсорбции фермента на нерастворимом носителе, путем включения биоактивных соединений в поры поперечносшитого геля, в полупроницаемые структуры или двухфазные системы.
При адсорбционной иммобилизации БАВ удерживается на поверхности носителя за счет электростатических, гидрофобных, дисперсионных взаимодействий и водородных связей. Последние применяются наиболее часто. Эффективность адсорбции молекулы белка на носителе определяется удельной поверхностью (плотностью центров сорбции) и пористостью носителя. К недостаткам адсорбционного метода следует отнести невысокую прочность связывания БАВ с носителем. При изменении условий иммобилизации может происходить десорбция вещества.
Способ иммобилизации БАВ путем включения в трехмерную структуру полимерного геля широко распространен благодаря своей простоте и универсальности. Иммобилизацию в геле осуществляют двумя способами. В первом случае БАВ вводят в водный раствор мономера, а затем проводят полимеризацию, в результате которой возникает пространственная структура полимерного геля с включенными в его ячейки молекулами биоактивного соединения. Во втором случае БАВ вносят в раствор уже готового полимера, который впоследствии переводят в гелеобразное состояние. Иммобилизация БАВ в гелях обеспечивает равномерное распределение вещества в объеме носителя. Большинство гелевых матриц обладает высокой механической, химической, тепловой и биологической стойкостью и обеспечивает возможность многократного использования иммобилизованного препарата на их основе. Основным недостатком этого метода является то, что в некоторых случаях полимерная матрица создает значительное препятствие для диффузии субстрата к БАВ, снижая эффективность действия иммобилизованного препарата. Если подобным способом производят иммобилизацию ферментов, то данное обстоятельство может приводить к снижению эффективности использования препарата.
Сущность иммобилизации в полупроницаемые мембраны заключается в отделении раствора БАВ от окружающей среды с помощью полупроницаемой мембраны. Разработано несколько модификаций этого метода, из которых особый интерес представляют микрокапсулирование и включение БАВ в липосомы.
Материалы и реагенты
Водный раствор метилцеллюлозы (30 мл, 1-2,5%) и 0,3-1,5 г ацетилсалициловой кислоты (АК) перемешивали при помощи гомогенизатора (200-600 мин-1, 10 мин). В полученный раствор добавляли 5 мл рапсового масла. Через 30 минут реакционную смесь нагревали на водяной бане до 80 С при непрерывном перемешивании в течение 5 мин Процесс нагревания повторяли 3 раза с промежутками 30 сек. Затем раствор охлаждали до комнатной температуры, обрабатывали 10 мл ацетона и перемешивали в течение 1 час. Далее микрокапсулы отфильтровывали, промывали водой и хранили в виде суспензии в воде при 4С.
Получение и исследование микрокапсул полученных методом простой коацервации
Известно, что для бинарной системы, расслаивающейся на равновесные фазы, возможны три способа образования новой фазы из раствора, а именно путем:
1. изменения температуры;
2. удаления одного из компонентов;
3. введения другого компонента.
Процесс микрокапсулирования методом разделения фаз состоит из следующих этапов: создание двухфазной системы, состоящей из диспергированного капсулируемого вещества в растворе полимера;
- образование трехфазной системы, состоящей кроме диспергированной фазы капсулированного вещества еще из двух фаз, находящихся в равновесии, одна из которых обогащена полимером;
- образование полимерной оболочки вокруг частиц мелкодисперсной капсулируемой фазы;
- отверждение оболочки и отделение конечного продукта.
В данной работе, основываясь на явлении образования новой фазы путем изменения температуры системы, был разработан способ получения микрокапсул с включенными в них БАВ. В основу метода положен процесс микрокапсулирования посредством эмульгирования БАВ в растворе полимера.
В последнее время особое внимание исследователей привлекают так называемые «умные» (smart) полимеры, которые способны изменять свои свойства в ответ на сигнал окружающей среды. При внешнем воздействии (рН, температура, химический сигнал, электрическое поле и др.) микроструктура таких полимеров быстро и обратимо меняется от гидрофильного до гидрофобного состояния. Особенно интересны водорастворимые полимеры, чувствительные к изменению температуры или рН в физиологическом интервале, поскольку из свойства идеально подходят для иммобилизации различных БАВ.
В данной работе для получения микрокапсул с включенными в них БАВ, использовали термочувствительный полимер - метилцеллюлозу (МЦ). Осаждение полимера достигается нагреванием системы выше нижней критической температуры растворения (НКТР) МЦ. Разделении фаз в системе с НКТР происходит при повышении температуры. Раствор МЦ в воде имеет НКТР - 59,5 С. Вследствие этого повышение температуры выше указанного значения приводит к осаждению полимера на поверхности образующихся при диспергировании капсулируемого вещества микрокапсул.
Похожие диссертации на Получение и исследование биодеградируемых полиэлектролитных микрокапсул с контролируемым выходом белков, ДНК и других биоактивных соединений
