Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 10
1.1. Источники получения растительных белков 10
1.2. Применение сои в народном хозяйстве 13
1.3. Характеристика и биологические свойства сои 17
1.4. Основные технологические приемы получения белковых препаратов на основе сои 23
1.4.1. Способы получения белковых изолятов 26
1.4.2. Способы получения белковых концентратов 29
1.4.3. Технологии переработки обезжиренной соевой муки 33
1.4.4. Получение углеводов на основе сои 35
1.5. Общие вопросы и проблемы очистка сточных вод от белковых веществ. Методы, применяемые для очистки сточных вод 35
1.5.1. Общие вопросы и проблемы очистка сточных вод от белковых веществ в пищевой и соеперерабатывающей промышленности 35
1.5.2. Методы, применяемые для очистки сточных вод пищевой промышленности 37
1.5.2.1. Флотация 37
1.5.2.2. Мембранные процессы 38
1.5.2.3. Ионообменные процессы 39
1.5.2.4. Адсорбционные процессы 40
1.5.2.5. Биологические методы очистки 42
1.5.3. Современные способы извлечения белковых веществ из сточных вод,
применяемые в промышленности 43
ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 47
2.1. Объекты исследования 47
2.2. Реагенты 47
2.3. Методы анализа 48
2.3.1. Количественное определение азотосодержающих веществ в белковых растворах 48
2.3.2. Определение влажности сухой биомассы 50
2.3.3 Метод определения общего содержания углеводов в фенол-серной реакции (метод Дюбуа) 50
2.3.4. Определение доли растворимого белка в белковых препаратах (N81) ....50
2.3.5. Определение эмульсионных свойств. Жироэмульгирующая способность
(ЖЭС) 51
2.3.6 Определение жироудерживающей способности (ЖУС) 52
2.4. Методы исследования 52
2.4.1. Методика проведения экстракции белковых веществ из белого лепестка сои 52
2.4.2. Методика проведения процесса ультрафильтрации на ячейках с промышленными ультрафильтрами 53
2.4.3. Методика проведения осаждения белковых веществ из водных и водно- спиртовых растворов 55
2.4.4. Методика проведения процесса молекулярно-ситовой хроматографии...56
2.4.5. Методика процесса осаждения белкового изолята в ИЭТ 57
2.4.6. Методика определения токсичности с применением тест-культуры инфузорий Те1гаИутепа руг1/огт1$ 57
2.4.7. Методика выделения углеводов методом ионного обмена 59
2.4.8. Метод определения содержания углеводов тонкослойной хроматографией
на силикагеле 60
ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 62
3.1. Разработка технологии получения белковых изолятов из белого лепестка сои 62
3.1.1. Исследование количественных закономерностей процесса экстракции белковых веществ 64
3.1.2. Исследование процесса ультраконцентрирования белкового экстракта...73
3.1.3. Исследование процесса осаждения белкового изолята в ИЭТ 79
3.1.4. Выбор оптимальной схемы очистки белкового изолята 83
3.1.5. Анализ полученных белковых изолятов на острую токсичность, ЖУС и ЖЭС 85
3.2. Разработка путей утилизации стоков производства белкового изолята 87
3.3. Исследование процесса получения углеводов из депротеинизированного белого лепестка сои 98
3.3.1. Исследование процесса ферментативного гидролиза депротеинизированного белого лепестка 98
3.3.2. Исследование процесса осаждения стахиозы 101
ВЫВОДЫ 108
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 110
ПРИЛОЖЕНИЕ 123
Приложение 1 123
Материальный баланс переработки белого лепестка 123
Приложение 2 137
Расчет технико-экономических показателей разработанной технологии получения белкового изолята из БЛ сои 137
Приложение 3 150
Расчет предотвращенного экологического ущерба 150
- Источники получения растительных белков
- Объекты исследования
- Разработка технологии получения белковых изолятов из белого лепестка сои
Введение к работе
В настоящее время одной из наиболее актуальных проблем является продовольственная. Важнейшим из компонентов питания, составляющих основу процессов жизнедеятельности человека, является белок. Увеличение спроса на белки для питания человека происходит в соответствии с общей концепцией повышения уровня жизни. По данным ВОЗ более 60 % человечества питается неудовлетворительно, не получая, в частности, достаточного количества белка.
Недостаток белков в питании нарушает динамическое равновесие метаболических процессов с участием белков, сдвигая его в сторону преобладания распада собственных белков клетки, что приводит к истощению организма. В связи с этим особую значимость приобретают вопросы обеспечения населения белковыми компонентами питания, а также приоритет исследований в этом направлении, подтверждаемый разработкой и осуществлением специальных программ в промышленно-развитых странах мира [2].
Одним из путей решения проблемы дефицита белка является разработка новых технологий получения пищевого белка из возобновляемого сырья, мало используемого в процессе получения продуктов питания: жмыхи и шроты масличных и бобовых культур, зеленая масса растений, перья птиц, шерсть, внутренности рыб [3].
Одним из перспективных источников белка является растительное сырьё, прежде всего злаковые, масличные, бобовые культуры, биомасса зеленых растений, а также соевые бобы, аминокислотный состав белка которых наиболее близок к животному белку. Благодаря уникальному составу, (около 40 % протеинов и 20 % жира), оптимальному соотношению аминокислот, содержанию витаминов,'микро- и макроэлементов, полиненасыщенных жирных кислот и отсутствию холестерина продукты на основе сои являются лечебно- профилактическими [12].
Для их получения чаще всего используется белый лепесток — полупродукт, получаемый после отжима соевого масла. Известные из литературы технологии переработки сои предполагают получение главным образом белковых концентратов и изолятов.
Однако в первом случае получаемый продукт содержит низкомолекулярные пептиды, что ухудшает его качество, а во — втором образуется значительное количество отходов, которые не могут быть непосредственно утилизированы на традиционных очистных сооружениях.
Анализ мировой практики использования соевых бобов показывает, что имеется несколько крупных секторов их потребления: производство растительного масла, кормов, белковых продуктов питания. Кроме того, соевые белковые концентраты и изоляты могут использоваться в качестве ингредиентов в производстве традиционных белковых продуктов питания [48].
Помимо белковых веществ, соевые бобы содержат углеводы, такие как глюкоза - 0,01%, фруктоза (моно-) - 0,55%, сахароза (ди-) - 5,]%,- раффиноза (три-) - 1,58%), стахиоза (тетра-) - 3,0%, а также полисахариды (крахмал и др.) и нерастворимые структурные полисахариды (гемицеллюлозы, пектиновые вещества) - 14,1% [30]. Среди перечисленных углеводов раффиноза и стахиоза представляют наибольший практический интерес, поскольку используются в спортивном питании, а также в качестве заменителей сахара в диабетическом питании [12].
Целью настоящей работы явилась разработка основ технологии получения веществ белковой и углеводной природы из белого лепестка сои.
В задачи работы входило;
изучить количественные закономерности процессов экстракции белковых веществ из белого лепестка сои; ультраконцентрирования полученных экстрактов; осаждения ВМФ белка в изоэлектрической точке;
установить оптимальные условия обработки белого лепестка различными экстрагентами, что обеспечило бы максимальный выход ВМФ белка; подобрать
оптимальные условия выделения и очистки белкового изолята методами осаждения из водных и водно-спиртовых растворов, а также диафильтрации, что обеспечило бы получение препарата пищевого назначения;
разработать основы технологии получения белкового продукта кормового назначения из белоксодержащих отходов производства изолята;
разработать основы технологии получения раффинозы и стахиозы из депротеинизированного белого лепестка;
провести ориентировочные технико-экономические расчеты для разработанной технологии.
Научная новизна. Показана возможность применения для описания процесса экстракции белка из БЛ сои ранее разработанных кинетических моделей аналогичных процессов для микробного и животного сырья. Подобраны оптимальные условия, обеспечивающие максимальный выход ВМФ белка.
Впервые показана принципиальная возможность получения кормового продукта на основе белоксодержащих отходов производства изолята белка путем сорбции белковых веществ на малорастворимых солях кальция.
Впервые показана принципиальная возможность получения олигосахаридов: стахиозы и раффинозы из депротеинизированного белого лепестка.
Практическая значимость. Разработана принципиальная схема комплексной переработки белого лепестка сои с получением продуктов белковой и углеводной природы: белкового изолята сои, белкового продукта кормового назначения, раффинозы и стахиозы. В результате выход изолята белка, содержащего не менее 90 % основного вещества, составляет более 90 % от содержания сырого протеина в. БЛ, кормового белкового продукта, содержащего 30 % белка, с выходом 10 % от содержания сырого протеина в БЛ, стахиозы и раффинозы, содержащих не менее 90 % основного вещества, с выходом соответственно 63 % и 51 % от их содержания в БЛ.
Показано, что предложенный способ утилизации жидких стоков в кормовой белковый продукт позволил снизить их ХПК в 25 раз.
Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на IV и V международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективны развития» (Москва, март 2008 г.; Москва, март 2009 г.), Международных конференциях «Успехи в химии и химической технологии» (РХТУ им. Д.И. Менделеева, Москва, ноябрь 2007 г.; Москва, ноябрь 2008 г.; Москва, ноябрь 2009 г.)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и 4 тезисов докладов в материалах научных конференций, в том числе 1 статья из списка журналов, рекомендованных ВАК.
Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методик проведения экспериментов и анализов, 3-х глав экспериментальной части, включающей описание результатов и их обсуждение, выводов, списка литературы, приложений. Работа изложена на 150 стр. и содержит 36 рисунков, 48 таблиц. Библиография включает 111 наименований работ, из них 33 иностранных источников.
Источники получения растительных белков
Среди растений семейства бобовых наиболее богата белками соя [17]. Соевый белок отличается наибольшей биологической ценностью, оцениваемой по лизину. В бобах сои содержание последнего составляет 2,1-2,3 %; люпина- 1,5-4,8 %; гороха — 1,5 %. Таким образом, растения семейства бобовых, и в первую очередь соя, являются наиболее перспективным источником белка [46, 47].
Дадим краткую характеристику биологических особенностей сои и областей ее применения.
Применение сои в народном хозяйстве
Как уже упоминалось, соя относится к семейству Бобовые (Fabaceae). В культуре представлена одним видом - Glycine hispida maxim., который делится на 6 подвидов (по В.Б. Енкену). Важнейшими из них являются: маньчжурский {subsp. Manshiwica Епк), свавянский (subsp. Slavonica Kov. Et Pinz), китайский {subsp. Chinensis Епк), индийский {subsp. Indica Епк), корейский {subsp. Korajensis Епк). Большинство возделываемых на территории бывшего СССР сортов сои относится к маньчжурскому подвиду [42].
Соя введена в культуру в Юго-Восточной Азии в глубокой древности - уже в 6 тысячелетии до нашей эры она была известна в Китае. Вплоть до XVII века ее выращивали в основном в Юго-Восточной Азии. В Европу соя завезена лишь в конце XVIII века, а в Америку - в начале XIX. В настоящее время сою культивируют более чем в 60 странах [35, 18]. По площади посева, она занимает 1-ое место среди всех культивируемых бобовых. Около половины всех посевов сои сосредоточено в США. В России эту культуру начали осваивать еще в конце 20-х годов XX века, в настоящее время ее культивируют на Дальнем Востоке, в Ставропольском крае [17].
Соя - теплолюбивое растение, что обусловливает своеобразный ареал ее распространения. Основными производителями сои являются: США (приблизительно 40 % мировой посевной площади и 50 % мирового урожая сои), Бразилия (19 % и 19 % соответственно), Китай (13 % и 8,5 %), Аргентина (10 % и 11 %), Индия (9 % и 3,4 %). В странах Европейского Союза под сою отводится 1,5 % мировой посевной площади и приходится 1 % мирового урожая сои [84, 73].
Соя - важнейшая белково-масличная культура мирового значения. Ее семена содержат в среднем 37-42 % белка, 19-К22 % масла и до 30 % углеводов; вегетативная масса, убранная в фазу налива бобов, богата белками (16-18 %) углеводами и витаминами. По аминокислотному составу белок сои близок к белку куриных яиц, а масло относится к легкоусвояемым и содержит жирные кислоты, не вырабатываемые организмом животных и человека.
Химический состав семян сои отличается благоприятным сочетанием не только протеина и жира, но и наличием биологически активных веществ: фосфатидов (2,5 %), комплексом витаминов, минеральных легкоусвояемых солей (Са, К, Р). Столь богатый набор биологически активных веществ побудил к широкому и универсальному использованию сои для пищевых, кормовых и технических целей [15].
Высока и экономическая эффективность возделывания сои: каждый гектар ее посева при урожае 20-К25 ц/га дает 50(Н700 руб. чистой прибыли. Соя - наиболее дешевый и доступный источник высококачественного белка. Так, если стоимость 1 т белка мясо-костной муки составляет 1220 руб., а рыбной - 1100 руб., то 1 т белка сои стоит лишь 80-И 00 руб. Немаловажно и то, что соевый белок можно получить в хозяйствах, где откармливают животных. Из соевой муки приготовляют искусственное молоко для поросят и телят, которым можно заменить цельное молоко [12, 16, 19].
Велико агротехническое значение сои прежде всего как азотфиксирующей культуры. При инокуляции нитрагином (ризоторфином) в условиях оптимальной влажности она накапливает в почве значительное количество (40 60 кг/га) азота и поэтому является хорошим предшественником зерновых и других небобовых сельскохозяйственных культур. При усиленной фиксации атмосферного азота клубеньковыми бактериями на корнях соя 40 70 % своей потребности в азоте удовлетворяет за счет содержания его в атмосфере. Обладая активной усваивающей способностью корней, соя использует малодоступные и труднорастворимые для злаков минеральные соединения не только из пахотного горизонта, но из более глубоких слоев. Соя может успешно использоваться и в качестве зеленого удобрения [3, 11, 42].
По содержанию лизина соевый белок не уступает сухому молоку и куриному яйцу. Он на 85-90 % растворим в воде и хорошо (80-95 %) усваивается. Глицинии 1устт, основной протеин соевых бобов - по аминокислотному составу близок к аминокислотам мяса) способен створаживаться [77]. По содержанию незаменимых аминокислот (лизин, метионин, триптофан и др.) соевый белок ближе к белкам животного происхождения, поэтому животные и человек легко усваивают такой белок. Высокая растворимость соевого альбумина в воде (до 94 %) делает его легкоусвояемой пищей для людей и ценным кормом для животных и птицы.
Соевые белки (соевые мука, концентраты и изоляты), используемые в качестве добавок в пищевых продуктах, особенно в мясных продуктах, помогают улучшить такие функциональные свойства систем, как связывание воды и структуру. Соевые белковые изоляты с содержанием белка около 92 % лучше удерживают жир и воду и имеют лучшие желирующие свойства, чем другие формы соевых белков. Так как соевые изоляты гидрофильны, они хороши там, где нужно удержать большое количество воды [62, 67, 71].
Соя является также важным масличным растением. В мире ежегодно производится 8,5-9,2 млн. т соевого пищевого масла, которое широко используют для приготовления маргарина, шортингов, майонеза и других высококалорийных продуктов питания [9, 36].
Соевое масло относится к полувысыхающим маслам (йодное число 107-И37 мг Ь/г). Его используют для пищевых и технических целей. В соевом масле преобладают ненасыщенные жирные кислоты — олеиновая (до 25 %), линолевая (43-59 %) и линоленовая (7-ИО %); насыщенных кислот мало — около: 15 %. По питательности и усвояемости оно близко к подсолнечному маслу и почти не уступает коровьему. В соевом масле содержится-много и других полезных веществ — фосфатиды, каротиноиды, витамины и др. Из витаминов в семенах сои содержатся: В] — 11-И 7 мг/кг, В2 — 2,1-2,7 мг/кг, В3 — 13-16 мг/кг, Вб - 4-9 мг/кг, РР - 22-34 мг/кг, Р - 1000-1600 мг/кг, К - 1,5-2,5 мг/кг, С - 100-К200 мг/кг и др. В масле содержание ряда витаминов больше, чем в семенах [10].
Объекты исследования
Определение содержания влаги проводили путем высушивания образца готового продукта в бюксе до постоянной массы в сушильном шкафу при температуре 105±1 С [109].
Содержание влаги (W, мае. %) определяли по формуле: W = [(m, - пъ) х 100] : (m, - m0) (2.5),
где: m0 — масса пустого бюкса, г; mi — масса бюкса с навеской биомассы до высушивания, г; т2 — масса бюкса с навеской после высушивания, г.
. Определение общего содержания углеводов по фенол-серной реакции (метод Дюбуа)
Метод основан на образовании окрашенных или флуоресцирующих продуктов. Производные УВ, образующиеся при нагревании глюкозы с H2SO4 дают с фенолом окрашенное соединение. Пропорциональная зависимость между оптической плотностью и концентрацией соблюдается в пределах 10 100 мкг глюкозы в пробе. Продукт реакции имеет желто-оранжевую окраску с максимумом поглощения при 488 нм [109].
Для построения калибровочного графика использовали стандартные растворы глюкозы в интервале концентраций 10 100 мг/л.
Содержание УВ определяли по формуле:
Сув=а-Р, мл/л (2.6),
где: а — концентрация УВ, найденная по калибровочному графику, мг/л; Р - разведение анализируемого раствора.
Определение доли растворимого белка в белковых препаратах (NSI)
Растворимость белка используется в качестве первичного показателя качества белковых препаратов. Она обуславливает реологические свойства белоксодержащих пищевых систем, устойчивость эмульсий, стабилизированных белком, жироудерживающую способность белковых препаратов.
Навески препаратов массой 0,3 г помещали в химические стаканы емкостью 50-100 мл, добавляли 30 г дистиллированной воды или 2,5 % или 5,0 % раствора хлорида натрия, диспергировали на магнитной мешалке, отбирали нулевые пробы объемом 1 мл и смешивали их с 8 М раствором мочевины в соотношении 1:8. Суспензии перемешивали при температуре 20 С в течение 30 мин. Отбирали пробы объемом 5 мл. Оставшиеся суспензии выдерживали при температуре 74 76 С, перемешивая 15 мин. Затем охлаждали до комнатной температуры и снова отбирали пробы объемом 5 мл. Отобранные пробы суспензий центрифугировали 15 мин при 2500 об/мин, отбирали пробы надосадочной жидкости объемом 4 мл и смешивали их с 8 М раствором мочевины в соотношении 1:1. Спустя сутки определяли оптическую плотность полученных растворов при 280 нм. Растворимость препаратов определяли по отношению оптической плотности надосадочных жидкостей, полученных после центрифугирования проб, к оптической плотности соответствующей нулевой пробы.
Определение эмульсионных свойств. Жироэмульгирующая способность (ЖЭС)
Жироэмульгирующая способность характеризует устойчивость эмульсии.
Исследуемый препарат диспергировали в дистиллированной воде в соотношении 1:5. К полученной суспензии добавляли растительное масло и эмульгировали на гомогенизаторе 2 мин при максимальной скорости вращения (8000-10000 об/мин). Соотношение компонентов в эмульсии препарат:вода:масло составляло 1:5:5. Полученные эмульсии переносили в стеклянные центрифужные пробирки объемом 10 мл (3 параллельные пробы), помещали в термостат с температурой 74-76С и выдерживали 15 мин. Эмульсии охлаждали холодной водой до комнатной температуры и выдерживали 2 ч. Полученные эмульсии центрифугировали 15 мин при 2500 об/мин. Определяли процентное соотношение отделившихся от эмульсии водной и масляной фаз.
При определении эмульгирующих свойств в растворах хлорида натрия вместо дистиллированной воды использовали растворы хлорида натрия с концентрациями 2,5 или 5 %.
Разработка технологии получения белковых изолятов из белого лепестка сои
Ключевой стадией получения белковых изолятов является экстракция белковых веществ из исходного сырья. Согласно литературным данным, для извлечения белка из соевого белого лепестка (БЛ) возможно применение двух методов экстракции — кислотной и щелочной. Каждый из этих способов имеет свои достоинства и недостатки. К недостатку щелочной экстракции относится образование токсичных D-форм аминокислот, а также высокое содержание в экстракте окрашенных соединений, образующихся в ходе реакции Майара [35]. Преимуществом щелочной экстракции является более низкая по сравнению с кислотной степень загрязнения экстракта минеральными примесями. К достоинствам же кислотной экстракции следует отнести меньшую степень деструкции аминокислот и образования токсичных энантиомеров, а также возможность получения менее окрашенных гидролизатов. Поэтому в современных технологиях получения изолятов белка сои используются оба метода, однако, предпочтение отдается щелочной экстракции. В связи с этим представляется целесообразным провести проверку качественных показателей как готовых белковых изолятов, так и полупродуктов, получаемых на отдельных технологических стадиях; разработать эффективные методы очистки белковых изолятов и на основе полученных данных дать рекомендации по оптимальному способу получения белкового изолята.
На первом этапе были изучены количественные закономерности экстракции белков из БЛ. При этом первоначальным критерием выбора оптимального способа экстракции являлся максимальный выход ВМФ белка, поскольку именно на основе ВМФ получают в дальнейшем белковый изолят.
В качестве параметров процесса экстракции были выбраны: температура процесса в интервале 20 - 50 С (при более высоких температурах, как показали предварительные исследования, выход ВМФ белка не превышает 15 — 20 % вследствие ее гидролиза до низкомолекулярных пептидов), рН среды (1-3,911) и время обработки БЛ. Исследовать процесс экстракции в интервале рН 4 — 8 нецелесообразно, т.к. ВМФ белка плохо растворимы в этой области рН. Полученные результаты по исследованию процесса экстракции представлены на рис. 3.1.1.1 Изучение влияния начальной концентрации БЛ на выход белковых веществ показало, что степень извлечения отдельных белковых фракций не зависит от начальной концентрации БЛ в суспензии. Поэтому все эксперименты проводили при начальной концентрации БЛ 10 % по массе, что является оптимальным с точки зрения обеспечения эффективного перемешивания суспензии и позволяет получать достаточно концентрированные растворы белка, что упрощает его дальнейшее выделение.
