Содержание к диссертации
Введение
2.0бзор литературы 8
2.1. Микробиологическое окисление аммония 9
2.1.1. Аэробное окисление аммония 9
2.1.2. Анаэробное окисление аммония
2.1.2.1. Аммонийокисляющие бактерии (АОБ) 11
2.1.2.2. Анаммох-бактерии 13
2.2. Микробиологические и биохимические характеристики анаммокс-бактерий... 15
2.2.1. Физиологические аспекты 15
2.2.2. Структура клетки 18
2.2.3. Основные биохимические процессы
2.3. Идентификация анаммокс-бактерий и АОБ 23
2.4. Удаление азотсодержащих загрязнений из сточных вод
2.4.1. Нитрификация и денитрификация 26
2.4.2. Анаммокс-процесс и его модификации
2.4.2.1. SHARON-ANAMMOX 31
2.4.2.2. CANON 34
2.4.2.3. DEAMOX 35
3. Материалы и методы 40
3.1. Минеральная среда 40
3.2. Биомасса 40
3.3. Лабораторная установка 41
3.3.1. Рабочие параметры реакторов 42
3.4. Аналитические методы 43
3.4.1. Анализ последовательностей генов 16S рРНК 43
3.4.1.1. Выделение ДНК и амплификация генов 16S рРНК 43
3.4.1.2. Клонирование и секвенирование ПЦР-продуктов 44
3.4.1.3. Филогенетический анализ 44
3.4.2. FISH-анализ 45
3.4.3. Определение концентраций низкомолекулярных веществ в реакторных исследованиях 47
3.4.3.1 Определение концентрации аммония методом Фосетта и Скотта 47
3.4.3.2 Определение концентрации нитрат-ионов 48
3.4.3.3 Определение концентрации нитрит-ионов 48
3.4.3.4 Определение концентрации сульфид-ионов 49
3.4.3.5 Определение показателя общего химического потребления кислорода (ХПК) 50
3.5. Определение количества беззольного вещества биомассы (БВБ) 51
3.6. Определение удельных активностей биогранул 51
3.7. Определение кинетических характеристик биогранул in situ 52
4. Результаты и обсуждение 54
4.1. Филогенетический анализ автотрофного микробного сообщества,
осуществляющего DEAMOX процесс 54
4.1.1. Гены 16SpPHK домена Bacteria 54
4.1.2. Гены 16S рРНК отдела Planctomycetes 56
4.1.3. Гены 16SpPHK домена Archaea 60
4.2. Получение анаммокс-активных биогранул 62
4.2.1. Биогранулы №1 62
4.2.2. Биогранулы № 2 66
4.3. Запуск 2-х модификаций DEAMOX процесса 69
4.3.1. Запуск S-DEAMOX процесса 69
4.3.2. Запуск О-DEAMOX процесса 70
4.4. Оптимизация условий для S- и О-DEAMOX процессов 73
4.4.1. Влияние рН 73
4.4.2. Влияние концентрации ионов бикарбоната 75
4.4.3. Влияние температуры 76
4.4.4. Влияние НСА 78
4.4.5. Кинетические и каталитические характеристики биогранул 90
4.5. FISH-анализ 92
5. Выводы 95
6. Список литературы 97
- Анаэробное окисление аммония
- Идентификация анаммокс-бактерий и АОБ
- Рабочие параметры реакторов
- Гены 16S рРНК отдела Planctomycetes
Введение к работе
Актуальность работы. Наличие в водных системах азотных загрязнений оказывает токсическое воздействие не только на водные организмы, но и на здоровье людей. Так, присутствие в воде нитратов и нитритов вызывают у человека метгемоглобинемию, рак желудка, отрицательно влияет на нервную и сердечнососудистую системы, на развитие эмбрионов, а также является причиной возникновения некоторых смертельных заболеваний у младенцев. Существующие в России очистные сооружения технически устарели и не приспособлены для удаления азотных загрязнений из высококонцентрированных сточных вод до установленных значений ПДК в сбрасываемых обработанных стоках. Таким образом, развитие и совершенствование современных методов очистки сточных вод от азотных загрязнений является весьма актуальной задачей.
В последние годы процесс анаэробного окисления аммония (анаммокс-
процесс) признан наиболее перспективным, экономически выгодным и эффективным
способом удаления аммония из сточных вод. В этом процессе последний в
присутствии анаммокс-бактерий окисляется до молекулярного азота, при этом нитрит
используется в качестве акцептора электронов.
NH4+ + N02" -> N2 + 2Н20 (1)
Однако необходимый для протекания процесса окислитель (нитрит), как правило, отсутствует в исходных сточных водах. Для решения проблемы нитрита на кафедре Химической Энзимологии Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова был разработан новый процесс, получивший название DEAMOX (DEnitrifying AMmonium OXidation). В этом процессе специально селектированная смешанная микробная ассоциация последовательно осуществляет две реакции -конверсию нитрата, который является типичным компонентом сточных вод, в присутствии донора электронов до нитрита:
N03" + 2е"(донор электронов) +2Н+^ N02" + Н20 (2)
а затем анаммокс-реакцию (1). Для реакции (2) возможно применение как неорганического донора электронов - сульфида (S-DEAMOX), так и органического -ацетата (0-DEAMOX). Цели исследования. Низкая скорость роста анаммокс-бактерий, время удвоения которых составляет
11 сут, их относительная труднодоступность в природе и сравнительная
малоизученность приводит к тому, что запуск и выведение на стабильный режим работы DEAMOX-реакторов занимает длительное время и пока не является стандартной практикой. Поэтому первой целью данной работы являлась разработка методологии получения активной микробной популяции (биогранул) для 2-х модификаций DEAMOX-процесса с использованием в качестве исходного инокулята биомассы с крайне низкой анаммокс-активностью.
Второй целью работы являлась оптимизация S- и О- модификаций DEAMOX-процесса по отношению к ряду операционных параметров:
рН;
температура;
концентрации ионов бикарбоната;
нагрузка по соединениям азота (НСА) и способ ее достижения.
Несмотря на то, что ранее была показана возможность реализации DEAMOX-
процесса на реальных сточных водах, микробиологический анализ формирующихся
сообществ микроорганизмов проведен не был. Таким образом, анализ микробного
разнообразия DEAMOX-процесса с применением современных молекулярно-
биологических методов (16S рРНК и FISH) являлся третьей целью данной работы.
Научная новизна работы. Впервые был проведен молекулярно-биологический анализ микробных сообществ, осуществляющих DEAMOX-процесс. Филогенетический анализ биогранул из S-DEAMOX процесса выявил наличие микроорганизмов, ответственных за автотрофную денитритацию (Thauera, Thiobacillus и Desulfuromonas sp.) и анаэробное окисление аммония (Planctomyces sp.). FISH-анализ S- и О-DEAMOX биогранул подтвердил значительное присутствие анаммокс бактерий, среди которых были идентифицированы представители родов «Са. Brocadia» и «Са. Kueninia»
Предложена методология получения активных биогранул для 2-х модификаций DEAMOX-процесса с использованием в качестве исходного инокулята биомассы с крайне низкой анаммокс-активностью. Обе модификации DEAMOX процесса оптимизированы по отношению к таким операционным параметрам, как рН, концентрация ионов бикарбоната, температура, нагрузка по соединениям азота и способ ее достижения.
Практическая значимость работы. Разработана методология запуска DEAMOX-процесса, заключающаяся в предварительном культивировании неадаптированной биомассы в анаммокс-условиях с последующим переводом биогранул в соответствующие DEAMOX-условия.
Установлены оптимальные значения рН, концентрации ионов бикарбоната, температуры, при которых наблюдается наивысшая эффективность удаления азотных загрязнений. Показано, что наилучшая эффективность S-DEAMOX процесса при высоких нагрузках по азотным загрязнениям наблюдается при относительно коротких временах удерживания среды в реакторе (9) в отличие от О-DEAMOX процесса.
Определение кинетичеческих характеристик биогранул in situ по отношению к субстратам анаммокс-реакции показало, что максимальная скорость потребления субстратов снижается с увеличением диаметра биогранул.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: XVI Международная Научная Конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2009» (Москва, 2009); Международный Симпозиум «Environmental Science and Technology» (Шанхай, Китай, 2009); Международная Конференция «Biocatalysis - 2009: Fundamentals & Applications» (Архангельск, 2009); Выставка инновационных проектов (Москва, 2009); Международная Конференция "Protection and Restoration of the Environment X" (Корфу, Греция, 2010); 2-ая Международная Конференция "Hazardous and Industrial Waste Management" (Крит, Греция, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ. Объем и структура работы. Диссертация состоит из списка сокращений, введения, литературного обзора, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 183 источников. Общий объем работы 115 страниц, включая 35 рисунков и 19 таблиц.
Анаэробное окисление аммония
Все известные к настоящему моменту анаммокс-организмы были выделены из сильно отличающихся по своим характеристикам водных сред. Среди их сред обитания следует указать различные промышленные стоки и осадки, морские осадки, толща воды Мирового океана, пресноводные осадки. Так как при соотношении в среде углерода к азоту больше 1 анаммокс-бактерии не способны конкурировать с гетеротрофными денитрифицирующими бактериями [65, 66], то это объясняет тот факт, что все анаммокс-бактерии обнаружены только в системах с малым содержанием органического вещества.
Время удвоения анаммокс-организмов при оптимальных лабораторных условиях составляет 11 суток, а в реальных системах, в среднем, 2-3 недели. Такие низкие скорости роста приводят к тому, что время, за которое можно получить . накопительную культуру, обычно занимает более 200 сут. Выход биомассы анаммокс-бактерии составляет 0,07 моля связанного углерода на моль окисленного аммония. Низкая скорость роста анаммокс-организмов, вероятно, является следствием низкой скорости утилизации субстратов. Тем не менее, на основании проведенных исследований [55] было показано, что анаммокс-активность в столбе морской воды в Черном море составляет приблизительно 2 ./моль МН4+/клетка/сут, что хорошо соотносится с анаммокс-активностью, полученной для лабораторных культур, составляющей 2-20уколь МН4+/клетка/сут при 30С [48].
Анаэробное окисление аммония обычно не лимитируется концентрацией аммония, которая, как правило, относительно высока как в естественных, так и в искусственных системах, но сильно зависит от доступности акцептора электронов -нитрита. В реакторах с ограниченной подачей кислорода кластеры анаммокс бактерий находятся возле кластеров аэробных АОБ, которые превращают аммоний в нитрит и одновременно предохраняют анаммокс-бактерии от воздействия кислорода. Иногда они образуют совместные агрегаты, в которых на внешней части присутствуют аэробные бактерии, а во внутренней - анаммокс-организмы [50, 51, 67]. Источником нитрита также может являться процесс денитрификации. В этом случае происходит восстановление нитрата до нитрита, который затем может быть использован анаммокс-бактериями [9-13, 68].
Для бактерий Candidatus "Brocadia Anammoxidans" и Candidatus "Kuenenia Stuttgartiensis" показано, что проявление анаммокс-активности зависит от численности клеточной популяции. Активность исследованных культур может наблюдаться только при их относительно высокой численности, пороговые значения которой могут достаточно сильно различаться для этих культур - от 108 до 1011 клеток/мл [7]. В лабораторных условиях и при обработке сточных вод анаммокс-бактерии находятся в плотных кластерах клеток, при этом значение их локальной численности всегда высокое, однако во многих природных экосистемах большинство анаммокс-бактерии обитают как единичные клетки. Причины такого различия в поведении анаммокс-бактерии в природных и искусственных системах еще не ясны [55, 64].
По своему типу питания анаммокс-бактерии являются хемолитоавтотрофами, а по типу дыхания - строгими анаэробами, в то время как все классические члены. порядка Planctomycetales являются гетеротрофами [62]. Хемолитоавтотрофная природа анаммокс-бактерии была показана специальными экспериментами по включению 14С02 в клетки и подтверждена массовым балансом. Однако недавние исследования [59, 60, 66, 69] показали, что анаммокс-бактерии не являются облигатными хемолитоавтотрофами. Так, в качестве донора электронов они способны использовать низкомолекулярные органические кислоты, например, муравьиную, уксусную и пропионовую (Табл. 2.1). Пропионат, в основном, окисляется до углекислого газа с нитратом и/или нитритом в качестве акцептора электронов, но механизм окисления еще не изучен. Преимуществом роста в присутствии пропионата обладает Candidatus "Anammoxoglobus propionicus" [60], в то время как в присутствии ацетата - Candidatus "Brocadia fulgida" [59]. Однако при концентрации ацетата выше 25 мМ удельная анаммокс-активность Candidatus "Kuenenia Stuttgartiensis" снижается более, чем на 20% [70].
Кроме нитрита, анаммокс-бактерии в качестве акцептора электрона способны использовать Fe3+, оксиды марганца и нитрат [69, 71]. В работе [71] показано, что в условиях недостатка аммония клетки К. stuttgartiensis ведут себя как "денитрификаторы", т.е. способны образовывать необходимый для реакции аммоний из нитрата. Анаммокс-бактерии Candidatus "Brocadia fulgida" способны окислять также метиламины, используя нитрат или нитрит в качестве акцептора электронов, с образованием аммония [59]. Однако механизм окисления еще не изучен.
Анаммокс-бактерии достаточно сильно различаются на генетическом уровне, однако обладают схожей физиологией. Так, ингибирование кислородом происходит при низких концентрациях кислорода (менее 10"6М) и является обратимым. Восстановление активности происходит без заметного лаг-периода [72]. Это свойство предопределило огромную роль, которую анаммокс-бактерии играют в экосистеме шельфовых вод Намибии, где наблюдается сильное перемешивание среды и, как следствие, периодическое воздействие кислорода [73].
Анаммокс-бактерии необратимо ингибируются нитритом по разным данным при концентрации от 7 [7, 8] до 30 мМ [70]. В Таблице 2.2 приведены данные о влиянии различных ионов на анаммокс-активность: аммония, нитрита, нитрата, хлорида, фосфата и сульфида. Для субстратов анаммокс-реакции (аммония и нитрита) были определены константы сродства, значения которых оказались меньше 5цМ [8, 74]. Эти данные хорошо согласуются со значениями, полученными для природной системы. Так, бактерии осадка Скагеррак (Балтийское море) характеризуются значениями константы сродства по нитриту менее ЗиМ [75].
Идентификация анаммокс-бактерий и АОБ
В качестве объекта исследования была использована биомасса, наработанная во время разработки автотрофного DEAMOX процесса [9, 10]. Биомассу (1 мл) отделяли от надосадочной жидкости путем центрифугирования при 10 тыс. об/мин в течение 10 минут. ДНК выделяли из биомассы с использованием набора "DiatomtmDNAprep" ("Биоком", Россия) согласно рекомендациям фирмы-изготовителя. Осадок клеток суспензировали в бидистиллированной воде и дважды проводили обработку жидким азотом, замораживая, а затем размораживая при 65С. Далее осадок суспензировали в растворе гуанинидин хлорида и инкубировали при 65С в течение 1 часа. К полученному лизату клеток добавляли носитель (Diatomid/silica), затем супернатант удаляли, а носитель промывали буферным раствором, содержащим 70% этилового спирта. Очищенный препарат ДНК растворяли в 100 мкл бидистиллированной воды и использовали в качестве матрицы для проведения ПЦР.
Для амплификации генов 16S рРНК использовали универсальные праймеры для доменов Bacteria и Archaea и специфические праймеры для Planctomycetes и ANAMMOX бактерий. Гены 16S рРНК домена Bacteria амплифицировали с использованием прямого праймера 8-27f (5 -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) и обратных праймеров 519r [5 -G(T/A)ATTACCGCGGC(T/G)GCTG-3 ] и 1492г [5 ACGGYTACCTTGTTACGACTT-3 ], соответствующих позициям 8-27, 536-519 и 1510-1492 гена 16S рРНК Escherichia coli соответственно [166]. Эти праймеры не позволяли определить разнообразие планктомицетов в микробном сообществе. В связи с этим гены 16S рРНК планктомицетов амплифицировали с использованием праймеров, специфичных для этой группы бактерий, Pla58f [5 -GGCATGGATTAGGCATGC] и Р1а926г [5 - CCACCGCTTGTGTGAGCCCC] [167].
Гены 16S рРНК архей амплифицировали с использованием прямого праймера A109F (5 -ACG/TGCTCAGTAACACGT-3 ) и обратного праймера А104ІГ (5 -GGCCATGCACCWCCTCTC-3 ), соответствующих позициям 109-125 и 1058-1041 гена 16S pPHK-E. coli, соответственно [168].
ПЦР проводили в следующем режиме: 3 мин при 94С; 30-35 циклов, включающих денатурацию ДНК (0.5 мин при 94С), отжиг праймеров (0,5 мин при 50 С), элонгацию (1,5 мин при 72С), и финальную элонгацию (7 мин при 72С). Температура отжига праймеров PIa58f-Pla926r составила 58С. Полученные ПЦР-продукты анализировали в 1 % агарозном геле и переосаждали 70% спиртом с 0,75 М ацетатом аммония (рН 5,0).
ПЦР-продукты фрагментов гена 16S рРНК клонировали в плазмидный вектор pGEM ("Promega"). После проведения ПЦР были выявлены 163 уникальных клона, содержащих вставки генов 16S рРНК необходимых размеров. Полученная библиотека содержала 51, 66 и 48 клонов со вставками генов 16S рРНК Archaea, Bacteria и Planctomycetes, соответственно.
Секвенирование проводили на секвенаторе ABI 3100 Avant Genetic Analyser ("Applied Biosystems") с использованием набора Dyenamic Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction kit ("Amersham", Великобритания) по протоколу производителя.
Секвенирование бактериальных последовательностей 16S рДНК проводили с помощью плазмидного праймера Т7 (для МВ-клонов) и праймера 8-27f (для В-клонов). Последовательности 16S рДНК архей секвенировали с использованием праймера A109f (для МА-клонов).
Первичный анализ полученных последовательностей проводили с использованием программы BLAST сервера NCBI. Кроме того, использовали пакет программ BioEdit (http://iwbro\vn.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Последовательности выравнивали относительно наиболее близких видов микроорганизмов при помощи пакета программ CLUSTAL W (v 1.75) [169]. Для исключения химер полученные последовательности проверяли с использованием онлайн системы CHECK_CHIMERA и базы данных Ribosomal Database Project (RDP; http://rdp.cme.msu.edu). Филогенетические деревья строили по методу ближайших соседей (neighbor-joining) [170], с помощью пакета программ TREECONW, (http://bioinformatics.psb.ugent.be/psb/Userman/treeconw.html) [171]. Нуклеотидные последовательности 16S рРНК помещены в GenBank под номерами DQ507137 -DQ507199.
FISH-анализ Флуоресцирующую in situ гибридизацию проводили по следующей методике [172]. Клетки отделяли от надосадочной жидкости путем центрифугирования при 10 тыс. об/мин в течение 5 минут и далее суспендировали в фосфатном буфере (PBS), содержащем (г/л) 8 NaCl; 0,2 КС1; 1,44 Na2HP04; 0,24 КН2Р04; рН 7,4. Затем добавляли 3-х кратный раствор 4% параформальдегида (в PBS) и инкубировали в течение 3 ч во льду. После этого клетки дважды промывали PBS. Отмытые клетки суспендировали в растворе, содержащем 50% PBS и 50% этанола, а затем замораживали при -20 С. Замерзшие осадки высушивали в течение Зч при 45 С, последовательно обрабатывая 50%, 80% и 100% этанолом (об.%) в PBS каждые 3 минуты. Для проведения гибридизация была подготовлена смесь, следующего состава: 9 мкл буфера, содержащего необходимое количество NaCl и формамида (Табл. 3.3), и 1 мкл зонда с флуоресцирующей меткой в концентрации 50 нг/мкл. В качестве флуоресцирующих меток использовали красители СуЗ, Су5, FLUOS. Гибридизацию проводили в течение 90 минут при 45 С. Последующую промывку проводили 15 минут при 48 С в буфере, содержащем необходимое количество NaCl (Табл. 3.3), 20 мМ Tris-HCl, рН 7, 5 мМ ЭДТА и 0,01% SDS. Для получения изображения использовали микроскоп Zeiss Axioplan (Zeiss, Германия).
Рабочие параметры реакторов
Как было отмечено в Разделе 2.4.2.3, при избытке донора электронов возможно дальнейшее окисление нитрита до молекулярного азота. Таким образом, наблюдается распределение донора между DEAMOX-процессом и реакцией денитритациии. В связи с этим, было изучено влияние и определены оптимальные значения таких параметров, как рН, концентрация ионов бикарбоната, температура, НСА, при которых наблюдался наивысший вклад DEAMOX-процесса (параметр у) и наивысшая эффективность удаления азотных загрязнений для обеих модификаций.
При проведении экспериментов по изучению влияния рН на эффективность обеих модификаций DEAMOX-процесса, его значения контролировали как на входе, при подаче субстратов, так и на выходе из реакторов. Каждый режим поддерживался до достижения квазистационарного состояния.
Из Рисунков 4.10 и 4.11 видно, что изменение значений рН оказало значительное влияние на эффективность удаления аммония и, как следствие, на удаление общего азота в реакторе. Повышение значений рН в среде обоих реакторов было связано с тем, что в результате анаммокс-реакции (с учетом анаболизма) происходит потребление протонов (Ур. 2.10). Следует отметить, что более значительное повышение значений рН в среде реактора O-DEAMOX процесса связано с образованием более слабой угольной из уксусной кислоты (Ур. 2.18). Таким образом, для достижения максимальной эффективности удаления аммония необходимо контролировать значения рН в реакторе.
В результате проведенных исследований (Рис. 4.10) было установлено для S-DEAMOX процесса оптимальное значение рН в реакторе 7,58+0,05. При этом значении наблюдалась наивысшая эффективность удаления аммония, которая составила 69 %. Общее удаление азота составило 79 %. Распределение донора электронов - сульфида между деамокс-реакцией и нежелательной денитритацией было примерно одинаковое, так параметр у составил 0,54+0,03 (Рис. 4.10). Отклонение от оптимального значения сопровождалось снижением вклада деамокс-реакции, что приводило к снижению эффективности удаление аммония и общего азота в реакторе. 7,01
Следует отметить, что изменение рН в исследуемом диапазоне значений практически не оказывало влияния на эффективность удаления окисленных форм азота, которая на всех этапах была выше 85%. 6,65 7,09 7,37 7,62 рНинФ Рис. 4.11. Влияние рН на: (а) эффективности удаления различных форм азота и (б) вклад деамокс-реакции в O-DEAMOX процесс. 4.4.2. Влияние концентрации ионов бикарбоната Для выяснения влияния концентрации ионов бикарбоната на эффективность DEAMOX-процессов были проведены соответствующие эксперименты при варьировании значений концентрации ионов бикарбоната от 12 до 30 мМ. Во время экспериментов значения рН в реакторах поддерживалось в диапазоне оптимальных значений, установленных ранее: 7,5 для S- и 8,1 для O-DEAMOX процессов.
Как видно из представленных данных (Рис. 4.12 и 4.13), при концентрации ионов бикарбоната до 24 мМ для обеих модификаций DEAMOX-процесса наблюдалось примерно одинаковое распределение донора электронов между деамокс-реакцией и конкурирующей денитритацией. Дальнейшее повышение входящей концентрации ионов бикарбоната до 30 мМ привело к снижению эффективности удаления аммония с 70 до 47% в обоих случаях. При этом более 70% донора электронов уходило на нежелательную реакцию. Эффективность удаления окисленных форм азота во время экспериментов была выше 90%. Таким образом, оптимальное значение концентрации ионов бикарбоната для обеих модификаций DEAMOX-процесса составило 24 мМ.
При проведении экспериментов условия в реакторе поддерживались в диапазоне оптимальных значений, исследованных выше: рН 7,5 и 8,1 для S- и O-DEAMOX, соответственно, входящая концентрация ионов бикарбоната 24 мМ для обеих модификаций. Температуру поднимали поэтапно с 20 до 40 С с шагом в 5С. Следует отметить, что эффективность удаления окисленных форм азота на всех этапах составляла более 90%.
Из представленных данных на Рис. 4.14 видно, что для S-DEAMOX процесса наивысшая эффективность удаления аммония 70% и общего азота 83 % наблюдались при 35С. При этом вклад деамокс-реакции составил 0,51±0,02. Измеренные активности показали, что наивысшие значения анаммокс и деаммокс активности наблюдались при 35С и составили 28,5 и 9,3 мг N/r БВБ/сут, соответственно. При этом конкурирующая денитритирующая активность при этой температуре имела минимальное значение. Повышение температуры на 5С не оказало значительного влияние на анаммокс-активность, значение которой снизилось до 27,9 мг N/r БВБ/сут. Однако денитритирующая активность увеличилась более чем в 2 раза с 31,1 при 35 С до 76 мг N/r БВБ/сут, что привело к снижению деаммокс активности до 4,8 мг N/r БВБ/сут. Снижение температуры от оптимального значения также сопровождалось резким ростом денитритирующей и снижением анаммокс и деаммокс активностей, что, как следствие, привело к снижению вклада деамокс-реакции и эффективности удаления общего азота. и 120 100 80 60 40 30 о, Температура процесса, С 20 о, Температура процесса, С Рис. 4.14. Влияние температуры на S-DEAMOX процесс: (а) эффективности удаления различных форм азота; (б) вклад деамокс-реакции; (в, г) основные активности.
Для 0-DEAMOX процесса (Рис. 4.15) наивысшие эффективности удаления аммония (более 73%) и общего азота (более 87%) наблюдались в диапазоне температур 35-25 С, при этом вклад деамокс-реакции оставался постоянным и составил 0,47 ± 0,01. Однако наивысшие значения анаммокс- и деамокс-активностей и наименьшее денитритирующей наблюдались при 30 С и составили 15,2, 6,1 и 13,8 мг N/r БВБ/сут, соответственно. Отклонения от этой температуры сопровождались постепенным ростом дентритируюшей и снижением анаммокс и деаммокс активностей.
Гены 16S рРНК отдела Planctomycetes
Кинетические и каталитические характеристики биогранул Чтобы иметь более полное представление о каталитической активности биогранул были определены их кинетические параметры in situ по отношению к анаммокс-субстратам (Ур. 1.1). Детали соответствующих экспериментов и методы расчета параметров описаны в Разделе 3.7.
Как видно из данных Табл. 4.11, кажущаяся константа сродства к аммонию для S-DEAMOX биогранул оказалась в 2,5 раза ниже, чем для O-DEAMOX гранул. В то время как кажущиеся константы сродства к нитриту для различных биогранул были близки по значениям. Различия между биогранулами прослеживались также и в морфологических характеристиках. Так, O-DEAMOX гранулы имели, в основном, диаметр 3-5 мм, в то время как S-DEAMOX гранулы - 1-2 мм (Рис. 4.20). В связи с тем, что анаммокс бактерии обычно располагаются в центральной части гранулы, субстратам необходимо преодолеть более долгий диффузионный путь в более крупных агрегатах, что и объясняет различия в кажущихся константах сродства к субстратам. Таким образом, скорость потребления субстратов анаммокс-процесса (аммония и нитрита) была выше в том случае, когда размер агрегатов был меньше.
Полученные каталитические константы (Табл. 4.11) позволили рассчитать активность биогранул, показывающую максимально возможное количество субстрата, которое может минерализовать 1 г БВБ в сутки. Из данных Табл. 4.11 видно, что активность по отношению к аммонию и нитриту S-DEAMOX биогранул была выше в 2,7 и 3,6 раз, соответственно, чем O-DEAMOX биогранул. Параллельно также проводили измерения активностей биомассы в периодических тестах (Табл. 4.12). Следует отметить, что результаты анаммокс-активности биогранул, полученных с помощью различных методов, имеют достаточно хорошую сходимость.
Деамокс, мгЫ-ЫН4+/гБВБ/сут нижеопределяемого уровня 9,3±0,1 нижеопределяемогоуровня 6,1±0,1 Таким образом, за время работы S-DEAMOX процесса анаммокс-активность биогранул увеличилась с 20,1 до 42,7 мг N/r БВБ/сут (Табл. 4.12), то есть почти в два раза. При этом денитрифицирующая активность таклсе увеличилась почти в 2 раза, а денитритирующая осталась на прежнем уровне. Масса биогранул увеличилась примерно на 20%.
За это же время анаммокс-активность О-DEAMOX биогранул процесса увеличилась в 3 раза с 6,1 до 19,2 мг N/r БВБ/сут (Табл. 4.12). Денитрифицирующая активность увеличилась почти в 2 раза, в то время как денитритирующая снизилась в 2,3 раза. Масса биогранул увеличилась на 60%. Более высокий рост биомассы для О-DEAMOX процесса, чем для S-DEAMOX, связан с тем, что сульфид оказывает ингибирующее влияние на анаммокс-бактерии.
В заключение работы был проведен FISH-анализ биогранул S- и О- модификаций DEAMOX процесса, со специфическими праймерами на домен Bacteria и Archea, группу анаммокс-бактерии, АОБ отделов /?- и у- Proteobacteria.
На Рис. 4.19 представлены результаты FISH-анализа биогранул, сформировавшихся в течение работы S-DEAMOX процесса. Так на Рис. 4.19а зеленым цветом представлены анаммокс-бактерии, а синим цветом - другие представители домена Bacteria. Следует отметить, что праймер, пременяемый для домена Bacteria (EUB 338), не образует продукта гибридизации с 16S рРНК анаммокс-бактерии [109]. Таким образом, видно, что анаммокс-бактерии являлись доминирующими в сформировавшемся микробном сообществе. Праймер АМХ368, применяемый в этом случае для определения последних, являлся универсальным для всей анаммокс-группы [109]. Так как типичными представителями микробных сообществ реакторов для обработки сточных вод являются анаммокс-бактерии родов Са. Brocadia и Са. Kueninia, далее была проведена амплификация с праймером АМХ820 специфичным только для двух этих представителей. Как видно на Рис. 4.19 б зеленый цвет, представители этих родов анаммос-бактерий присутствовали в S-DEAMOX микробном сообществе. Рис. 4.19. Результаты FISH-анализа S-DEAMOX биогранул со специфическими праймерами на представителей: (а) анаммокс-бактерии (зеленый), АОБ отдел /?-Proteobacteria (красный), Bacteria (синий); (б) домен Archea (красный), анаммокс-бактерии (зеленый); y-Proteobacteria (синий).
Также были проведены исследования по определению АОБ отдела /?-Proteobacteria, так как для относящиеся к этому отделу бактерии рода Nitrosomonas способны осуществлять анаэробное окисление аммония [43 - 46] и. возможно, они также принимали участие в процессе. Однако их было обнаружено незначительное количество (Рис 4.19а красный цвет), как и представителей другого отдела АОБ - у-Proteobacteria (Рис. 4.196 синий цвет). Присутствие архей в микробном S-DEAMOX сообществе (Рис. 16 красный цвет) объясняется важной ролью метаногенов в формировании гранул анаэробной биомассы.
Аналогичные исследований были проведены для биогранул, сформировавшихся в результате 0-DEAMOX процесса. На Рис. 4.20 представлены результаты FISH-анализа с праймерами, как и для S-DEAMOX биогранул. Как и в предыдущем случае, анаммокс-бактерии являлись доминирующими в сформировавшемся сообществе микроорганизмов (Рис. 4.20а зеленый цвет), однако представителей родов Са. Brocadia и Са. Kueninia (Рис. 4.206, зеленый цвет) было обнаружено незначительное количество. Представители АОБ отделов /?- Proteobacteria (Рис. 4.20а, красный цвет) и y-Proteobacteria (Рис. 4.206, синий цвет) также практически отсутствовали. Однако наблюдалось значительное количество архей (Рис. 4.206, красный цвет), присутствие которых объясняется их важной ролью в формировании анаэробных гранул. г
Таким образом, проведенный FISH-анализ S- и O-DEAMOX биогранул выявил, что доминирующими микроорганизмами в сформировавшихся сообществах являются анаммокс-бактерии родов Са. Brocadia и Са. Kueninia. АОБ, также способные в определенных условиях к анаэробному окислению аммония, были обнаружены в незначительных количествах.
