Содержание к диссертации
Введение
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах и их способность к самоочищению 7
1.1.1. Изменение свойств почв в условиях нефтяного загрязнения 7
1.12. Микроорганизмы - деструкторы нефти и нефтепродуктов 11
1.2. Биотехнологические методы очистки окружающей среды от нефтяного загрязнения 18
1.2.1. Методы ремедиации нефтезагрязненных почв 18
1.2.2. Бактериальные препараты для интродукции микроорганизмов при ликвидации нефтяных загрязнений 24
2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 37
2.1. Скринингмикроорганизмов-нефтедеструкторов 38
2.2. Изучение фенотипических характеристик вьщеленных культур 39
2.3. Исследование окислительной активности микроорганизмов- деструкторов нефти и нефтепродуктов 39
2.4. Изучение эффективности процесса биодеструкции нефти в лабораторных и полевых экспериментах 40
2.5. Статистическая обработка результатов 43
3. ИССЛЕДОВАНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БИОПРЕПАРАТА «ЛЕНОЙЛ» 44
4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОЦЕССОВ БИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕМЕДИАЦИИ ПРИРОДНЫХ ОБЪЕКТОВ В УСЛОВИЯХ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ 48
4.1. Выделение перспективных штаммов микроорганизмов -
деструкторов нефтяных углеводородов 48
4.2. Оценка эффективности биопрепарата «Ленойл» для 1С' биоремедиации нефтезагрязненных почв 52
4.3. Изучение возможности использования биопрепарата «Ленойл» для биоремедиации отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты 58
5. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ БИОПРЕПАРАТА «ЛЕНОЙЛ» ДЛЯ БИОРЕМЕДИАЦИИ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ ОТ НЕФТЯНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ 70
ВЫВОДЫ 77
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 79
ПРИЛОЖЕНИЕ 99
- Изменение свойств почв в условиях нефтяного загрязнения
- Изучение эффективности процесса биодеструкции нефти в лабораторных и полевых экспериментах
- ИССЛЕДОВАНИЕ ОКИСЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ БИОПРЕПАРАТА «ЛЕНОЙЛ»
Введение к работе
Актуальность проблемы. Среди высоко токсичных загрязнителей окружающей среды выделяются нефтепромысловые поллютанты (нефть и продукты ее переработки, нефтяные шламы и т.д.). Наиболее перспективным направлением биоремедиации нефтезагрязненных объектов является применение биологического метода, основанного на использовании биопрепаратов, позволяющих ускорить разложение нефти и нефтепродуктов, не нанося дополнительного ущерба нарушенной экосистеме. На сегодняшний день разработаны и производятся различные биопрепараты, предназначенные для ремедиации природных объектов от последствий загрязнения нефтью и нефтепродуктами. В Институте биологии Уфимского научного центра РАН запатентован в Российской Федерации новый высокоэффективный биопрепарат «Ленойл», созданный на основе консорциума нефтеокисляющих микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter spesies (Пат. RU № 2232806). Исследование применимости биопрепарата «Ленойл» в процессах биологической рекультивации почв, содержащих нефть или нефтепродукты, и очистки водных объектов от нефтяного загрязнения является актуальной проблемой.
Цель исследования. Исследование возможности использования нового биопрепарата «Ленойл» для ремедиации нефтезагрязненных почв и водных объектов.
Задачи исследования.
1. Определить спектр окислительной активности консорциума
микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» и чистых культур микроорганизмов,
входящих в его состав, в отношении различных классов углеводородов.
Определить эффективность использования биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации почв, загрязненных нефтью.
Провести сравнительную оценку эффективности биопрепарата «Ленойл» относительно известных коммерческих биопрепаратов для очистки нефтезагрязненных почв.
Разработать технологию биологической рекультивации техногенного отхода - отработанной отбеливающей земли, содержащей нефтепродукты, с использованием биопрепарата «Ленойл».
Разработать способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения, основанный на использовании биопрепарата «Ленойл».
Научная новизна. Разработан новый способ очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения, основанный на использовании биопрепарата «Ленойл».
Определены величины окислительной активности консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл» и чистых культур микроорганизмов, входящих в его состав, по отношению к нефти и продуктам ее переработки, индивидуальным углеводородам и жирам растительного и животного происхождения.
Практическая значимость. Доказана высокая эффективность использования биопрепарата «Ленойл» для биологической рекультивации различных почв и грунтов, загрязненных нефтью, и очистки водных поверхностей от нефтяного загрязнения.
Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на I Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), научно-практической конференции «Теоретические и практические вопросы мониторинга, предупреждения, ликвидации и рекультивации последствий нефтяного загрязнения» (Ханты-Мансийск, 2003), конференции НТО нефтяников и газовиков им. И.М. Губкина «Охрана окружающей среды при освоении углеводородных ресурсов» (Сочи, 2003), XVII Международной научно-технической конференции «Химические реагенты, реактивы и процессы малотоннажной химии» (Уфа, 2004).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе патент Российской Федерации.
Изменение свойств почв в условиях нефтяного загрязнения
Загрязнение нефтью оказывает отрицательное воздействие на химические, физические и биологические свойства почв.
Под влиянием нефти и ее компонентов изменяется численность микроорганизмов основных физиологических групп (Margesin et al., 2000), ухудшаются агрофизические, агрохимические свойства почвы (Солнцева, Никифорова, 1989), снижаются активность окислительно-восстановительных и гидролитических ферментов (Киреева и др., 2000, 2002), обеспеченность почвы подвижными формами азота и фосфора (Atlas, 1991, Boopathy, 2000). Попадание углеводородов в почву приводит к изменению поведения и гибели беспозвоночных животных (Трублаевич, Семенова, 1997).
Большой вред растениям приносит непосредственное токсическое действие нефти. Прямое воздействие на растения оказывают содержащиеся в нефти нафтеновые кислоты и другие токсичные углеводороды (Андресон с соавт., 1980, Шурубор, 2000, Киселева с соавт., 2001). По мнению М.Ю. Гилязова (2001), вредное действие тяжелых фракций обусловлено образованием механического барьера между семенами, корневой системой и окружающей средой, затрудняющего водно-воздушный и пищевой режимы. М.В. Аниськиной с соавт. (2001) показано, что использование традесканции (клона 02) позволило выявить генотоксичность почв, загрязненных нефтью. При этом частота соматических мутаций возрастала в 3-3,5 раза по сравнению с контролем.
Нефтяное загрязнение, по-видимому, приводит к нарушению межвидовых связей. Результаты исследования Н.А. Киреевой (1995) свидетельствуют о том, что оно отрицательно действует на ячмень, снижая его фотосинтетическую активность и продуктивность; ризосферные микроорганизмы - консорты заменяются нетипичными для изученных почв видами. В результате снижается продуктивность агроценозов. Нарушение микробно - растительного взаимодействия в условиях нефтяного загрязнения приводит к развитию грибов -токсинообразователеЙ в почве под растениями (Иларионов с соавт., 2003, Киреева с соавт., 2003, Бакаева, 2004).
Соотношение разных групп микроорганизмов в нефтезагрязненных почвах варьирует и зависит от климатических условий и типа почвы. Например, при загрязнении торфяников угнетаются в первую очередь микроскопические грибы, играющие в этих почвах ведущую роль в разложении органики (Головченко, Полянская, 2001). По мере увеличения степени конденсированности нефтепродуктов в серой лесной почве и черноземе уменьшается численность целлюлозоразрушающих, пектинразрушающих микроорганизмов и нитрификаторов (Киреева, 1994). Разложение целлюлозы идет, в основном, за счет анаэробных микроорганизмов. Численность некоторых групп микроорганизмов в загрязненной почве может увеличиваться. Зарегистрирован рост численности микроскопических грибов, аммонификаторов (Киреева, 1994), пурпурных несерных бактерий (Драчук с соавт., 2002).
В настоящее время в России в МГУ на кафедре биологии почв под руководством Д.Г. Звягинцева создано целое направление по изучению влияния различных видов антропогенных воздействий на почвенные микроорганизмы. На основе методов, разработанных русской школой, установлено четыре зоны действия токсикантов на почвенные микроорганизмы: зона гомеостаза, стресса, резистентности и репрессии (Гузев с соавт., 1980). С помощью лабораторных моделей предпринята попытка эколого-токсикологического нормирования содержания нефти и других поллютантов в почвах разного типа (Звягинцев с соавт., 1989, Левин с соавт., 1995).
Обогащение почвы нефтью в пределах до 1 - 3 мл/кг обычно оказывало лишь общее стимулирующее действие на почвенную микробиоту. Общая биомасса микроорганизмов амилолитического микробного сообщества несколько возрастала, а его состав оставался постоянным. Этот интервал концентрации нефти в почве определяется как зона гомеостаза.
При концентрациях нефти в интервале концентраций до 10-30 мл/кг она уже выступает как активный модификатор микробиологических свойств почвы. В этом диапазоне нагрузки, названной зоной стресса, происходит значительное перераспределение доминантов в составе активно функционирующего микробного сообщества. Организмы, занимающие минорные позиции в исходной почве, становятся доминирующими и, наоборот.
При повышении концентрации нефти до 300 мл/кг (зона резистентности)
можно обнаружить значительное снижение активности сапротрофной
микробиоты, преимущественное развитие углеводородокисляющих
микроорганизмов, активно разрушающих нефтепродукты.
Еще больший уровень загрязнения - зона репрессии выделяется на том основании, что при концентрациях нефти больше 300 мл/кг за счет плохой аэрации и острого токсического действия загрязнителя в почве практически полностью подавляется биологическая активность.
Изучение эффективности процесса биодеструкции нефти в лабораторных и полевых экспериментах
В лабораторном модельном эксперименте изучали процессы биодеградации нефти и возможность биологической рекультивации чернозема выщелоченного: гумус по Тюрину - 8,40%, азот (валовой) - 0,60%, Р205 (по Чирикову) - 4,39 мг/100 г почвы, Нг (по Каппену) - 9,30 мг-экв/100 г почвы, поглощенный кальций и магний (по Каппену-Гильковицу) 28,5 и 8,2 мг экв/100 г почвы, соответственно, рН солевой 5,85, рН водный 6,46, C:N - 8, загрязненного сырой нефтью Арланского месторождения (плотность 883-891 кг/м ), содержание воды (мас.%) -1-4; солей (мг/л) - до 4000; серы (мас.%) - 2,3; парафина (мас.%) - 3; смол (мас.%) - 35,5; асфальтенов (мас.%) - 6-11; H2S - 3,5 и торфа Сингапайского (данные «Юграпромторф»): влажность (%) - 55; зольность (%) - до 33; степень разложения (%) - до 45; рН - 4,4; гуминовых кислот (мас.%) -31, загрязненного сырой нефтью Правдинского месторождения (АО «Юганскнефтегаз») (плотность
871-891 кг/м3), содержание: воды (мас.%) - 0,5-5; солей (мг/л) - до 600; серы (мас.%) - 1,3; парафина (мас.%) - 3,3; смол (мас.%) - 8,5; асфальтенов (мас.%) — 5-9; H2S (мг/л)-1,7.
В сосуды с 10 кг тщательно перемешанных чернозема или торфа вносили нефть из расчета 10, 20, 30 мас.% и биопрепараты с титром 2,0-Ю6 КОЕ/мл.
Для создания оптимальных условий жизнедеятельности микроорганизмов вносили азотно-фосфорные минеральные удобрения (из расчета 0,25 г/кг почвы или торфа). Образцы инкубировали при комнатной температуре 20С±2С в течение 60 суток. Влажность в сосудах в течение всего срока опыта поддерживали на уровне 60% полной влагоемкости.
Численность основных групп микроорганизмов, участвующих в биотрансформации нефти и нефтепродуктов, определяли посевом почвенной суспензии на элективных питательных средах. Численность углеводородокисляющих микроорганизмов учитывали на минеральной среде Цукамуры с нефтью в качестве единственного источника углерода (Сэги, 1983), бактерий, усваивающих органический азот - на мясо-пептонном агаре (Звягинцев, 1980).
Содержание нефтепродуктов определяли весовым методом после экстракции углеводородов из навески почвы или торфа гексаном на аппарате Сокслета (Богомолов, 1984) или спектрофотометрическим методом (Груздякова, 1993). Структурный состав нефтепродуктов определяли методом газовой хроматографии с масс-селективным электродом (Хмельницкий, Бродский, 1990). Анализ почвенных экстрактов проводили на хромато-масс-спектрометрической системе, включающей газовый хроматограф НР-5890 и масс-селективный детектор НР-6890.
Для наблюдения за процессом биодеградации образцы анализировали через 15,30,45 и 60 суток.
В лабораторных испытаниях технологии биологической рекультивации отбеливающей земли, загрязненной нефтепродуктами, использовали
отбеливающую землю, отобранную с отвалов ОАО «Орскнефтеоргсинтез», активный ил, используемый для очистки нефтесодержащих сточных вод на биологических очистных сооружениях г.Орска, оксигенные химические соединения - суперфосфат и перекись водорода и биомассу консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ 5, полученную при их совместной ферментации. Схема модельного опыта приводится ниже. Повторность опытов - трехкратная.
Исследование окислительной активности биопрепарата «ленойл
Целью исследований являлось изучение спектра окислительной способности в отношении нефти и продуктов ее переработки, а также жиров растительного и животного происхождения как под воздействием биопрепарата «Ленойл», так и под воздействием составляющих этот консорциум микроорганизмов в отдельности.
В работе использовали промышленный образец биопрепарата «Ленойл», соответствующий ТУ 9291-016-22657427-2002, полученный при культивировании консорциума микроорганизмов Bacillus brevis и Arthrobacter species ИБ ДТ-5 в ферментере объемом 6 м3.
Результаты определения окислительной активности консорциума микроорганизмов биопрепарата «Ленойл», а также индивидуальных штаммов бактерий Bacillus brevis ИБ ДТ 5-1 и Arthrobacter species ИБ ДТ 5-3, входящих в состав консорциума, по отношению к индивидуальным углеводородам парафинового ряда (гептан, декан, ундекан, додекан), нафтеновым углеводородам (циклогексан), ароматическим углеводородам (бензол, толуол, о-ксилол, нафталин), нефти и нефтяным фракциям (дизельное топливо, базовое смазочное масло, парафин, церизин), к некоторым окисленным углеводородам (изопропиловый спирт, гексадеканол, фенол) и жирам растительного и животного происхождения приведены в табл. 2. Как следует из представленных данных, окислительной способностью по отношению к углеводородам различного химического строения обладают в определенной степени оба штамма бактерий. Величина окислительной активности консорциума микроорганизмов превосходит аналогичный показатель для изолированных чистых культур штаммов бактерий, входящих в состав консорциума. При этом и окислительная активность штамма Bacillus brevis отличается более высоким значением, чем у штамма Arthrobacter sp., и является, очевидно, определяющей величиной для всего консорциума в целом. Исключение составляют углеводороды циклической структуры (бензол, толуол, нафталин, циклогексан) - в этих случаях окислительная активность штамма Arthrobacter sp. является превалирующей величиной, превышающей по своему значению аналогичный показатель для Bacillus brevis.
Окисление микроорганизмами различных углеводородов связывается с наличием у них ферментной оксигеназной системы, позволяющей им включать молекулярный кислород непосредственно в углеводород, образуя при этом окисленные соединения (Голубовская, 1978). В связи с этим можно предположить, что ферментативные системы микроорганизмов, входящих в состав консорциума, содержат оксигеназы; при этом оксигеназная система штамма Bacillus brevis более специфична для линейных углеводородов (рис. 1, а), а оксигеназная система штамма Arthrobacter sp. - для циклических углеводородов (рис. 1, б, в).
При биохимическом окислении таких субстратов, как нефть и нефтяные фракции, содержащих в своем составе сложные смеси углеводородов различных классов, окислительная активность консорциума микроорганизмов значительно превосходит эту характеристику для каждого из штаммов микроорганизмов, входящих в его состав (рис. 1, г).
Биопрепарат «Ленойл» и микроорганизмы, входящие в его состав, способны окислять и различные жиры животного и растительного происхождения (табл. 2).
Таким образом, показано, что биопрепарат «Ленойл» обладает способностью к окислению широкого спектра углеводородов, как в консорциуме, так и его составляющими, причем наибольшие величины окислительной активности приходятся на консорциум. Результаты исследований подтверждают данные о том, что бактериальные ассоциации, в отличие от биопрепаратов, содержащих отдельные штаммы, более эффективно утилизируют нефть и нефтепродукты.
