Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. Литературный обзор 10
1.1.Общая характеристика молочной сыворотки, современное состояние и перспективы ее переработки 10
1.2. Белковый состав молочной сыворотки 13
1.3. Способы выделения сывороточных белков из молочного сырья 28
1.4. Получение ферментативных гидролизатов сывороточных белков 35
1.5. Получение микробной (3-галактозидазы 40
ГЛАВА II. Материалы и методы исследования 46
2.1. Объект исследования 46
2.2. Реагенты 46
2.3. Методы анализа 48
2.3.1. Определение сухих веществ в образцах 48
2.3.2. Количественное определение белков в растворах 48
2.3.3. Количественное определение углеводов в растворах 50
2.3.4. Количественное определение липидов 50
2.3.5. Количественное определение лактоферрина методом иммуноферментного анализа 50
2.3.6. Определение активности лактопероксидазы
2.3.7. Количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии 52
2.3.8. Определение протеолитической активности модифицированным методом Ансона 53
2.3.9. Определение активности (3-галактозидазы 53
2.4. Методы исследования 54
2.4.1. Методика проведения ультраконцентрирования 54
2.4.2. Методика проведения гель-хроматографии 55
2.4.3. Методика проведения ионного обмена 55
2.4.4. Методика выделения белков высаливанием 56
2.4.5. Методика проведения ферментативного гидролиза 56
2.4.6. Методика культивирования микроорганизмов 57
2.4.7. Методика проведения дезинтеграции дрожжевой биомассы 57
ГЛАВА III. Экспериментальная часть и обсуждение результатов 58
3.1. Исследование физико-химических характеристик молочной сыворотки...58
3.2. Исследование способов предварительного концентрирования молочной сыворотки 64
3.3. Выбор схемы ультрафильтрационного разделения молочной сыворотки с получением белковых фракций 66
3.4. Подбор оптимальных условий выделения лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов 80
3.5. Исследование способов переработки фракции, обогащенной Р" л акто глобулином, а-лактоальбумином, сывороточным альбумином крови... 92
3.6. Подбор оптимальных условий получения белковых гидролизатов на основе фракции главных сывороточных белков 94
3.7. Использование депротеинизированной молочной сыворотки для культивирования микроорганизмов - продуцентов Р-галактозидазы 101
3.8. Подбор оптимальных условий выделения Р-галактозидазы 109
Выводы 116
Список литературы
- Способы выделения сывороточных белков из молочного сырья 28
- Количественное определение белков в растворах
- Методика проведения ферментативного гидролиза
- Подбор оптимальных условий выделения лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов
Введение к работе
Актуальность работы. В современных экономических условиях возрастает роль технологий, ориентированных на использование или переработку вторичного сырья различного происхождения. Такой подход обусловлен необходимостью решения экологических проблем и повышения экономических показателей основного производства за счет утилизации отходов и получения дополнительной конкурентоспособной продукции.
Одним из крупнотоннажных отходов пищевых производств является молочная сыворотка, образующаяся при переработке молока в белково-жировые продукты (сыр, творог, казеин). Ежегодно в мире образуется более 130 млн тонн молочной сыворотки, из них около 2 млн тонн приходится на долю России. Эколого-экономические расчеты показывают, что 1 тонна молочной сыворотки может нанести такой же экологический ущерб, как 100 м хозяйственно-бытовых стоков при совокупных затратах на ее переработку 0,5-1,2 млн рублей [Зобкова З.С., 2007].
В России перерабатывается менее 50 % молочной сыворотки, поэтому проблема ее рационального использования стоит особо остро. Использование нативной молочной сыворотки в натуральном виде ограничено сроками ее хранения. Наиболее простой способ переработки молочной сыворотки - сушка - приводит к образованию продукта, не сбалансированного по основным питательным веществам, обладающего низкими органолептическими показателями. Более перспективным подходом является фракционирование молочной сыворотки с получением подсырных сливок, концентратов сывороточных белков, молочного сахара. Однако такие технологии, как правило, направлены на частичную переработку вторичного молочного сырья. В последние годы наибольший интерес вызывает глубокая переработка молочной сыворотки, предусматривающая извлечение из нее индивидуальных компонентов и получение их производных. Такие продукты могут найти более широкое применение в пищевой, медицинской и фармацевтической промышленности [Храмцов А.Г., 2003].
Наиболее ценными компонентами молочной сыворотки являются иммуноглобулины, лактоферрин и лактопероксидаза, хотя и присутствующие в небольших количествах, но обладающие защитной, антимикробной, антиоксидантной, иммуномо-дуляторной и регуляторной функциями. Данные соединения могут быть использованы в качестве основы для получения лечебно-профилактических продуктов [Ильина A.M., 2009]. В наибольшем количестве в молочной сыворотке содержатся 0-лактоглобулин и а-лактоальбумин, содержащие оптимально сбалансированный набор аминокислот. Благодаря высокой биологической ценности данные белки могут быть использованы для производства продуктов детского и диетического питания [Токаев Э.С., 2007].
Таким образом, целесообразной является разработка технологии комплексной переработки молочной сыворотки, направленная на выделение высокоценных белковых компонентов и получение сопутствующих продуктов, обладающих важными биологическими функциями.
Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка технологии получения биологически активных продуктов белковой природы (лакто-пероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов, белкового гидролизата, 0-галактозидазы) при комплексной переработке молочной сыворотки.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
определить основные физико-химические характеристики образцов молочной сыворотки, полученные при использовании различных технологий переработки молока;
выбрать оптимальную схему фракционирования молочной сыворотки, позволяющую получить отдельные белковые фракции;
подобрать оптимальные условия выделения лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулинов из фракций, обогащенных вышеперечисленными белковыми компонентами;
подобрать оптимальные условия получения белкового гидролизата из фракции, обогащенной главными сывороточными белками ф-лактоглобулином и а-лактоальбумином);
исследовать ростовые характеристики дрожжей рода Kluyveromyces -продуцентов Р-галактозидазы при культивировании на питательных средах, содержащих депротеинизированную молочную сыворотку;
разработать режимы получения ферментного препарата Р-галактозидазы из на-тивной биомассы дрожжей Kluyveromyces marxianus;
провести технико-экономические и эколого-экономические расчеты эффективности разработанной технологии.
Научная новизна.
Показано, что в рамках одной технологической схемы комплексной переработки молочной сыворотки возможно получение биологически активных продуктов белковой природы: лактоферрина, лактопероксидазы, иммуноглобулинов, белкового гидролизата, Р-галактозидазы.
Подтверждена возможность использования карбоксиметилцеллюлозы в качестве сорбента для выделения лактоферрина и лактопероксидазы из молочной сыворотки.
Экспериментально подобраны и научно обоснованы оптимальные условия ферментативного гидролиза фракции, обогащенной главными сывороточными белками ф-лактоглобулином и а-лактоальбумином), обеспечивающие степень гидролиза не менее 98 %.
Подтверждена возможность использования депротеинизированной молочной сыворотки и образующихся в предлагаемой технологии солевых стоков в качестве основы для приготовления питательной среды для культивирования дрожжей рода Kluyveromyces - продуцентов Р-галактозидазы.
Практическая значимость.
Разработана комплексная малоотходная технология переработки молочной сыворотки с получением биологически активных продуктов белковой природы (лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов, белкового гидролизата, Р-галактозидазы). Предлагаемая технология включает стадии ультраконцентрирования с использованием полупроницаемых мембран, ионообменную хроматографию на сорбенте карбоксиме-тилцеллюлозе, высаливание сульфатом аммония, ферментативный гидролиз, культивирование, дезинтеграцию клеток дрожжевой биомассы, осаждение в изоэлектрической точке. Разработаны способы очистки полученных белковых продуктов.
На основании полученных экспериментальных данных разработан лабораторный регламент и основные исходные данные для проектирования опытной установки комплексной переработки молочной сыворотки при расчетной мощности производства 30 000 тонн/год по перерабатываемому сырью. Проведена ориентировочная технико-экономическая оценка эффективности реализации предлагаемой технологии.
Апробация работы. Основные положения и результаты работы доложены на международной научно-практической конференции в рамках повышения квалификации «Технология молочных и молокосодержащих продуктов» (Ставрополь, 2008); Международных конференциях молодых ученых «Успехи в химии и химической технологии» (Москва, 2008, 2009, 2011); 6-ой Международной конференции «Сотрудничество для решения проблемы отходов» (Харьков, 2009); V и VI Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009, 2011); 3-ей конференции молодых ученых и специалистов «Обеспечение качества и безопасности продукции агропромышленного комплекса в современных социально-экономических условиях (Москва, 2009); Международной конференции молодых ученых, студентов и аспирантов «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений - V Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов» (Москва, 2011); Научно-практическом семинаре «Феномен молочной сыворотки: синтез науки, теории и практики» в рамках международной научно-технической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, и 12 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание объектов и методов исследования, изложение результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 209 наименований, в том числе 149 иностранных авторов, 4 приложения. Основной текст работы изложен на 140 страницах машинописного текста, включает 28 таблиц, 46 рисунков.
Способы выделения сывороточных белков из молочного сырья 28
Лактоферрин содержится в молоке, слюне, слезной жидкости, панкреатическом соке, секретах респираторного, желудочно-кишечного и генитального трактов, в сыворотке крови и лейкоцитах. Однако в наибольшем количестве он обнаружен в молозиве (6,7-7,0 мг/мл), в грудном молоке (2,6 мг/мл), в зрелом молоке (до 1,0 мг/мл). Содержание лактоферрина в молозиве коров тоже высокое (5 мг/мл), в обычном коровьем молоке этого белка около 0,2 мг/мл [72, 73], в молочной сыворотке 15-50 мг/л [74, 75]. Также лактоферрин обнаружен в молоке свиней, мышей, но полностью отсутствует в молоке собак и крыс [76]. Известно, что в молоке менее 10 % лактоферрина насыщено железом, то есть большая его часть находится в апоформе. Местом синтеза лактоферрина являются железистые клетки соответствующих эпителиальных тканей и нейтрофилы [77].
Биологические свойства лактоферрина Лактоферрин обладает уникальным набором биологических свойств различного характера. Будучи трансферриновым белком, он не только регулирует концентрацию ионов железа в крови и секретах, но и обладает выраженным антимикробным и антивирусным действием. Лактоферрин участвует в защитных реакциях организма и регулирует функции иммунокомпетентных клеток. Установлено, что лактоферрин гидролизует РНК [78].
Наиболее изученным является механизм антибактериальной активности человеческого и бычьего лактоферрина in vitro и in vivo на широком спектре грамоположительных и грамотрицательных бактерий. Лактоферрин связывает ионы железа и других металлов переменной валентности из среды поверхностных структур оболочек микроорганизмов и лишает последних жизненноважных микроэлементов, входящих в состав цитохромов дыхательной цепи, каталаз, пероксидаз и супероксиддисмутаз, кроме этого, снижает их резистентность к токсическому действию химических реактивных производных кислорода. Кроме этого, лактоферрин может специфически связываться с липополисахаридами бактериальных стенок, что приводит к изменению мембранной проницаемости и последующему лизису клеток [79]. За специфическое связывание с бактериальной стенкой ответственен лактоферрицин - пептид, расположенный на N-конце молекулы лактоферрина и получаемый in vitro протеолитическим расщеплением белка протеазой [72, 80].
Лактоферрин обладает антивирусной активностью против широкого спектра вирусов человека и животных. На данный момент изучено действие белка против вирусов простого герпеса 1 и 2, цитомегаловируса, ВИЧ, вируса гепатита С, хантавирусов, ротавирусов, полиовирусов первого типа, аденовирусов, респираторного синцитиального вируса, мышиного вируса лейкоза Фрейда [81, 82]. Основным механизмом антивирусной активности является связывание лактоферрина с глюкозоаминогликанами и липопротеинами мембран эукариотических клеток, которые препятствуют проникновению вирусных частиц. При этом пептид лактоферрицин, который обеспечивает основные антимикробные свойства лактоферрина, практически не проявляет антивирусной активности. В большинстве случаев апо-форма показывает гораздо большее антивирусное действие, чем холо-форма [83].
Лактоферрин и лактоферрицин проявляют антигрибковую активность против человеческих патогенных грибковых заболеваний. Лактоферрин ингибирует рост грибов рода Candida, Aspergillus fumigatus, Trichophyton mentagrophytes. Фунгицидные свойства обусловлены непосредственным взаимодействием белка с патогеном, а не способностью связывать свободное железо [68]. Например, действие лактоферрина на С. albicans in vitro приводит к изменению мембранного потенциала и закисленню цитоплазмы клеток р. Candida, что говорит о прямом или косвенном взаимодействии лактоферрина с плазматической мембраной [84]. Лактоферрин также обладает антиоксидантным действием. Это в первую очередь связано с тем, что он связывает железо, которое является сильным окислителем. Лактоферрин предотвращает перекисное окисление липидов в клеточной мембране. Таким образом, он предохраняет клетку от нарушений мембраны и процессов жизнедеятельности, так как через мембрану клетка получает питательные вещества и «держит связь» с другими клетками [85].
Лактоферрину отводится также важная роль при развитии иммунного ответа. Так, лактоферрин стимулирует клетки-пожиратели микробов (макрофаги) и регулирует активность клеток-киллеров, уничтожающих вредные бактерии и опухолевые клетки [86]. Применение лактоферрина Уникальные антибактериальные, противовирусные, фунгицидные, иммуномодулирующие, антиоксид антные, детоксицирующие и антиконцерогенные свойства этого природного железосвязывающего гликопротеина делают перспективным его использование в качестве активной основы фармакологических препаратов широкого спектра действия, пищевых БАД, продуктов лечебно-профилактической направленности.
В последние годы исследуются различные системы экспрессии рекомбинантного лактоферрина человека. В качестве таких систем используют дрожжи (Saccharomyces cerevisiae), грибы {Aspergillus awamory), насекомых (Bombyx mori) и растения (табак, рис, картофель, кукуруза). Кроме того, рекомбинантный белок выделяют из молока трансгенных животных (мышей, кроликов, коз, коров) [87, 88, 89, 90].
Количественное определение белков в растворах
Общее содержание углеводов определяли фенол-серным методом (метод Дюбуа), используя лактозу для построения калибровочной кривой [202]. Расчет концентрации углеводов Сугл (г/л) проводили по формуле:
Г = Х Р где X - концентрация углеводов в проанализированном разведении, найденная по калибровочному графику, г/л; Р - разведение анализируемого раствора.
Содержание редуцирующих веществ определяли по методу Бертрана-Шорля, с предварительным гидролизом пробы 2 н раствором НС1 (в соотношении 1:1) в течение 10 мин на кипящей водяной бане. Расчет содержания редуцирующих веществР5 (%) проводили по формуле: где Т глюкозы - титр растворов Фелинга по глюкозе, мг; V глюкозы - объем глюкозы, пошедший на дотитровку, мл; С глюк03ы - концентрация глюкозы, мг/мл; V пробы -объем анализируемой пробы, пошедшей на титрование, мл.
Количественное определение содержания липидов Содержание липидов определяли методом Сокслета, с предварительным высушиванием образца и использованием системы растворителей этанол: хлороформ (в соотношении 1:2) [202]. Массовую долю жира X (%) в сухой навеске вычисляли по формуле: m-nii Х = 100, m где m - масса сухой навески, взятой для анализа, г; mi - масса сухого остатка после экстракции, г. 2.3.5. Количественное определение лактоферрина методом ИФА Метод основан на твердофазном иммуноферментном анализе (ИФА) с применением поликлональных антител к лактоферрину. Концентрацию лактоферрина определяли методом иммуноферментного анализа с использованием набора «Вектор-Бест» по следующей схеме: -внесение по 100 мкл контрольного образца и калибровочных проб и 100 мкл исследуемых сывороток в рабочем разведении в дублях. -инкубация 30 мин, 37 С. -промывка рабочим промывочным раствором,300 мкл,5 раз. -внесение по 100 мкл рабочего раствора конъюгата. -инкубация 30 мин, 37 С. -промывка рабочим промывочным раствором,300 мкл, 5 раз. -внесение по 100 мкл рабочего раствора тетраметилбензидина. -инкубация 15 мин, 18-25 С. -внесение по 100 мкл стоп-реагента. -измерение оптической плотности (ОП) при 450 нм/ референсная длина волны 620-650 нм. В лунках, при добавлении исследуемого образца, во время первой инкубации происходит связывание лактоферрина с поликлональными антителами, иммобилизованными на внутренней поверхности лунок. Во время второй инкубации конъюгат поликлональных антител к лактоферрину с пероксидазой связывается с лактоферрином, иммобилизованным в ходе первой инкубации. Во время инкубации с раствором тетраметилбензидина происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окрашивания прямо пропорциональна концентрации лактоферрина в анализируемых пробах.
Метод основан на определении интенсивности окраски продукта окисления бензидина, образованного при действии пероксидазы [204].
В кювету на 20 мл приливают 0,5 мл раствора фермента и 3,5 мл воды, добавляют 2 мл свежеприготовленного 0,05% раствора бензидина. Затем в одну из кювет добавляют 2 мл 0,1% перекиси водорода. Выдерживают растворы 5 минут, и измеряют оптическую плотность раствора на ФЭК при красном светофильтре. Контрольный раствор содержит все ингредиенты, кроме перекиси водорода. Активность пероксидазы А (ед/мл) определяли по формуле:
Количественное определение иммуноглобулинов методом радиальной иммунодиффузии Принцип определения содержания иммуноглобулинов класса G основан на взаимодействии их с антителами, полученными против них [205]. На стеклянные пластины равномерно наносят смесь, содержащую 5мл 3% геля агарозы и 5 мл стандартной антисыворотки в рабочем разведении. Гель агарозы и антисыворотку готовят с использованием 0,1 М веронал -мединалового буфера (рН 8,6). В затвердевшем геле вырезают лунки, которые заполняют 2 мкл исследуемой биологической жидкостью и стандартной сывороткой в нескольких разведениях. Молекулы антигена радиально диффундируют из лунки и, встретившись с антителами, образуют кольцо преципитации. Площадь образующегося преципитата прямо пропорциональна концентрации иммуноглобулинов в исследуемой жидкости. Расчет содержания иммуноглобулинов класса G проводили по формулам: стані) где С - концентрация иммуноглобулинов в исследуемой жидкости, г/л; D -диаметр кольца преципитации исследуемой жидкости, мм; К - коэффициент наклона стандартной сыворотки; Встанд - диаметр преципитата стандартной сыворотки, мм; Сстанл - концентрация стандартной сыворотки, г/л. 2.3.8. Определение протеолитической активности модифицированным методом Ансона
Метод основан на гидролизе казеината натрия исследуемым ферментным препаратом, с последующей инкативацией фермента и осаждением негидролизованного белка трихлоруксусной кислотой [206]. Протеолитическую активность ПА (ед/г или ед/см ) рассчитывали по формуле: -4-1000 „, С -4-1000 ПА = ПА = ТЭ 10 а 10 а или где D - оптическая плотность опытного раствора; 4- отношение объема реакционной смеси после добавления трихлоруксусной кислоты к объему ферментного раствора; 1000 - коэффициент перевода полученных единиц на 1 г ферментного препарата; ТЭ - тирозиновый эквивалент; 10 - длительность инкубации реакционной смеси, мин; а - количество использованного ферментного препарата, мг на 1 смЗ ферментного раствора. За единицу протеолитической активности ПА (ед/г) принимают такое количество фермента, которое за 1 мин при 30 С превращает в неосаждаемое трихлоруксусной кислотой состояние казеинат натрия в количестве, соответствующем 1 мкмоль тирозина (1 мкмоль тирозина равен 0,181 мг).
К 50 мкл раствора Р-галактозидазы (суспензии с дезинтегрированными дрожжевыми клетками) добавляют 2 мл 1,25 М раствора о-НФГ в буфере (50 мМ КН2Р04 и ОД мМ МпСЬ 4Н20, рН 6,6), смесь инкубируют 5 мин при 37 С. Реакцию останавливают добавлением 0,5 мл 1М раствора Na2C03. Образующийся в ходе реакции о-нитрофенол имеет желтый цвет. Определяют оптическую плотность опытной пробы при длине волны 420 нм. Активность (3-галактозидазы А рассчитывали по формуле: A= D V up где D - оптическая плотность раствора при 420 нм; є - коэффициент молярной экстинкции о-нитрофенола, л/ммоль см (в данном случае є =4,5); t - время инкубации, мин; V- объем реакционной смеси, мл; V„p - объем раствора фермента, мл. 2.4. Методы исследования 2.4.1. Методика проведения ультраконцентрирования Процесс мембранного фракционирования молочной сыворотки проводили в лабораторных ультрафильтрационных ячейках с использованием полупроницаемых мембран УПМ (полисульфонамидные мембраны) и УАМ (ацетатцеллюлозные мембраны). Устройство лабораторной ультрафильтрационной ячейки и принцип действия установки для проведения фракционирования представлены на рис. 2.4.1.1 а) и б).
Методика проведения ферментативного гидролиза
В для хроматографии белков необходимо соблюдать результате ультрафильтрации молочной сыворотки была получена фракция, обогащенная иммуноглобулинами, лактоферрином, лактопероксидазой. Известно, что лактоферрин и лактопероксидаза, в отличие от иммуноглобулинов, являются катионными белками. Изоэлектрические точки лактоферрина и лактопероксидазы соответствуют значениям рН 8,0-8,8 и 8,6-9,6 соответственно. Анализ литературных данных показывает, что наиболее приемлемым способом для выделения катионных и анионных белков является ионообменная хроматография. При выборе ионообменников следующие требования. Главное из них - это «рыхлость» структуры сорбента, чтобы белок мог проникнуть внутрь частиц и достичь центров связывания. Кроме того, материал сорбента не должен взаимодействовать с белком. Этим требованиям не отвечают полистирольные смолы, и для разделения белков используются ионообменники на основе целлюлозы, декстранов и агароз. Чаще всего используют ионообменники на основе целлюлозы, декстранов и агароз с различными функциональными группами [126]. Для разделения катионных белков предпочтительными являются ионообменники с карбоксиметильными функциональными группами. В данной работе для сорбции лактоферрина и лактопероксидазы была использована карбоксиметилцеллюлоза. Для проведения адсорбции на катионите и последующей десорбции был использован фосфатный буфер со значением рН 6,5. Из литературных данных известно, что разница в значениях рН буферного раствора и изоэлектрической точкой белка должна отличаться не менее чем на единицу. Предполагается, что при значении рН меньше изоэлектрической точки белок имеет положительный заряд и адсорбируется на катионообменнике.
После сорбции лактоферрина и лактопероксидазы остается несорбированная фракция, обогащенная иммуноглорбулинами.
Первоначально, сорбцию проводили в статических условиях для определения соотношения раствор/ионообменник и времени, обеспечивающих максимальную сорбцию лактоферрина и лактопероксидазы.
Для этого заранее подготовленную карбоксиметилцеллюлозу добавляли во фракцию, обогащенную иммуноглобулинами, лактоферрином и лактопероксидазой, в объемном соотношении 5-40% и перемешивали в течение 3 часов (рис. 3.4.1 и 3.4.2). Р о 10
Кинетика сорбции Рис. 3.4.2. Кинетика сорбции лактоферрина в статических условиях при лактопероксидазы в статических условиях различном содержании карбоксиметил- при различном содержании карбокси целлюлозы в суспензии метилцеллюлозы в суспензии Из рис. 3.4.1 и 3.4.2 видно, что степень сорбции лактоферрина и лактопероксидазы не превышает 31 % и 36 % соответственно при добавлении ионообменника в количестве 40 % и времени процесса 120 мин.
Из литературных данных известно, что выделяемые ионообменной хроматографией белки должны быть растворены в том же буферном растворе, которым уравновешен ионообменник. Поэтому третью стадию диафильтрации фракции 1 проводили фосфатным буфером рН 6,5, в полученную фракцию вносили ионообменник в количестве 40 % (время сорбции 120 мин), при этом степень сорбции лактоферрина и лактопероксидазы составила 34,5 % и 40 % соответственно. Таким образом, из полученных данных видно, что проведение процесса в статических условиях не приводит к существенному увеличению степени сорбции целевых белков. Увеличение количества вводимого в концентрат сорбента (более 40 %) существенно затрудняет перемешивание суспензии.
Увеличения степени сорбции лактоферрина и лактопероксидазы попытались достичь двумя путями: 1) проведением сорбции в динамических условиях; 2) уменьшением концентрации лактоферрина и лактоперосидазы в исходном растворе. При пропускании рабочего раствора в количестве равном 5 объемов колонки со скоростью 10 мл/мин степень сорбции для лактоферрина составила 40%, для лактопероксидазы - 43 %.
Поскольку значительного увеличения степени сорбции исследуемых белков не произошло, далее был изучен процесс сорбции при различных концентрациях лактоферрина и активности лактопероксидазы в растворе. Для этого фракцию, обогащенную иммуноглобулинами, лактоферрином и лактопероксидазой разбавляли фосфатным буфером в 2-10 раз, и полученный раствор пропускали через колонку с ионообменником. Зависимости степени сорбции лактоферрина и лактопероксидазы от их содержания в растворе представлены в табл. 3.4.1.
Подбор оптимальных условий выделения лактопероксидазы, лактоферрина, иммуноглобулинов
Исследование концентрирования и очистки экстракта /?-галактозидазы. Проведение стадий концентрирования и очистки фермента обусловлено рядом технических сложностей, связанных, в основном, с лабильностью этих биологически активных веществ, потерей их активности под влиянием незначительных изменений внешних условий.
Среди других методов концентрирования ультрафильтрация имеет ряд очевидных преимуществ, поскольку проводится в мягких условиях, обеспечивающих меньший процент снижения активности фермента. Кроме того, ультраконцентрирование сопровождается очисткой от балластных низкомолекулярных примесей и увеличением активности фермента.
Экстракт (3-галактозидазы содержал 21530+520 ед/л (4,52 г/л белка). Концентрирование полученного раствора проводили в лабораторной ультрафильтрационной ячейке с мембраной УПМ-100, которая позволяет отделить высокомолекулярные белки с молекулярной массой более 100 кДа от низкомолекулярных белков. Основные параметры ультрафильтрации представлены на рис. 3.8.4 и 3.8.5.
Степень концентрирования Рис. 3.8.4. Зависимость удельной Рис. 3.8.5. Зависимость производительности мембраны от дифференциальной селективности по логарифма концентрации белка в белковым веществам от степени концентрате ультраконцентрирования В работе ограничились 15-кратным концентрированием, так как при увеличении степени концентрирования значительно увеличивается время процесса и падает производительность мембраны. При таком концентрировании интегральная селективность по белковым веществам составляет 15 %, а по 3-галактозидазы - более 97 %. Наблюдаемый факт свидетельствует о том, что первоначальный экстракт содержит кроме фермента еще и низкомолекулярные белковые вещества. В результате процесса получен концентрат, обогащенный ферментом и очищенный от других возможных низкомолекулярных внутриклеточных компонентов. Активность Р" галактозидазы в полученном концентрате составила 320760+4551 ед/л (концентрация белка 14,1 г/л). После проведения 3-х кратной диафильтрации был получен очищенный концентрат, содержащий 317115+3870 ед/л Р-галактозидазы при общей концентрации белка, равной 13,0 г/л.
Существует достаточно много способов получения очищенных ферментов, среди которых можно назвать осаждение в изоэлектрической точке, высаливание, диализ, гель-фильтрация, ионообменная хроматография. Предварительные исследования показали целесообразность осаждения ферментов в изоэлектрической точке.
Изоэлектрическая точка В галактозидазы находится в диапазоне рН 4,7-5,5. В концентрате, полученном на стадии ультрафильтрации, значение рН составляет 7,0, поскольку все ЭКСТраКЦИОННЫе ПрОЦеССЫ ПРОВОДИЛИСЬ С 2 3 4 5 6 7 использованием фосфатного буферного Рис. 3.8.6. Зависимость степени раствора с рН 7,0. Поэтому была осаждения р-галактозидазы от рН исследована зависимость степени раствора осаждения фермента от значения рН в растворе (рис. 3.8.6). Из представленных данных видно, что при рН 5,0 степень осаждения составляет максимальную величину 80 %. Основные характеристики полупродуктов, содержащих В-галактозидазу и стадии их переработки представлены в табл. 3.8.1.
Полученный осадок р-галактозидазы с удельной активностью 24 400 ед/г белка может быть далее направлен на стадию сушки без дополнительной обработки.
На основании проведенных исследований разработана принципиальная блок-схема комплексной переработки молочной сыворотки, включающая следующие стадии: последовательное ультрафильтрационное разделение молочной сыворотки; выделение лактопероксидазы и лактоферрина сорбцией на карбоксиметилцеллюлозе с последующей десорбцией растворами хлорида натрия; выделение иммуноглобулинов высаливанием сульфатом аммония; получение очищенных концентратов лактопероксидазы, лактоферрина и иммуноглобулинов ультрафильтрацией и диафильтрацией;
ферментативный гидролиз фракции, обогащенной а-лактоальбумином, (3-лактоглобулином и сывороточным альбумином крови, ферментным препаратом химопсином; культивирование дрожжей Kluyveromyces marxianus - продуцентов Р-галактозидазы на питательной среде, содержащей депротеинизированную молочную сыворотку и солевые стоки; выделение Р-галактозидазы из нативной биомассы дезинтеграцией толуолом, ультраконцентрированием, диафильтрацией, осаждением в изоэлектрической точке (рис. 3.8.7).
На основе проведенных исследований рассчитаны технико-экономические показатели трех вариантов технологических схем комплексной переработки молочной сыворотки мощностью 30 000 тонн/год, отличающиеся характеристиками исходного сырья и предусматривающие получение:
