Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Состояние вопроса . 8
1.1. Гречиха посевная важная сельскохозяйственная и экологическая культура . 8
1.2. Практическая применимость отходов производства гречихи 14
1.3. Перспектива использования гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Mill.) для получения востребованных биологически активных продуктов 18
1.4. Механизмы биоконверсии целлюлозосодержащей биомассы . 23
1.5. Факторы, влияющие на накопление биомассы кормовых дрожжей . 33
1.6. Экономико-экологические проблемы комплексной переработки целлюлозосодержащих отходов производства гречихи в биологически активные продукты . 39
ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования 42
2.1. Объекты исследования . 42
2.2. Методы исследования . 45
ГЛАВА 3. Технологии получения биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса гречихи посевной . 51
3.1. Качественная и количественная характеристики вегетативной массы гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Mill.) как сырья для получения биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса . 51
3.2. Подбор оптимальных технологических параметров экстрагирования биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса гречихи посевной 53
3.3. Получение биологически активных продуктов из вегетативной массы и соломы гречихи посевной 58
3.3.1. Технология получения рутина (порошка) из вегетативной массы гречихи посевной . 58
3.3.2. Технология получения биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса соломы гречихи 64
3.4. Качественное и количественное определение фагопирина в гречихе посевной 68
ГЛАВА 4. Исследование способов предобработки целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из вегетативной массы гречихи посевной как сырья для получения кормовых дрожжей . 70
4.1. Химический состав целлюлозосодержащих отходов от производства биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса гречихи посевной как сырья для культивирования микроорганизмов . 70
4.2. Оптимальные технологические параметры предобработки целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из вегетативной масс сы гречихи посевной . 72
4.2.1. Оптимальные технологические параметры кислотного гидролиза целлюлозосодержащего отхода от экстракции рутина из вегетативной массы гречихи посевной 72
4.2.2. Оптимальные технологические параметры ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего отхода от экстракции рутина из вегетативной массы гречихи посевной 77
ГЛАВА 5. Способ получения кормовых дрожжей на ферментолизате целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из вегетативной массы гречихи посевной 84
5.1. Изучение влияния исследуемого ферментолизата на рост микроорганизмов, используемых для получения кормовой дрожжевой биомассы . 85
5.2. Применение способов интенсификации роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae при получении кормовой биомассы на ферментолизате целлюлозосодержащего отхода от получения рутина из вегетативной массы гречихи посевной 88
5.3. Первичная токсико-биологическая оценка кормовых дрожжей, полученных на ферментолизате целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из вегетативной массы гречихи посевной 95
ГЛАВА 6. Технико-экономическая оценка комплексной биотехнологической переработки гречихи посевной в биологически активные продукты 99
Основные результаты и выводы исследований . 108
Список литературы
- Практическая применимость отходов производства гречихи
- Подбор оптимальных технологических параметров экстрагирования биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса гречихи посевной
- Оптимальные технологические параметры предобработки целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из вегетативной масс сы гречихи посевной
- Применение способов интенсификации роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae при получении кормовой биомассы на ферментолизате целлюлозосодержащего отхода от получения рутина из вегетативной массы гречихи посевной
Введение к работе
Актуальность темы исследования. В настоящее время актуальными являются научные исследования по разработке технологий рационального использования возобновляемых источников растительной биомассы, позволяющих наиболее полно использовать исходное сырье с получением ценных продуктов.
Гречиха посевная (Fagopyrum Esculentum Mill.) – важная продовольственная, лекарственная и медоносная культура. Благодаря короткому вегетационному периоду (от 64 до 120 суток) может возделываться в занятых парах, в послеукосных и пожнивных посевах, а также использоваться для пересева погибших озимых и яровых культур. В большинстве сельхозпредприятий России гречиха занимает крайне небольшие площади и не играет заметной роли в экономике зернового хозяйства. Лимитирующим фактором формирования сырьевой базы гречневого зерна является низкая урожайность (в среднем 7,9 ц/га).
Большой интерес гречиха представляет собой как источник биофлавоноидов, являющихся биологически активными соединениями полифункционального действия. Среди них особенно востребованным на рынке является рутин, широко используемый в медицинской практике, но не имеющий промышленного производства в России и странах Ближнего Зарубежья.
В настоящее время основным источником получения рутина в мире являются бутоны софоры японской (Sophora japonica L.), сырьевая база которой в России отсутствует. Потребность отечественной фармакологической отрасли в рутин-субстанции удовлетворяется за счёт импорта из Бразилии, Германии, Китая. Производство препарата из гречихи посевной является перспективным с экономической и экологической точки зрения (Анисимова, 2011; Клыков, 2013).
Известны различные способы получения рутина из цветков и листьев гречихи посевной, основанные на экстракции сухого сырья водно-спиртовыми растворами или водой с последующей выкристаллизацией при низких температурах и очисткой перекристаллизацией. Степень извлечения соединения составляет 50-70% (Баландина и др., 1982; Heywang, 1992; Huo, 1999).
При этом остаётся нерешённой проблема утилизации отходов от производства биологически активных соединений растительного сырья, которые представляют собой целлюлозосодержащий материал, вследствие своей грубой текстуры не находящий должного применения (Комисаренко, 1994; Федоров, 2004).
Степень разработанности темы. При переработке целлюлозосодержащего сырья, значительный опыт, накопленный в России, показывает эффективность применения методов микробиологического синтеза в решении этой проблемы с конечным получением кормовых продуктов для животноводства, обладающих высокой биологической ценностью (Эрнст, 1988; Шакир, 1995; Касаткина, 2008).
Научных исследований по биоконверсии целлюлозосодержащих отходов от производства рутина из гречихи посевной в рамках комплексной технологии в литературе нет.
Цель и задачи исследования. На основании вышесказанного цель диссертационного исследования состояла в экспериментальном обосновании возможности использования гречихи посевной (Fagopyrum Esculentum Mill.) для получения биологически активных соединений (в частности рутина) и дальнейшей переработки отходов от их производств в кормовые дрожжи.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
разработка технологии получения биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса гречихи сорта Дикуль, широко распространенного в Центральных регионах России;
исследование химического состава отходов от производства биологически активных соединений гречихи как сырья для культивирования микроорганизмов;
определение оптимальных параметров предобработки, ферментативного гидролиза отходов от производства биологически активных соединений гречихи и культивирования микроорганизмов с целью получения кормовых дрожжей;
разработка технологии получения кормовых дрожжей с использованием методов интенсификации роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae стимулятором из соломы гречихи;
проведение первичной токсико-биологической оценки кормовой биомассы;
определение технико-экономической оценки комплексной биотехнологической переработки гречихи в биологически активные продукты.
Работа проводилась в соответствии с Федеральной Целевой программой и Перечнем Критических Технологий РФ, подготовленным в соответствии с результатами долгосрочного прогноза научно-технологического развития Российской Федерации до 2030г., утверждённым Указом Президента РФ от 7 июля 2011 г. № 899 (пункт №8 «Нано-, био, информационные, когнитивные технологии».
Научная новизна результатов исследований. В результате проведенных исследований показана возможность использования всей вегетативной массы гречихи посевной (цветки, листья, стебель) сорта Дикуль в качестве сырья для получения рутина с извлечением целевого продукта 84%.
Впервые определены оптимальные параметры кислотного и ферментативного гидролиза целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из гречихи посевной, при которых получен ферментолизат с оптимальным составом сахаров для инокуляции дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Разработан и экспериментально обоснован способ получения кормовых дрожжей на ферментативных гидролизатах отхода от производства рутина из гречихи посевной методом глубинного гетерофазного культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae с применением способов интенсификации роста микробных клеток стимулятором из соломы гречихи.
Практическая и теоретическая значимость работы. Разработан способ получения рутина из вегетативной массы и стимулятора роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae из соломы гречихи. Получены патенты на изобретение «Способ получения рутина», «Способ получения стимулятора роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae».
Предложены способ получения кормовых дрожжей на ферментативных гидролизатах отхода от производства рутина из гречихи посевной и метод интенсификации роста дрожжевых клеток Saccharomyces cerevisiae стимулятором из соломы гречихи.
Материалы диссертации используются в учебном процессе при чтении лекций по специальности 240700 «Биотехнология» в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет».
Положения, выносимые на защиту:
методологические подходы к переработке вегетативной массы и соломы гречихи в биологически активные ценные продукты;
технологические схемы получения рутина, стимулятора роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae, кормовых дрожжей.
Апробация результатов исследований. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на XI Международном симпозиуме по гречихе (г. Орел, Россия, 2010); VI Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2011 г.); Международной научно-практической конференции молодых учёных «Животноводство России в условиях ВТО: от фундаментальных и прикладных исследований до высокопродуктивного производства» (Орел, 2013), на отчётных конференциях в ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» (с 2009 по 2012 гг.).
Апробирование технологий работы осуществлялась в полупроизводственных условиях на базе ООО «Биосинтез» (г. Орёл).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 работ, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.
Структура и объём работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, характеристики объектов и методов исследований, четырех экспериментальных глав, выводов, библиографического списка и приложений. Работа содержит 143 страницы машинописного текста, 16 таблиц и 20 рисунков, 7 приложений. Библиография включает 199 наименований, из них 48 зарубежных источника.
Практическая применимость отходов производства гречихи
Гречиха посевная (лат. Fagopyrum Mill.) – однолетнее травянистое растение из семейства Гречишные (Polygonaceae Juss.) вида Fagopyrum esculentum Mill [198].
Родиной гречихи являются горные районы Индии и Непала, где это уникальное по своей пользе и биохимическому составу растение культивируют более 4000 лет.
В XV веке до н.э. возделывание неприхотливой к условиям произрастания гречихи получило распространение в Японии, Китае, Корее, а немного позже – в странах Средней Азии, Кавказа и Ближнего Востока.
В конце VII - начале VIII веков крупяная культура гречиха была завезена в Киевскую Русь. Приготавливаемая из гречки гречневая (называемая в старину «чёрная») каша издавна и традиционно является одним из самых почитаемых блюд русской кухни.
Полезные качества крупы высоко ценил знаменитый русский полководец А.В. Суворов, называвший гречневую кашу «богатырской пищей». О пищевой ценности и целебных свойствах гречки упоминал в своих трудах основатель крупнейшей российский физиологической школы И.П. Павлов.
Народнохозяйственное значение гречихи. Высокий интерес к гречихи обусловлен тем, что она является одной из немногих сельскохозяйственных культур, которая обладает уникальным комплексом полезных для человека веществ.
Гречиха – ценная крупяная и кормовая культура. Гречневая крупа имеет высокие пищевые, вкусовые и диетические качества. В её состав входят органические кислоты (лимонная, яблочная, щавелевая), способствующие лучшей усвояемости микронутриентов. В крупе-ядрице содержится 15-17% белка, преобладающая часть которого (80%) представлена легкорастворимыми альбуминовыми и глобулиновыми фракциями. Белки характеризуются сбалансированностью по аминокислотному составу, высоким содержанием незаменимых аминокислот, в том числе лизина (530 мг/100 г), треонина (400 мг/100 г), валина (590 мг/100 г) и метионина (320 мг/100 г). По биологической ценности (аминокислотный скор) белки гречихи приближены к белкам сухого молока (92,3%) и куриных яиц (81,4-99,3%) [203].
Белок гречихи может блокировать накопление жира и увеличивать биологическую активность супероксиддисмутазы (SOD), каталазы (CAT) и глутатионпероксидазы (GSH-Px), обладает противоопухолевым, антивозрастным действием.
Углеводы в гречихе представлены преимущественно резистентным крахмалом (70%). В небольших количествах в зерне гречихе содержится клетчатка (1,1%) и другие полисахариды [93].
В липидах гречихи содержание ненасыщенных жирных кислот составляет 83,2%, олеиновой кислоты – 47,1%, линолевой кислоты – 36,1%. Они также представлены линоленовой кислотой и другими полиненасыщенными жирными кислотами.
Гречиха богата минералами и витаминами. Она превосходит другие крупяные культуры по содержанию в своём составе ниацина (витамина РР), рибофлавина и фолиевой кислоты. В ядрице содержится витамин Е, обладающий антиоксидантными свойствами.
Крупа гречихи характеризуется значительным содержанием в своём составе меди, кобальта, марганца и других микроэлементов. Особенно высоко количество ценных минералов – калия (167 мг/100 г), кальция (70 мг/100 г), фосфора (298 мг/100 г), магния (98 мг/100 г), железа (8 мг/100 г) и йода.
В последнее время растёт интерес к гречихе как к лекарственному сырью. Гречиха – единственная культура в России, которая содержит рутин (витамин Р). Современные фармакологические исследования показывают, что рутин способствует снижению уровня холестерина в крови, проявляет высокую антиоксидантную активность и применяется в лечении многих хронических заболеваний, таких как диабет, гипертония и других кардиососудистых патологий [7, 63, 66, 72, 149, 150]. Антиоксидантное действие рутина связывают со способностью акцентировать свободные радикалы и хелатировать ионы металлов, катализирующие процессы окисления [25].
Гречиха посевная является ценной сельскохозяйственной культурой, в вегетативных и генеративных органах которой синтезируются и накапливаются растительные полифенольные соединения (флавоноиды, антоцианы, дубильные вещества), являющиеся активными метаболитами клеточного обмена растения и играющие существенную роль в физиологических процессах – дыхании, фотосинтезе, росте, развитии и репродукции [23, 55, 65, 87].
Флавоноиды обладают антиоксидантными свойствами, участвуют в защите растений от неблагоприятных воздействий ультрафиолетовых лучей и низких температур. Антоцианам свойственно антимикробное действие и проявление антиокислительной активности. Дубильные вещества характеризуются бактерицидными и фунгицидными свойствами, выполняют защитную функцию в отношении возбудителей патогенных заболеваний [51, 71, 84].
Эти природные биологически активные соединения являются эффективными антиоксидантами и активными катализаторами окислительно-восстановительных реакций фенольных соединений [113].
В гречихе содержится токсический пигмент фагопирин, который вызывает отравление животных при поедании растения во время цветения, а также и после скармливания мякины и соломы с последующим интенсивным солнечным облучением. Отравления носят название фагопиризм или гречишной болезни и наносят большой ущерб животноводству, где они проявляются не только в виде падежа скота, но и в потере привеса и продуктивности животных.
Важно агрономическое значение гречихи как культуры. В условиях интенсификации зернового производства, она становится обязательным компонентом севооборотов. Благодаря короткому вегетационному периоду (в среднем от 64 до 120 суток в зависимости от сорта) гречиха может возделываться в занятых парах, освобождая поля под озимые культуры, использоваться для пересева погибших озимых и ранних яровых культур. В связи со скороспелостью её выращивают в послеукосных и пожнивных посевах, а также на зелёное удобрение.
Гречиха – яровая культура способна к длительному интенсивному росту. Важна средообразующая роль гречихи как важного звена в сельскохозяйственном севообороте. В 1 тонне её пожнивно-корневых остатках содержится 4,8-5,8 кг азота, 4-4,5 кг фосфора, 20-24 кг калия, 9-10 кг кальция в легкодоступной форме, что в 1,2-3 раза больше, чем в зерновых колосовых культурах. Корневые экссудаты культуры оказывают влияние на микробиологическую активность почвы, угнетая гнилостную микрофлору и тем самым улучшая фитосанитарное состояние посевных угодий.
Гречиха улучшает и физические свойства почвы, что важно при возделывании культур на суглинках. Общая скважность и аэрация почвы после её возделывания на 4-6% выше, чем после зернобобовых.
Характерной особенностью гречихи как культуры является экологическая чистота этого полезного растительного продукта. Качественное преимущество в ряду других зерновых культур обусловлено тем, что при своей невысокой урожайности (в среднем 7,9 ц/га), её посевы не обрабатываются синтетическими удобрениями и пестицидами (применение которых при культивировании гречихи может негативно отразиться на её органолептических свойствах, а также на медосборе) [198].
Подбор оптимальных технологических параметров экстрагирования биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса гречихи посевной
Лигноцеллюлоза устойчива к действию ферментов и степень её конверсии не превышает 10-15% [9, 151].
Наиболее изученным продуцентом целлюлаз, имеющим важное прикладное значение, является почвенный гриб рода Trichoderma, секретирующий два изофермента целлобиогидралазы, два изофермента -глюкозидазы [37, 134, 184, 186, 187, 188].
Промышленный препарат Целловиридин Г20х (ТУ 9291-008-05800805-93) (2000 ед целлюлазной активности в гр.) получают при глубинном культивировании гриба рода Trichoderma reesei (viride). В своем составе препарат содержит ферменты целлобиогидролазы, -глюканазы и ксиланазы [39].
Нет универсального коммерческого препарата для биодеструкции лигноцеллюлозного комплекса растительного сырья, необходимы оптимальные условия, при которых снижается реакционная способность природных полимеров. Ферментативному гидролизу целлюлозы препятствуют гемицеллюлоза, лигнин. Поэтому для увеличения реакционоспособности субстрата используют методы предварительной обработки, направленные на максимальное удаление лигнина и гемицеллюлозы из растительного сырья с помощью химических реагентов, физических воздействий и лигнолитических ферментов [19, 59, 133, 172, 183].
Реакция ферментативного гидролиза целлюлозы состоит из следующих стадий: диффузии молекул ферментов к поверхности нерастворимого вещества субстрата; сорбции ферментов и образование фермент-субстратного комплекса; реакции гидролиза и диффузии продуктов реакции в раствор. Лимитирующая стадия всего процесса – это диффузия реагентов и продуктов реакции [8, 130, 136].
Эффективная предварительная обработка лигноцеллюлозного сырья является оптимальным шагом в отношении эффективности и продолжительности ферментативного гидролиза [17, 131, 135]. Предобработка лигноцеллюлозного сырья приводит к разрушению кристаллической структуры целлюлозы и (или) разрушению (удалению) лигнина. Применяют физические (измельчение), физико-химические (термогидролиз) и химические способы воздействия.
В результате измельчения лигноцеллюлозных материалов происходит увеличение удельной поверхности субстрата а, следовательно, увеличение площади поверхности субстрата, доступной для молекул фермента. Интенсификация измельчения лигноцеллюлозы является важной задачей, так как в таких условиях подвергаются окислению биологически активные вещества, происходит конденсация лигнина и т.д. [145].
Для проведения эффективной предварительной обработки лигноцеллюлозы важно сохранить долю пентозанов, и ограничить образование продуктов, которые ингибируют действие литических ферментов [182].
Цель физико-химической обработки (термогидролиза) лигноцеллюлозного сырья – это разрушить лигнин и кристаллическую целлюлозу, чтобы кислотам и ферментам была доступна не аморфная часть целлюлозы. Кроме того, потребление энергии и стоимость предварительной обработки должны быть сведены к минимуму [181].
Существует два основных препятствия для гидролиза целлюлозы в глюкозу. Сама целлюлоза, благодаря своей кристалличности, обеспечивает устойчивость к химическому и ферментативному гидролизу. Главным препятствием является лигнин, уменьшающий ферментативное действие на целлюлозу до минимума [58].
Лигнин ингибирует энзиматическое расщепление целлобиозы (Hidaka et al, 1984). Инкубация целлюлазы с лигнином приводит к быстрой инактивации ферментов, что влияет на скорость и глубину ферментативного гидролиза целлюлозы [174].
Известны многие методы предобработки лигноцеллюлозной биомассы, и у каждого есть свои существенные недостатки [10, 89]. Например, при термогидролизе (под давлением при высоких температурах) – гемицеллюлоза существенно гидролизуется, тем самым улучшая доступ ферментов, но ферменты подавляются кислотами [44].
Обработка разбавленными кислотами имеет ряд серьезных недостатков – из-за риска коррозии, реакторы должны быть изготовлены из очень дорогих материалов. Кислоты должны быть нейтрализованы известью. В результате образуется гипс, который оказывает негативное воздействие на растворимость. Выход сахаров уменьшается за счет образования ингибиторов ферментативного гидролиза. Недостатком является удаление гипса, продолжительность обработки ферментом и очень энергоёмкое измельчение биомассы.
Предварительная обработка лигноцеллюлозной биомассы аммиаком приводит к высокой степени делигнификации, и при этом гидролитическое действие ферментов на таких гидролизатах снижается. Недостатком является высокая стоимость восстановления аммиака.
Во всех приведенных выше случаях лигнин не удаляется из целлюлозосодержащего субстрата полностью. Механическая активация является эффективным методом повышения реакционной способности лигноцеллюлозного сырья. [1, 80, 129].
Тенденцией последних лет стало применение механохимических методов в переработке возобновляемых источников сырья. Периодическая механообработка субстрата является эффективным методом увеличения реакционной способности целлюлозы за счёт увеличения её реакционной способности.
Механохимическая активация приводит к разрывам клеточных стенок сырья. Фрагментация волокон происходит по границе клеточной стенки. Наиболее вероятный механизм – это структурирование, скольжением слоев относительно друг друга. После механической активации остатки гомогенны, что дает возможность сделать вывод о нарушении межмолекулярного взаимодействия как внутри структурных слоев, так и между слоями в целом.
Оптимальные технологические параметры предобработки целлюлозосодержащего отхода от производства рутина из вегетативной масс сы гречихи посевной
Одной из острейших проблем современной науки и практики является утилизация и переработка органических отходов, которые чужды биосфере и не вписываются в естественный биологический круговорот, что приводит к загрязнению воздуха, воды, почвы и отрицательно сказывается на здоровье как человека, так и животного [11, 128].
Поэтому вопросы решения проблем экологически безопасного развития сельского хозяйства, утилизации сельскохозяйственных отходов, а также создание здоровой среды обитания в городах и сельских поселениях включены в основное положение государственной стратегии РФ по охране окружающей среды и обеспечению устойчивого развития (приложение к Указу Президента РФ от 04.02.94 №236 «О государственной стратегии Российской Федерации по охране окружающей среды и обеспечению устойчивого развития»).
Разработка способов переработки целлюлозосодержащих отходов, основанных на экологически чистом и безопасном способе утилизации, является инновационным аспектом устойчивого развития нашего общества. Комплексное использование возобновляемого растительного сырья – основа новых технологий [127].
В разработке любых биотехнологических технологий, связанных с биоконверсией возобновляемого целлюлозосодержащего растительного сырья, должны быть выделены следующие приоритетные направления: - комплексное использование растительного сырья для получения ценных продуктов; - разработка технологических процессов, обеспечивающих замкнутый цикл ресурсопотребления; - интенсификация процессов конверсии растительного сырья с целью повышения производительности технологического процесса, снижения трудозатрат и улучшения качества целевых продуктов. В основе создания безотходных (или малоотходных) производств лежат следующие основные принципы: - принцип системности, включающий сочетание элементов промышленного производства и хозяйственной деятельности человека, взаимосвязь производственных и природных процессов; - комплексности использования ресурсов (этот принцип предусматривает максимальное использование всех компонентов сырья и потенциала энергоресурсов); - цикличности материальных потоков, создания замкнутых водо- и газообразных продуктов; - рациональность организации безотходного производства.
Вопрос экономико-экологической утилизации отходов, образующихся при производстве, остается актуальным. Нерешённость этой проблемы влечет за собой не только снижение полноты переработки сырья, тем самым загрязняя окружающую среду, но и не использование ценных компонентов отходов в качестве дополнительной товарной продукции. Для того чтобы технологии переработки возобновляемого растительного сырья были экономически и экологически совершенны, перспективным является получение продуктов, которые невозможно (или дорого) получать традиционными химическими технологиями [124, 125, 126].
В литературных данных описаны технологии переработки целлюлозосодержащего растительного сырья с использованием многостадийных процессов для удешевления нерентабельного процесса ферментативного гидролиза, являющегося основным в технологии. При этом экономическая характеристика таких технологий зависит от рентабельности сопутствующих процессов и способов их использования. Чем выше затраты на производство, тем целесообразнее более эффективно использовать целлюлозосодержащее сырье (к которым и относятся отходы производства рутина из вегетативной массы гречихи посевной).
Применение разнонаправленности получаемых в рамках технологии продуктов делает предприятие более экономически устойчивым. Когда организация диверсифицирует свою деятельность, создавая разные направления бизнеса, таким образом, сокращается риск производства посредством его распределения между различными отраслями. В условиях рыночной экономики конкурентоспособным может быть гибкое, динамичное предприятие, которое адаптируется к изменяющимся условиям рыночной среды и спроса на его продукцию.
Таким образом, очевидна необходимость разработки комплексной биотехнологической переработки гречихи посевной с получением ценных продуктов для фармакологической и животноводства, которая будет решать экологическую проблему целлюлозосодержащих отходов и экономическую ситуацию региона.
Исследование проводилось в лаборатории биотехнологии и молекулярной экспертизы Центра коллективного пользования «Орловский региональный центр сельскохозяйственной биотехнологии» и в Инновационном научно исследовательском испытательном Центре ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» на инновационном оборудовании в период с 2009 по 2013 гг.
Основные объекты исследования: вегетативная масса и солома гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Mill.) районированного сорта Дикуль урожая 2009-2013 гг., предоставленные ООО «Биосинтез» (г. Орёл); биологически активные продукты: рутин; стимулятор; отход от производства рутина из вегетативной массы гречихи; ферментолизат отхода, полученного при использовании промышленного фермента Целловиридин Г20Х (ТУ 9291-008 05800805-93) с активностью 2000 Ед/гр. (производитель ОАО «Восток», Россия); кормовые дрожжи, полученные при культивировании на исследуемом ферментативном гидролизате производственного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae расы XII (предоставленные ОАО «Этанол», г. Орёл).
Экстракцию биологически активных веществ вегетативной массы и соломы гречихи из высушенного до влажности 6-8% и предварительно измельченного до 1,5-3 мм сырья проводили с использованием водно-спиртовых растворов на перемешивающем терморегулируемом устройстве ЛАБ-ПУ-01 (Россия).
Применение способов интенсификации роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae при получении кормовой биомассы на ферментолизате целлюлозосодержащего отхода от получения рутина из вегетативной массы гречихи посевной
Ферментолизат отхода от производства биологически активных соединений вегетативной массы гречихи (рутина) содержит в своём составе сахаров 61,9% (масс) и непроферментированную полисахаридную фракцию, представленную остаточными содержаниями целлюлозы, гемицеллюлозы, лигнина. В целях комплексного безотходного использования сырья, было исследована возможность роста на данном двухкомпонентном ферментолизате микроорганизмов, используемых для получения кормовой дрожжевой биомассы. Для получения кормовых дрожжей широко применяют дрожжи групп Candida, Saccharomyces, Hansenula, Torulopsis и др. Основным критерием при отборе того или иного продуцента белка для определённой среды является скорость роста культуры и способность ассимилировать питательные вещества.
В качестве микробных объектов использованы производственные дрожжи Sacchаromyces cerevisiae расы XII и штамм Candida tropicalic CK-4 (полученные из коллекции промышленных микроорганизмов).
Чистую культуру дрожжей с агаро-солодового сусла, высевали в пробирки, содержащие 100 мл субстрата, состоящего из солодового сусла и исследуемого ферментолизата в разных объёмах. Размножение биомассы проводили в термостате при температуре 26-30С в течение 18 ч. Оценку прироста биомассы дрожжей в культуральной жидкости в процессе их аэробного культивирования определяли взвешиванием осадка после центрифугирования (10 минут, 2000 об/мин).
Характеристика процессов накопления биомассы дрожжевыми культурами при добавлении исследуемого ферментолизата (с (и) без полисахаридной фракцией) в разных объёмах в ферментационную среду (контроль – без введения ферментолизата) представлена на рисунке 16.
Характеристика процессов накопления биомассы дрожжевыми культурами при добавлении в разных объёмах в ферментационную среду исследуемого ферментолизата: а) без полисахаридной фракции; б) с полисахаридной фракцией (контроль – без введения ферментолизата) Проведённое исследование показало, что дрожжи Sacchаromyces cerevisiae расы XII и Candida tropicalic CK-4 активно росли на приведённых питательных средах. Полисахаридная фракция полученного ферментолизата не вызывает явного ингибирующего действия на рост микроорганизмов.
Надо отметить, что прирост биомассы Candida tropicalic CK-4 меньше, чем культуры Sacchаromyces cerevisiae расы XII при использовании ферментолизата с (и) без полисахаридной фракции. Поэтому в дальнейшей работе, в качестве продуцента дрожжевого белка на исследуемом ферментолизате использовали Sacchаromyces cerevisiae расы XII.
По сравнению с контролем (стандартное размножение дрожжей Sacchаromyces cerevisiae расы XII на солодовом сусле), прирост дрожжевой биомассы выше при добавлении в ферментационную среду ферментолизата (в объёме от 5 до 100% (масс.)) без полисахаридной фракции (после отделения твёрдого остатка) на 29,16-79,16%, с полисахаридной фракцией - от 24,16 до 60,0%.
Использование ферментолизата без полисахаридной фракции, по сравнению с ферментолизатом с полисахаридной фракцией обеспечивает прирост биомассы на 3,87-5,6%. Очевидно это связано с накоплением в двухкомпонентном ферментолизате продуктов гидролиза лигнина (фенольных соединений), что обусловливает использование стимуляторов-антиоксидантов в процессе культивирования дрожжей на данной категории субстрата. Таким образом, проведён скрининг широко использующихся микроорганизмов-продуцентов кормового дрожжевого белка при выращивании на ферментолизате отхода от производства биологически активных соединений биофлавоноидного комплекса (рутина) гречихи посевной. Показано, что дрожжи Saccharomyces cerevisiae расы XII в процессе роста на исследуемом ферментолизате (с и без полисахаридной фракции) накапливают больше биомассы. Использование для получения дрожжевой биомассы ферментолизата с полисахаридной фракцией в своём составе является перспективным. Не надо в технологии получения ферментолизата использовать стадию отделения непроферментируемого остатка (полисахаридных фракций), что экономически эффективно. При этом не образуются технологические отходы, что делает процесс получения ферментолизата безотходным. Полисахаридная фракция в составе кормовых дрожжей будет обеспечивать энергией организм животного.
Применение способов интенсификации роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae при получении кормовой биомассы на ферментолизате целлюлозосодержащего отхода от получения рутина из вегетативной массы гречихи посевной Выбор стимулятора роста дрожжей, полученного из соломы гречихи и представленный кверцетином и цианидином, обусловлен действием биофлавоноидов в качестве активных катализаторов окислительно восстановительных реакций фенольных соединений, использование которого, с одной стороны, защищает дрожжевую клетку от фенолов сырья, стимулируя тем самым их рост и развитие, и с другой – обогащает микробную биомассу биологически активными соединениями. Выращивание дрожжей Sacсharomyces cerevisiae проводили на исследуемом ферментативном гидролизате (без удаления полисахаридной фракции) в периодических условиях ферментации методом гетерофазного глубинного культивирования при перемешивании (150 об./мин.) и аэрации среды воздухом, в присутствии источника азота (фосфорнокислых солей аммония), источников фосфора (минеральных солей калия, магния) и микроэлементов (соли железа, цинка, марганца и др.) в течение 12-16 часов при рН 6,0, температуре 30-34оС.
Стимулятор роста добавляли введением в среду в разных количествах на стадии подготовки посевного материала и непосредственно в ферментационную среду. В контрольном варианте стимулятор не использовали.
Для приготовления рабочего раствора, сухой измельченный порошок предлагаемого стимулятора, заливают дистиллированной водой из расчета 2 г стимулятора на 100 мл воды, затем растворяют на водяной бане при температуре 100оС в течение 3-5 мин. Изучение влияния концентрации стимулятора при внесении его на стадии подготовки посевного материала дрожжей Saccharomyces cerevisiae в каждом последующем пассаже. Показана целесообразность использования стимулятора на стадии подготовки посевного материала дрожжей Saccharomyces cerevisiae, подверженных многократному (до 6 пассажа) воздействию биологически активными соединениями соломы гречихи (рисунок 17). Рисунок 17 - Характеристика процесса накопления биомассы культурой Sacсharomyces cerevisiae при введении стимулятора в разных концентрациях на стадии подготовки посевного материала микроорганизма в каждом последующем пассаже (контроль – без введения стимулятора)
При гетерофазном глубинном культивировании дрожжей Saccharomyces cerevisiae 5 пассажа, подверженных воздействию стимулятором в каждом последующем пассаже в концентрации 10-9%, наблюдается увеличение концентрации биомассы микроорганизма на 42,8%, при использовании концентраций 10-8 и 10-9% - соответственно на 31,1 и 32,5%.
В 6 пассаже отмечается снижение прироста биомассы продуцента при всех рассмотренных концентрациях. В связи с этим, в дальнейших исследованиях не использовались дрожжи 6 пассажа. Сравнительная характеристика процессов ферментации дрожжей Sacсharomyces cerevisiae (5 пассажа) при внесении стимулятора на стадии подготовки посевного материала и непосредственно в ферментационную среду культивирования. Изучено влияния стимулятора в концентрации 10-8-10 10% на процесс ферментации дрожжей Sacсharomyces cerevisiae (представлены данные 5 пассажа) при внесении его в питательную среду для подготовки посевного инокулята и непосредственно в ферментационную среду культивирования. Результаты исследований представлены в таблице 9.
