Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 17
1.1. Этиология и распространение вирусно-бактериальных респираторных и желудочно-кишечных инфекций животных 17
1.2. Биологическая характеристика возбудителей респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота 21
1.2.1. Вирусные пневмоэнтериты крупного рогатого скота 21
1.2.1.1. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота 22
1.2.1.2. Парагрипп-3 крупного рогатого скота 27
1.2.1.3. Вирусная диарея-болезнь слизистых оболочек крупного рогатого скота(ВД-БСКРС) 35
1.2.1.4. Респираторно-синцитиальная инфекция крупного рогатого скота (РСИ) 39
1.2.1.5. Аденовирусная инфекция крупного рогатого скота 41
1.2.1.6. Рота- и коронавирусные инфекции крупного рогатого скота 42
1.2.2. Бактериальные возбудители желудочно-кишечных и респираторных заболеваний крупного рогатого скота 44
1.2.2.1. Сальмонеллезы 44
1.2.2.2. Пастереллезы животных 49
1.2.2.3. Эшерихиозы животных 55
1.2.3. Ассоциированные вирусо-бактериальные инфекции у крупного рогатого скота 63
1.4. Поливалентные сыворотки - эффективное средство для лечения и профилактики пневмоэнтеритов крупного рогатого скота 72
1.4.1. Общие принципы изготовления гипериммунных сывороток 72
1.4.2. Сыворотки против эшерихиоза 75
1.4.3. Сыворотки против сальмонеллеза 78
1.4.4. Сыворотки против пастереллеза 80
1.4.5. Поливалентные гипериммунные сыворотки 82
1.5. Система обеспечения качества лечебных сывороток на предприятиях биологической промышленности 85
2. Собственные исследования 91
2.1. Материалы и методы 91
2.2. Результаты исследований 119
2.2.1. Разработка и стандартизация методов изготовления и контроля качества исходных материалов для промышленного производства гипериммунных сывороток крови животных 119
2.2.2. Совершенствование и стандартизация технологии производства и контроля качества воды очищенной и воды для инъекций 123
2.2.3. Оптимизация и стандартизация технологических процессов производства гидролизатных питательных сред 131
2.2.4. Оптимизация и масштабирование процессов периодического культивирования пастерелл, сальмонелл и эшерихий 142
2.2.5. Разработка и стандартизация технологических процессов производства и методов контроля активности вирусных антигенов 150
2.2.5.1. Паспортизация сублиний клеток MDBK-субстратов производства вирусов ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота 150
2.2.5.2. Цитометрический анализ сублиний клеток MDBK 154
2.2.5.3. Оптимизация условий промышленного культивирования вирусов ПГ-3 и ИРТ крупного рогатого скота 162
2.2.6. Система менеджмента качества - основа эффективного производства и стандартизации лечебных СК животных 169
2.2.7. Разработка и стандартизация технологии производства и обеспечение качества «иммуносерум» - сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят 178
2.2.7.1. Отбор и паспортизация штаммов культуральных моделей для производства вирусных антигенов 179
2.2.7.2. Разработка технологии изготовления и оценка эффективности комплексных антигенов для гипериммунизации волов-продуцентов сыворотки против вирусных пневмоэнтеритов КРС 182
2.2.7.3. Разработка технологии серийного производства и обеспечения качества поливалентной сыворотки против вирусных пневмоэнтеритов телят 187
2.2.7.4. Лечебная и профилактическая эффективность поливалентной сыворотки против вирусных пневмоэнтеритов телят 195
2.2.8. Разработка и стандартизация технологии производства и обеспечение качества «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных» 199
2.2.8.1. Селекция, отбор и паспортизация штаммов эшерихий для производства поливалентного антигена 200
2.2.8.2. Масштабирование и оптимизация технологии производства поливалентного эшерихиозного антигена 210
2.2.8.3. Разработка оптимальной схемы производства и обеспечение качества «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных» 215
2.2.8.4. Профилактическая и терапевтическая эффективность «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных» 221
2.2.9. Разработка и стандартизация технологии производства и обеспечение качества «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота» 230
2.2.9.1. Изучение, отбор и паспортизация штаммов бактерий и вирусов для изготовления поливалентного антигена 230
-5 2.2.9.2. Разработка и стандартизация технологических процессов производства и контроля бактериальных и вирусных антигенов 240
2.2.9.3. Разработка технологии производства и обеспечения качества поливалентной сыворотки крови против респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота 247
2.2.9.4. Лечебная и профилактическая эффективность поливалентной сыворотки против респираторно-кишечных инфекций крупного рогатого скота 254
2.2.10. Совершенствование технологии производства и обеспечение качества поливалентных сывороток крови животных в соответствии с требованиями GMP 263
2.2.11. Технико-экономическое обоснование инноваций в технологии производства и обеспечении качества гипериммунных сывороток крови животных 276
2.2.12. Транспортировка и хранение лечебных и иммунобиологических препаратов в системе «Холодовой цепи» 284
2 3. Заключение 292
4. Выводы 313
5. Практические предложения 316
6. Список литературы 318
7. Приложение 381
7.1 .Паспорта штаммов 382
7.2.Нормативная документация 397
7.3.Акты испытаний 422
7.4.Патенты 435
- Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота
- Совершенствование и стандартизация технологии производства и контроля качества воды очищенной и воды для инъекций
- Селекция, отбор и паспортизация штаммов эшерихий для производства поливалентного антигена
- Совершенствование технологии производства и обеспечение качества поливалентных сывороток крови животных в соответствии с требованиями GMP
Введение к работе
1.1. Актуальность темы. Респираторно-кишечные и желудочно-кишечные инфекции занимают ведущее место в патологии крупного рогатого скота, на долю которых приходится от 55 - 70 до 100 % заболеваний новорожденных телят. Решающую роль в снижении естественной резистентности животных играют нарушения условий содержания, кормления и санитарно-гигиенических норм, скученное содержание на ограниченной территории, возникновение стрессов, завоз инфицированных животных, а также несвоевременная выпойка молозива новорожденными телятам, что отражено в работах Горбань Н.И., 1981; Федоров Ю.Н. и соавт., 1982; Атамась В.А. и соавт., 1986; Карпуть И.М., 1993; Красочко П.А. и соавт., 1999; Машеро В.А., 2006.
Ведущую роль в этиологии респираторно - кишечных и желудочно – кишечных инфекциях новорожденных телят занимают вирусы парагриппа-3, инфекционного ринотрахеита, диареи – болезни слизистых оболочек, ротавирусы, короновирусы, аденовирусы и возбудители пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза и других инфекций, дифференциальная диагностика которых затруднена в условиях производства. Заболевания телят протекают, в основном, по типу ассоциативных инфекций, а пусковым механизмом острых заболеваний считают вирусы, которые разрушают эпителий респираторного и желудочно-кишечного трактов и создают благоприятные условия для размножения микроорганизмов, по данным Урбана В.Н. и соавт., 1984; Сюрина В.Н. и соавт., 1988; Федорова Ю.Н. и соавт., 1996; Caldow G.L. et al., 1998; Басовой Н.Ю, 2002; Глотова А.Г. и соавт., 2005; Куриленко А.Н. и соавт., 2006.
Для профилактики и лечения РКИ новорожденных телят практикой рекомендуется вакцинация стельных коров, применение антибиотиков, иммуноглобулинов, моно- и поливалентных сывороток крови животных. Специфическая профилактика новорожденных телят малоэффективна, поэтому для защиты животных от заражения в первые часы после рождения применяют молозиво, антибактериальные препараты, а при подтвержденном диагнозе – моновалентные СК. Однако для экстренной профилактики и лечения ассоциативной инфекции наиболее перспективны поливалентные СК животных.
В последние годы разработан целый ряд поливалентных СК против пневмоэнтеритов КРС, которые серийно не производятся и не применяются в ветеринарной практике (Шегидевич Э.А. и соавт., 1992; Гаффаров Х.З. и соавт., 2000; Гуненков В.В. и соавт., 2010). Поэтому исследования, направленные на разработку и стандартизацию технологии серийного производства и обеспечения качества поливалентных СК для профилактики и лечения пневмоэнтеритов КРС являются весьма актуальными и востребованными практикой.
1.2. Степень разработанности проблемы. Изучению вопросов разработки, производства, контроля и применения гипериммунных СК посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных авторов (Бургасов П.Н., 1978; Медведев А.П., Вербицкий А.А., 2001; Русанов В.М., Левин И., 2004; Краснопольский Ю.М., Борщевская М.И., 2004; Медведев А.П., 2007).
Биологическая промышленность Российской Федерации на данном этапе готовит более 16 видов моно- и поливалентных СК животных и иммуноглобулинов, технология производства которых достаточно трудоемка и не соответствует требованиям национальных и международных стандартов. Наиболее значимыми элементом повышения качества и эффективности производства лечебных СК животных является «Система обеспечения качества», осуществляемая в соответствии с требованиями правил GMP и ГОСТ Р 52249-2009.
Недостаточно изученными остается широкий круг проблем, связанных с оснащением производства современным оборудованием, производственными помещениями высокого класса чистоты, совершенствованием ТП изготовления и методов контроля качества лечебных СК животных. Практического решения требуют вопросы подбора и паспортизации штаммов бактерий и вирусов, изготовления и стандартизации гидролизатных питательных сред, оптимизации условий периодического культивирования различных видов микроорганизмов, технологии изготовления и контроля животных и инактивированных антигенов, а также схемы гипериммунизации и эксплуатации животных-продуцентов. Необходимо также механизировать и автоматизировать ТП получения, обработки, фасовки, укупорки и этикетировки, контроля качества и доставки промышленных серий СК потребителю в системе «Холодовой цепи».
При организации серийного производства поливалентных СК согласно требования ГОСТ ИСО 9001-2011 особое внимание следует уделять разработке системного подхода «Системы обеспечения качества» и «Системы посевных материалов» (Seed Lot System) и методов обеспечения их качества. Системный подход в производственной практике не получил широкого применения при изготовлении лечебных сывороток, поэтому его реализация на практике является актуальной. Решение указанных проблем требует также подбора современного оборудования и технологических решений, позволяющих существенно повысить активность и конкурентоспособность, а также снизить себестоимость промышленных серий поливалентных СК животных.
Поливалентные СК против РКИ и вирусных пневмоэнтеритов телят в РФ не производились соответственно до 2003 и 2009 годов, но были востребованы практикой, что послужило основанием для разработки и серийного производства оригинальных по составу и технологии изготовления «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», «Иммуносерум-сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят», а также «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных». При реализации этих задач предусматривалось решение целого ряда научных и технологических проблем, в том числе повышение качества, эффективности и конкурентоспособности лечебных препаратов на отечественном и международном рынках. Внедрение в практику указанных инноваций при серийном производстве и поливалентных СК является приоритетной задачей биопредприятия.
1.3. Цель и задачи исследований. Цель работы - разработка и усовершенствование технологии промышленного производства, обеспечение качества и эффективности поливалентных сывороток против респираторно-кишечных инфекций КРС и эшерихиоза сельскохозяйственных животных и разработке современных средств и методов изготовления нового препарата для профилактики и терапии вирусных пневмоэнтеритов телят в соответствии с требованиями CMP.
Для достижения поставленной цели решились следующие задачи:
- анализ традиционных технологий промышленного сывороточного производства;
- разработка технологических и аппаратурно-технологических схем получения исходных материалов и поливалентных сывороток;
- реинжиринг производства согласно требованиям GMP;
- научное обоснование выбора штаммов, методов изготовления и контроля активности живых и инактивированных бактериальных и вирусных антигенов;
- определение условий гидролиза белоксодержащих материалов и методов изготовления гидролизатных питательных сред с учетом метаболизма микроорганизмов;
- масштабирование процессов периодического культивирования микроорганизмов;
- научное обоснование выбора культуральных моделей для серийного производства вирусных антигенов методом проточной цитометрии (ПЦ);
- разработка технологии производства, методов обеспечения качества и эффективности «Адгезивной антитоксической сыворотки против эшерихиоза сельскохозяйственных животных»;
- разработка технологии производства, методов обеспечения качества и эффективности «Иммуносерум – сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят»;
- разработка технологии производства, методов обеспечения качества и эффективности поливалентной сыворотки против ассоциативных респираторно-кишечных инфекций телят вирусной и бактериальной этиологии;
- усовершенствование системы хранения и транспортировки лечебных и иммунобиологических препаратов в «Системе холодовой цепи»;
- разработка нормативной документации и организация серийного производства поливалентных сывороток крови животных.
1.4. Научная новизна. Научно - обоснован единый подход к разработке и усовершенствованию технологических процессов производства, обеспечению качества трех видов поливалентных СК с учетом требований стандартов ИСО серии 9000, правил CMP и ГОСТ 52249-2009.
Усовершенствована технология очистки воды водопроводной с использованием современного высокопроизводительного оборудования, обеспечивающего производство промышленных объемов ВО и ВИ, отвечающих требованиям национальных и международных стандартов.
Научно обоснован дифференцированный подход к условиям и длительности ферментативного гидролиза различных белоксодержащих материалов с учетом метаболизма пастерелл, сальмонелл и эшерихий.
Определены параметры периодического культивирования микроорганизмов, позволяющие интенсифицировать кинетические процессы размножения, сократить время, многократно повысить уровень накопления и жизнеспособность пастерелл, сальмонелл и эшерихий.
Впервые методом ПЦ отобрана, аттестована культуральная модель (MDBK-E), отвечающая требованиям отечественных и международных стандартов, для серийного производства и контроля активности вирусов парагриппа-3 (ПГ-3) и инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота.
Научно обоснованы требования к штаммам, технологии производства и контролю качества бактериальных и вирусных антигенов. Проведен скрининг изолятов, эталонных и производственных штаммов и отобраны возбудители вирусов, пастереллеза, сальмонеллеза и эшерихиоза с полным набором факторов патогенности, на основе которых разработаны комплексные препараты с выраженными антигенными свойствами. В процессе гипериммунизации не выявлено конкуренции антигенов и аллергизации животных-доноров.
Впервые разработаны технология производства, система обеспечения качества и эффективная схема применения «Иммуносерум-сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят». Оригинальность и новизна способа получения препарата защищены патентом РФ №2407543.
Впервые разработаны технологическая схема производства и система обеспечения качества более эффективной «Сыворотки антиадгезивной антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных», обеспечивающая защиту животных от широкого спектра вирулентных штаммов с полным набором факторов патогенности.
Усовершенствована технология производства, система обеспечения качества «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота».
1.5. Практическая значимость работы.
Экспериментально и экономически обосновано применение разработанных технологических решений при серийном производстве высокоэффективных поливалентных сывороток крови для профилактики и лечения заболеваний вирусной и бактериальной этиологии сельскохозяйственных животных.
Проведено масштабирование технологии производства поливалентных сывороток крови животных.
Созданы и внедрены технологические линии для комплексной очистки воды водопроводной, определены общие требования к условиям и длительности ферментативного гидролиза белоксодержащих материалов с учетом требований метаболизма микроорганизмов.
Определены условия серийного производства и требования к качеству бактериальных и вирусных антигенов.
Внедрена в производство «Система обеспечения качества» лечебных сывороток в соответствии с требованиями стандартов ГОСТ ИСО 9001-2011, правил GLP, GMP и ГОСТ Р 52249-2009.
Созданы и реализованы на практике «Система посевных материалов» (Seed Lot System) микроорганизмов, вирусов и клеточных культур.
Разработана и внедрена в условиях биопредприятия «Система менеджмента качества» производства гипериммунных СК животных на основе стандартов ИСО серии 9000:2000.
Разработана и внедрена «Система управления качеством» на основе статистических методов контроля соответствия активности лечебных сывороток и технологических процессов производства стандартным показателям.
Создана и успешно функционирует «Система холодовой цепи», позволяющая осуществлять регламентированное хранение и своевременную доставку лечебных и иммунобиологических препаратов потребителю.
Разработаны и утверждены в установленном порядке комплекты нормативных документов на производство, контроль и применение поливалентных сывороток. Организовано серийное производство «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», «Сыворотки антиадгезивной, антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных» и «Иммуносерум-сыворотки для лечения и профилактики вирусных пневмоэнтеритов телят».
1.6. Положения диссертации, выносимые на защиту:
- отбор и паспортизация штаммов микроорганизмов, обладающих полным набором факторов патогенности;
- использование метода ПЦ для отбора и паспортизации перевиваемых линий клеток, предназначенных для изготовления и контроля вирусных антигенов;
- методы получения и контроля посевного материала для серийного производства бактериальных и вирусных антигенов и перевиваемой линии клеток;
- условия периодического культивирования микроорганизмов;
- технологические линии по производству ВО и ВИ, ГПС, вирусных и бактериальных антигенов и поливалентных СК животных;
- усовершенствование схем гипериммунизации и эксплуатации животных-продуцентов при производстве поливалентных сывороток крови;
- система управления качеством, предусматривающая применение статистических методов контроля исходного сырья, полуфабрикатов и готовой продукции, постоянный мониторинг показателей ТП и их коррекция при производстве поливалентных СК животных.
1.7. Внедрение результатов. На биопредприятии внедрены разработанные технологии серийного производства «Сыворотки против пастереллеза, сальмонеллеза, эшерихиоза, парагриппа-3 и инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», «Сыворотки антиадгезивной, антитоксической против эшерихиоза сельскохозяйственных животных» и «Иммуносерум-сыворотки для лечения и профилактики пневмоэнтеритов телят», которые успешно реализуются и применяются в ветеринарной практике. Рекламаций на качество поливалентных сывороток в период 2006-2013 гг. не поступало. Годовой экономический эффект от внедрения в практику указанных инноваций составил 737835,62 рублей.
1.8. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на:
XVIII, XIX, ХХ, XXI, XХII Международных конференциях и дискуссионного научного клуба. Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии – Украина, Крым, Ялта-Гурзуф, 2010-2014 гг;
Международной конференции, посвященной 80-летию организации ВГНКИ «Лекарственные препараты для животных: разработка, производство, эффективность и качество», Москва, 2011;
Международной научно-практической конференции «Научные основы производства и обеспечение качества биологических препаратов АПК», Щелково, 2012;
Международном симпозиуме, посвященном 80-летию Аграрного университета Молдова - Кишенев, 2013;
Международной научно-практической конференции, посвященной 90-летию РУП «Института Экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского – Минск, 2013.
1.9. Публикация научных исследований. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 41 научных работах, в том числе 1 монография и 13 статьях в изданиях по перечню, рекомендованному ВАК Минобрнауки России для публикации материалов докторских диссертаций. По результатам исследований получены 3 Патента РФ.
1.10. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 426 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих: материалы и методы, результаты исследований, заключение, выводы, практические предложения, список литературы и приложения на 5 страницах. Диссертация иллюстрирована 68 таблицами и 32 рисунками. Список литературы включает 615 источников, из которых 434 отечественных и 181 зарубежных авторов. В приложении представлены копии документов, подтверждающих достоверность результатов работы, её научную и практическую значимость.
1.11. Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автором лично сформулирована проблема, постановка цели и задач исследований и их реализация в условиях производства. Осуществлен подбор современного оборудования и на их основе созданы и апробированы технологические линии по изготовлению и контролю ВО и ВИ, ГПС и стандартных бактериальных антигенов с использованием современных биореакторов и периодического метода культивирования микроорганизмов. Лично автором или под его руководством подобраны штаммы, схемы гипериммунизации и эксплуатации ВП, оптимизированы условия и технология производства СК, хранения и транспортировки лечебных препаратов в «Системе холодовой цепи».
Для решения этих задач автором на предприятии создан «Отдел контроля качества» (ОКК), внедрены статистические методы контроля и «Система обеспечения качества», что позволило проводить валидацию и коррекцию ТП производства на всех этапах технологического цикла и повысить стабильность и активность поливалентных СК животных. Отдельные этапы работы проводились совместно со специалистами ВНИИТИБП и ВГНКИ. Все материалы диссертации проанализированы и обобщены лично автором. Вклад в работу других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.
1.12. Благодарности. Автор выражает благодарность научному консультанту – директору ВНИТИБП, доктору ветеринарных наук, профессору, академику РАН А.Я. Самуйленко. В выполнении некоторых разделов диссертации принимали участие и оказывали практическую и консультативную помощь доктор биологических наук В.И. Еремец, доктор биологических наук Т.А. Скотникова, доктор биологических наук В.И. Смоленский, доктор ветеринарных наук М.К. Пирожков, заведующий лабораторией «ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» С.В. Хайдуков, заместитель директора РУП «Института экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского» П.А. Красочко, за что приносим им сердечную благодарность.
Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота
Инфекционный ринотрахеит (пузырьковая сыпь, инфекционный вульвовагинит, инфекционный некротический ринотрахеит, инфекционный ринит, красный нос, инфекционный катар верхних дыхательных путей) — остро протекающая контагиозная болезнь крупного рогатого скота, характеризующаяся поражением дыхательных путей, лихорадкой, общим угнетением и конъюктивитом, в некоторых случаях появлением пустулезного вульвовагинита и баланопостита при попадании вируса в половые органы животных, абортами у беременных животных. Инфекционный ринотрахеит крупного рогатого скота внесен в список секции «В» справочника, выпущенного Офисом МЭБ, который включает болезни, передающиеся и рассматривающиеся как «имеющие социально-экономическую важность и /или важность в здравоохранении внутри стран, а также значение в международной торговле животными или животноводческими продуктами» [http://www.oie.int1. [161, 164, 169, 177, 258, 488, 562, 590, 597].
Впервые болезнь зарегистрирована в США в 1950 году у откормочного скота N.G.Miller [538] , вирус выделен H.Madin et al [368] в 1956 году из носовых истечений телят с острым респираторным заболеванием. После этого ИРТ установлен в различных странах мира, о чем указывают многие авторы. Возбудитель ИРТ широко распространен в популяции КРС. Серопозитивность взрослого скота, перенесшего инфекцию, достигает 5-65% [368, 444, 445, 470, 560].
В естественных условиях заболевает только крупный рогатый скот, независимо от породы и возраста. Наиболее тяжело болезнь протекает у откормочного поголовья, особенно мясных пород. Вирус способен вызвать развитие респираторной болезни у телят в моноварианте, однако, течение ее кратковременное. Возбудитель ИРТ, таким образом, является предрасполагающим фактором для развития вторичной бактериальной бронхопневмонии, часто приводящей к гибели животных. Экспериментально удается заразить овец, коз, свиней, оленей [64, 131, 201, 258, 368, 578, 589, 590].
В СНГ сходное по клиническим и патологоанатомическим признакам заболевание наблюдал в 1938 году Ф.М.Пономаренко [186]. Вирус впервые выделил Н.Н.Крюков в 1969 году от больных телят из хозяйств Тамбовской области. Сообщения последних лет [3, 11, 28, 34, 61, 142, 315, 322, 366] свидетельствуют о дальнейшем распространении ринотрахеита в хозяйствах с высокой концентрацией сборного поголовья.
Согласно современной классификации возбудитель ИРТ КРС (Bovine herpesvirvs-1), относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Varicellovirus ДНК содержащий. Предствавители этого семейства характеризуются быстрой репликацией, вызывают лизис инфицированных клеточных культур [147, 385, 490, 545]. Свойства вируса ИРТ общие для всех представителей рода Herpesvirus и включают: центральное ядро, двухцепочная ДНК, окруженная икосаэдрическим капсидом, состоящим из 162 камсомеров; формирование капсидов в ядре клетки-хозяина и почкование их на ядерной мембране при созревании; наличие трехслойной оболочки, состоящей из компонентов вируса и клетки-хозяина; продуцирование внутриядерных телец-включений; способность к длительной персистенции, латенции и рецидивам заболевания [109, 368, 458].
Вирусные частицы имеют следующие размеры, установленные различными способами: 175 нм — методом фильтрования [487, 521]; 148-210 нм — методами ультрацентрифугирования [532] и 100-300 нм — электронной микроскопии [185, 267, 397]. Диаметр нуклетиода — 36-45 нм [185, 267, 397], молекулярный вес ДНК — 92-102х10б дальтон, диаметр нуклеокапсида — 82-110 нм. Константа седиментации зрелого вириона 1630-1830 S, плавучая плотность в градиенте плотности сахарозы— 1,248-1,267 [92].
Для культивирования вируса ИРТ применяют различные культуры клеток из тканей крупного рогатого скота, овец, коз, лошадей, реже свиней и кроликов [141, 229, 366, 494]. Этот вирус обладает широчайшим тканевым тропизмом. Он может инфицировать клетки надпочечников, вилочковой, щитовидной и поджелудочной желез, семенников, легких, лимфатических узлов, почек как крупного рогатого скота, так и других видов животных [532].
При изучении ЦПД в неокрашенных препаратах в клеточном монослое заметно округление клеток, зернистость, расположение их кучками в виде скоплений, конгломератов в виде гроздьев [141, 229, 412, 500].
В связи с тем, что вирус ИРТ вызывает многочисленные клинические симптомы у крупного рогатого скота, проведены многочисленные исследования по дифференциации штаммов герпесвирусов I, вызываемые различные формы заболевания. Были использованы многие методы, такие как нейтрализационная кинетика, термолабильность, электронное микроскопирование, размножение в тканевых культурах, плавучая плотность, величина бляшек в клеточных культурах, устойчивость к трипсину, зональный электрофорез, рестрикционный анализ, которые позволили установить некоторое различие между штампами вирусов, вызывающие инфекционный ринотрахеит и пустулезный вульвовагинит.
Существует один антигенный тип вируса и генетические подтипы (1.1-респираторные, 1.2 а/Ь - генитальные и 1.3 - выделенные от животных с клиникой менингоэнцефалитов). Генетические подтипы различаются по вирулентности, подтип 1.3 выделен в отдельный тип BHV-5. Подтип 1.1, несмотря на то, что отнесен к респираторному, чаще вызывает аборты и реже -энцифалиты. Считается, что подтип 1а вызывает аборты, подтип 16 - нет, хотя оба подтипа выделяются от животных, больных баланопоститами и вульвовагинитами.
Однако эти различия не обнаруживают зависимости между клиническими признаками заболевания и геномным анализом этих штаммов, что позволило предположить, что только путь инфицирования и тип хозяйства могут быть более важным фактором для клинического проявления заболевания, чем штамм вируса. В зависимости от локализации патологического процесса различают несколько форм болезни — респираторную, конъюктивитальную, нервную, генитальную, абортивную, кожную, стомальную, энтеральную [78, 229, 295, 300, 315, 330, 383, 500, 590].
Наибольшее распространение в патологии крупного рогатого скота имеют респираторная, генитальная, абортивная формы, которые наносят большой экономический ущерб животноводству. Ряд исследователей установили взаимосвязь течения энтеральной, генитальной и респираторной форм ИРТ у крупного рогатого скота различных половозрастных групп.
Генитальная форма проявления ИРТ у коров протекает с признаками воспаления слизистой оболочки с последующей некротизацией эпителия, образования пустул и язв. Локализация процесса во влагалище не всегда приводит к нарушению репродуктивной функции. Если же вирус проникает в более глубокие части полового аппарата, например, при осеменении инфицированной спермой, возникают цервициты, эндометриты, сальпингиты, оварииты, которые носят временный характер, хотя могут наблюдаться случаи продолжительного бесплодия, которое выражается в многократных перегулах. У стельных животных вирус ИРТ может вызывать гибель эмбриона, на более поздних стадиях стельности — гибель плода и аборт или же рождение нежизнеспособных, гибнущих в первые сутки телят. Действие вируса на плод выражается в постепенном прекращении плацентарного кровообращения и последующей дегенерацией плаценты, что сопровождается абортами [525, 534, 538, 539, 543, 564]. Другие исследователи [557] свидетельствуют о поражении плода без патологических изменений в плаценте. Это говорит о том, что плод может быть местом первичного размножения вируса. Установлено, что у плодов 90-100 дневного возраста вырабатываются противовирусные антитела, относящиеся к IgGi, IgG2, IgM и IgA классов. В защите плода принимают участие и неспецифические факторы защиты — интерферон и фагоцитоз [457].
Респираторная форма заболевания наиболее часто встречается у молодняка, хотя могут поражаться и взрослые животные [109, 123, 571, 583]. Заболевание клинически проявляется повышением температуры тела, застойной гипермией, воспалением слизистых оболочек носа, выделение вначале серозных, а затем слизисто-гнойного экксудата. Воспаление слизистой оболочки гортани, трахеи вызывают повышенную секрецию в этих участках, сужение щели гортани и просвета трахеи, закупорку бронхиол, что сильно затрудняет дыхание и усиливает дыхательный шум. В результате этого возникает кашель. При тяжелом течении ИРТ часто заканчивается гибелью животного [20, 28, 546].
Совершенствование и стандартизация технологии производства и контроля качества воды очищенной и воды для инъекций
Современная схема производства лечебных СК и ИБП невозможна без широкого использования высококачественных исходных материалов, в том числе воды различной степени очистки, которая является незаменимым компонентом при изготовлении ПС и растворов. Поэтому особое внимание уделяется оптимизации ТП водоподготовки и совершенствованию методов контроля качества партий воды различной степени очистки с учетом результатов статистических методов контроля и управления качеством продукции. Необходимость проведения данных исследований обусловлена тем, что исходные источники воды загрязнены тяжелыми металлами, нефтепродуктами, аммонийным, нитритным и нитратным азотом, фосфатами, фенолами, хлорорганическими веществами-полихлорбифенилами (ПХБ), радиоактивными веществами и многими другими токсическими элементами и соединениями, а также инфицированы различными микроорганизмами [81, 102, 316, 351].
В работе преследовали цель подобрать современное оборудование, оптимизировать ТП производства и методы контроля качества воды очищенной (ВО) и воды для инъекций (ВИ) с помощью статистических методов управления качеством продукции.
Для повышения эффективности водоподготовки было подобрано современное оборудование и на его основе созданы две технологические линии. В целях стандартизации условий производства воды использовали «процессный подход» [333], при реализации которого были определены критические точки риска и предельно допустимые значения технологических показателей. С учетом документированных фактов и результатов валидационных испытаний контрольно-измерительных приборов, оборудования и коррекции ТП, организован постоянный мониторинг условий получения и контроля качества ВО и ВИ [278, 344, 346, 391, 392].
Анализ качества исходных источников ВВ в период 2004-2008 г.г. показал, что в образцах продукта постоянно обнаруживаются механические включения (MB), микроорганизмы-контаминанты (МК), элементы железа и чрезвычайно высокий уровень жесткости (3,3±0,2 мг - экв/л) и хлоридов (127,0±1,73 мг/л).
На предварительном этапе ВВ очищается методом дистилляции (линия А) и на установке «Водопад» (линия В) от растворенного и нерастворенного железа, взвешенных частиц, свободного хлора на 95%, органических веществ на 70%, с последующим осветлением и частичной стерилизацией полученного продукта через фильтры с диаметром пор 10 и 5 мкм и при помощи ультрафиолетового (УФ) облучения. Полученный полуфабрикат воды отводится и сохраняется в накопительных емкостях объемом до 5000л (рис. 7, табл. 5). Сравнительный анализ эффективности ТП водоподготовки свидетельствует о том, что замена процесса дистилляции на метод комплексной очистки ВВ на установке «Водопад» дает возможность повысить выход и снизить себестоимость 1 т целевого продукта в сопоставимых ценах в 3,6 раза.
Дальнейшая очистка воды осуществляется на установке УВОИ-МФ-8040-6 производительностью 8000 л/ч. Полученный пермеат-поток ВО соответствовал требованиям ФС 42-2619-97 [391] и не давал положительных реакций на хлориды, сульфаты, кальций, тяжелые металлы и восстанавливающие вещества. рН среды и уровень удельной электропроводности (УЭ) поддерживался соответственно на уровне 5,0-7,0 и 2,87±0,14 мкСм/см, но не более 4,3 мкСм/см.
За пятилетний период на предприятии было изготовлено 1428 серий ВО объемом 24990 т, которая соответствовала требованиям нормативно-технической документации и успешно использовалась для изготовления растворов, бактериологических питательных сред (ПС), в том числе бульона Хоттингера, мойки лабораторной посуды и технологического оборудования или сохранялась в накопительной емкости, изготовленной из полипропилена. Успешное производство ВО и ВИ было достигнуто за счет создания современной материально-технической базы и технологической линии с использованием высокопроизводительного оборудования (рис. 6), подготовки и аттестации профессиональных кадров, разработки и гармонизации нормативно-технической документации, в том числе маршрутных карт, а также создания организационной структуры, определяющей политику и осуществляющих мониторинг показателей ТП производства и контроля качества исходного сырья и промышленных серий ВО и ВИ на всех этапах технологического цикла.
Для оценки стабильности ТП водоподготовки были построены контрольные карты Шухарта типа X [80] для наиболее значимых показателей рН среды и УЭ. Для этой цели использованы по 50 результатов контроля качества серий ВО и ВИ, полученные в период 2004-2008 гг. (рис. 8)
Анализ контрольных карт Шухарта свидетельствует об устойчивости ТП производства ВО и ВИ, так как колебания показателей УЭ и рН среды находятся в пределах статистических границ и укладываются в рамки ±36, причем не приближаются к контрольным границам и центральной линии. Отдельные выбросы контролируемых показателей можно объяснить случайным характером воздействий, ответственных за разброс, что свидетельствует о стабильности ТП для получения стандартных по качеству серий ВО и ВИ. Следует также отметить, что отдельные выбросы показателей отражают выход за пределы статистических показателей нормы, но не за границы, допустимые регламентом производства.
Сравнительная оценка результатов контроля качества ВО и ВИ свидетельствует о стабильности ТП производства целевого продукта и показывает, что дополнительная очистка пермеата на установке Super-Q и УВОИ 4040 была эффективной, но не приводила к достоверному изменению рН среды, однако показатель УЭ «воды для инъекций» снижался до уровня 0,35±0,01 мкСм/см и не превышал 1,1 мкСм/см. Необходимо также отметить, что показатели качества ВИ были более стандартными.
Каждая 10 производственная серия ВО была проконтролирована дополнительно на наличие бактериального эндотоксина (БЭ) по ОФС 42-0002-00 и содержание механических включений (MB) по РД 42-501-98. Основной причиной пирогенности ВО являются эндотоксины (липополисахариды), синтезируемые грамотрицательными бактериями-контаминантами воды и исходных компонентов ПС. Пирогены вызывают повышение температуры тела и ингибируют синтез специфических антител [278, 346], что неблагоприятно влияет на эффективность производства и активность лечебных СК животных.
В последние годы для оценки пирогенности лекарственных средств, воды и антигенов широко используют аналитический метод контроля-Лал-тест [344], в основе которого лежит способность лизата амебоцитов специфически реагировать с БЭ и вызывать помутнение реакционной смеси с образованием плотного геля, что указывает на наличие в исследуемой пробе пирогенов.
На Армавирской биофабрике пирогенность ВО оценивают на кроликах в сравнении с Лал-тестом (тромб-гель тестом) в соответствии с требованиями ОФС 42-0002-00 (качественный анализ). Оценка методов контроля пирогенности промышленных серий ВО и бульона Хоттингера (БХ) на кроликах и Лал-тесте свидетельствует об их равноценной чувствительности и пригодности для практического применения. При этом совпадение результатов контроля пирогенности исследуемых серий препаратов составило 99-100%. Содержание БЭ в 420 сериях воды было предельно допустимым и не превышало 5,0 ЕЭ/мл. Брак по пирогенности был установлен в 22 сериях ВО. Уменьшение брака по содержанию БЭ в период 2004-2008 г.г. до 0,31% достигнуто за счет модернизации процессов получения и дополнительного пропуска ВО и ВИ через фильтр «Spiratrex», а также в результате валидации контрольно-измерительных приборов. Полученные результаты послужили основанием для широкого использования Лал-теста в качестве альтернативного, но более стандартного метода контроля ВО и БХ на пирогенность.
Источником MB являются трубопроводы, оборудование и емкости для временного хранения ВО и ВИ. Для предупреждения контаминации воды MB и микроорганизмами один раз в неделю осуществляется профилактическая обработка поверхностей оборудования, промывка трубопроводов и баков дезинфицирующими средствами «Ди-хлор» и «Неосептал П15». Для предотвращения образования устойчивых форм МК осуществляется еженедельная смена дезинфицирующих средств, а на стадии производства ПС и растворов эффективно используются фильтр-пластины МШірог, Владипор или Pall с размером пор не более 0,22 мкм.
Селекция, отбор и паспортизация штаммов эшерихий для производства поливалентного антигена
Эшерихиоз - широко распространенное инфекционное заболевание молодняка сельскохозяйственных животных, вызывающее до 60% гибели, задержку роста и снижение продуктивности переболевших животных. Возбудителями заболевания являются представители рода эшерихий, объединяющие более 170 серогрупп и 10000 серологических вариантов. Однако заболевание сельскохозяйственных животных вызывают лишь немногие серовары эшерихий, которые характеризуются общими факторами патогенности: адгезивными антигенами (К88, К99, 987Р, F41), термолабильными (ТЛ) и термостабильными (ТС) энтеротоксинами. Широкая вариабельность и изменчивость эшерихий, а главное быстрое возникновение у них устойчивости к антибиотикам и другим лекарственным средствам требует разработки эффективных средств и методов специфической профилактики и лечения заболевания [10, 44, 76, 175, 283].
Активная специфическая профилактика новорожденных животных, как правило, малоэффективна, поскольку они заболевают в основном в первые две недели жизни, а собственные специфические антитела вырабатываются у них лишь с 2-3-х недельного возраста. Поэтому защита новорожденных от эшерихиоза в первые дни после рождения создается своевременной дачей молозива от вакцинированных матерей или применением гипериммунных сывороток крови (СК) животных-продуцентов [193, 374].
Гипериммунные сыворотки являются лечебным и профилактическим средством и широко используются в ветеринарной практике, обладают многосторонними функциональными свойствами при инфекционных заболеваниях и токсикозах животных. Иммуноглобулины гипериммунных СК проникают в желудочно-кишечный тракт и обеспечивают образование локального иммунитета и устойчивость новорожденных животных к возбудителю эшерихиоза. Установлено, что гипериммунные СК формируют пассивный иммунитет продолжительностью 10-14 дней [192, 259, 375].
Известно, что состав антигенов, предназначенных для гипериммунизации животных-продуцентов (ЖП), прошел длительный путь развития от моновалентных с нетипированными возбудителями эшерихий до поливалентных антигенов, включающих в свой состав патогенные штаммы микроорганизмов с выраженными антигенными, иммуногенными и вирулентными свойствами. Показано также, что процесс гипериммунизации поливалентным липополисахаридным антигеном в сочетании с адгезивными антигенами, термостабильным и термолабильным энтеротоксинами обеспечивают получение СК с более широким лечебным и профилактическим эффектом [174]. Эти данные послужили основанием для поиска, паспортизации и применения штаммов с выраженными факторами патогенности для разработки комплексного антигена, предназначенного для гипериммунизации ЖП и производства антиадгезивной, антитоксической сыворотки против эшерихиоза сельскохозяйственных животных.
При создании лечебных и иммунобиологических препаратов необходимо использовать высоковирулентные штаммы микроорганизмов, обладающие широким спектром факторов патогенности, которые обусловливают особенности течения и разнообразие клинических форм проявления заболевания [241].
В России применяется «Поливалентная сыворотка против колибактериоза (эшерихиоза) сельскохозяйственных животных», изготавливаемая путем гипериммунизации волов-продуцентов поливалентным антигеном, включающим энтеропатогенные эшерихии следующих серогрупп и сероваров: 08:К43; О9:К30; 015:К14:Н30; 020; 026:К60; 041; 055; 078; К80:086:К61:Н32;0115; 0117; К62:Н4; 0119:К69:Н4; 0101 :К99; 0138:К81; 0139:К82; 0141:К87:К88; 0147:К89:К88; 0149:К91:К88, принятая нами за прототип. Основными недостатками сыворотки является недостаточная лечебная и профилактическая эффективность при эшерихиозе, протекающем в формах колидиареи и колиэнтеротоксемии, вследствие низкого титра антител к адгезивным антигенам К88 и К99, термолабильному (ТЛ) и термостабильному (ТС) энтеротоксинам и отсутствия антител к адгезивным антигенам 987Р и F41 и веротоксинам (VT).
В связи с этим нами из числа производственных, музейных штаммов и изолятов совместно с Пирожковым М.К. на базе ВГНКИ были отобраны и селекционированы штаммы эшерихии, обладающие высокой вирулентностью и выраженными факторами патогенносте, играющими основную роль в развитии патологического процесса у животных.
Указанные штаммы депонированы в коллекции микроорганизмов ВГНКИ под номерами: 355-37/13 (О9:К30); 305-37/11 (О78:К80); 334-37/12 (0141:К87:К88); 453-37/17 (0115:К88); 454-37/17 (0141 :К99); 397-37/14 (О9:К103:987); 398-37/14 (O101:F41); 904 (0157:Н7).
Отобранные штаммы, предназначенные для производства комплексного эшерихиозного антигена, были изучены по биологическим и антигенным свойствам и паспортизированы в соответствии с общепринятыми требованиями. По своим тинкториальным, морфологическим, культуральным, ферментативным, антигенным свойствам исследуемые штаммы были отнесены к возбудителям эшерихиоза сельскохозяйственных животных (табл. 29). В процессе изучения биологических свойств штаммов эшерихии были получены следующие результаты (таб. 30, 31).
Штамм Е. coli №453-37/17- продуцент адгезивного антигена К88 имеет антигенную формулу 0115:К88, агглютинируется О-коли сыворотками: 0115 до титра 1:6400, 018-1:800, 015-1:400, 0117-1:400, 0117-1:100, эшерихиозной анти-К88 сывороткой до титра 1:3200. Клетки штамма содержат 3 плазмиды с молекулярными массами 2,3 и 30 мДа. LD5o для белых мышей - 3,93x10 микробных клеток. Штамм не продуцирует гемолизины, образует термолабильный и термостабильный энтеротоксины (титр в РДП 1:8-1:16). Титр антигена К88 в РДП с МкАт или моноспецифической анти- К88 сыворотками составляет 1:16-1:32.
Штамм E.coli № 454-37/17- продуцент адгезивного антигена К99 имеет антигенную формулу 0141:К99, агглютинируется О-коли сывороткой до титра 1:6400, сывороткой против фактора адгезии К99 до титра 1:1600. Клетки штамма содержат две плазмиды с молекулярными массами 20 и 70 мДа. Штамм устойчив к налидиксовой кислоте в концентрации 100 мкг/мл, тетрациклину - 100 мкг/мл и рифампицину - 200 мкг/мл, что отнесено нами к его генетическим маркерам. LD5o для белых мышей - 2,65x108 микробных клеток. Штамм не продуцирует гемолизины и колицины, образует термолабильный и термостабильный энтеротоксины (титр в РДП 1:4-1:8). Титр адгезивного антигена К99 в РДП с МкАт или моноспецифической анти- К99 сыворотками составляет 1:8-1:16.
Штамм E.coli № 397-37/14 - продуцент адгезивного антигена 987Р с антигенной формулой О9:К103:987Р агглютинируется гомологичными О и ОК сыворотками до титра 1:12800, сывороткой 0137-1:200, эшерихиозной анти-987Р сывороткой до титра 1:1600. Синтез клетками штамма антигена 987Р кодируется детерминантами, имеющими хромосомную локализацию. LD5o для белых мышей - 2,9x10 микробных клеток. Штамм не продуцирует гемолизины, образует термолабильный и термостабильный энтеротоксины (титр в РДП 1:8-1:16). Титр адгезивного антигена 987Р в РДП с МкАт или моноспецифической анти- 987Р сывороткой составляет 1:8-1:16.
Штамм E.coli № 398-37/14 - продуцент адгезивного антигена F41 с антигенной формулой 0101: F41 агглютинируется гомологичной О-коли сывороткой до титра 1:3200 и гетерологичными сыворотками 02, 018-1:100, 09, 015, 0138-1:200, 04-1:400, 0117, 0142-1:50, эшерихиозной анти- F41 сывороткой до титра 1:3200. Синтез клетками штамма антигена F41 кодируется детерминантами, имеющими хромосомную локализацию. LD50 для белых мышей - 2,65x108 микробных клеток. Штамм не продуцирует гемолизины, образует термолабильный и термостабильный энтеротоксины (титр в РДП 1:4). Титр адгезивного антигена F41 в РДП с МкАт или моноспецифической анти- F41 сывороткой составляет 1:16-1:32.
Штамм E.coli 904 является активным продуцентом веротоксина. VT токсин представляет собой белок, состоящий из двух субъединиц А и В с молекулярными массами соответственно 33 кДа и 7,5 кДа. Титр YT токсина в РДП с моноспецифической антисывороткой (титр 1:16) составляет 1:4-1:8. Штамм Е, coli 904 с антигенной формулой 0157: Н7 агглютинируется гомологичной сывороткой 0157 до титра 1:6400; вирулентен для белых мышей - LD5o составляет 2,4x10 микробных клеток.
Совершенствование технологии производства и обеспечение качества поливалентных сывороток крови животных в соответствии с требованиями GMP
Современные условия экономического развития и вступление России в ВТО требуют от производителя иммунобиологических (ИБП) и сывороточных препаратов постоянного совершенствования технологии производства, повышения качества и безопасности, снижения себестоимости и повышения конкурентоспособности препаратов в соответствии с требованиями отечественных и международных стандартов серии ISO 9000 и системы ХАССП, которые определяют общие требования и принципы организации, и управление качеством и рисками при производстве лечебных СК животных [234]. Отмечено, что в указанных стандартах методы и параметры функционирования СМК не регламентируются, поэтому производители биопрепаратов сами определяют механизмы, показатели повышения качества и анализа рисков при изготовлении препаратов. Для решения этих задач на Армавирской биофабрике в 1999 г разработана и реализуется новая политика руководства, которая базируется на повышении эффективности системы управления качеством и контроля ТП в соответствии с «Правилами надлежащей производственной практики» GMP и международными стандартами ИСО [2, 5, 81, 82, 158,167, 235, 306, 331, 336, 353].
Для анализа рисков была избрана система ХАССП, которая позволяет выявить не только риски, но и разработать меры по их коррекции. К наиболее значимым причинам риска производства лечебных препаратов относят биологические (контаминанты), химические (вещества) и физические факторы [331,336,344,352].
В системе ХАССП также предусмотрено 8 основных принципов: выявление критических факторов и системы предупреждающих действий; определение критических контрольных точек (ККТ); определение пределов допуска критических показателей; разработка системы коррегирующих действий; создание системы валидации и верификации ТП; разработка системы мониторинга показателей; создание системы подготовки персонала.
Производство моно- и поливалентной СК животных представляет собой многостадийный технологический процесс. Это обстоятельство определяет многообразие подготовленных операций, методов изготовления и контроля исходных материалов, специфику необходимого оборудования и производственных помещений различного класса чистоты, а также обеспечение условий экологической безопасности и оценки рисков для сотрудников предприятия, животных-доноров (ЖД), а также выпуска препаратов отвечающих требованиям потребителя [2, 5, 82, 86, 156, 167, 180, 234, 247, 310].
В соответствии с требованиями ФЗ № 184 «О техническом регулировании» на предприятии проводится модернизация производственных помещений и технологического оборудования, оптимизируются технологические процессы (ТП), повышаются требования к методам контроля исходных материалов и готового продукта, используются статистические методы контроля качества, анализ и предупреждение рисков, влияющих на качество, стандартность, безопасность и конкурентоспособность готового продукта. Для обеспечения качества используются «Принципы надлежащей лабораторной практики» (GLP), «Правила надлежащей клинической практики (GCP) и «Правила надлежащей производственной практики» (GMP).
Результаты экспериментальных и производственных исследований позволили модернизировать и внедрить в практику технологическую схему производства и систему контроля качества исходных материалов, промежуточных и готового продуктов на всех этапах технологического цикла изготовления гипериммунных СК животных (рис. 27, 28).
Многолетний анализ результатов серийного производства гипериммунных СК животных позволил нам на всех этапах технологического цикла выявить факторы и критические контрольные точки (ККТ) риска, определяющие активность и безопасность конечного продукта. Учитывались также данные о качестве и условия хранения исходных материалов, требования к оборудованию, помещениям и обслуживающему персоналу, а также разрабатывались предупреждающие действия, обеспечивающие безопасность и высокое качество лечебных препаратов. Для решения этих задач аккредитованы контрольно-аналитическая и микробиологическая лаборатории отдела обеспечения качества (табл. 60).
Особую значимость при анализе рисков придается мониторингу и мерам борьбы с контаминацией воздуха, помещений, оборудования, инструментов, ПС, антигенов и рук обслуживающего персонала бактериями и вирусами. С профилактической целью на предприятии проводится постоянный мониторинг и обработка инфицированных объектов эффективными дезосредствами. Для предотвращения образования устойчивых форм микроорганизмов осуществляется еженедельная смена дезинфицирующих средств.
Инженерное обеспечение ТП производства гипериммунных СК представляет собой сложную многофакторную задачу, решение которой было реализовано за счет применения современного оборудования (биореакторов, фильтров, аналитических приборов и других средств) и технологических линий, оснащенных микропроцессорами с автоматическим регулированием и контролем процессов производства ВО и ВИ, гидролизатных ПС, культивирования микроорганизмов, изготовления посевных материалов (ПМ) живых и инактивированных антигенов, получения крови, плазмы, сыворотки и последующих операций по подготовке и стерилизации флаконов, фасовке, укупорке, этикетировке и хранению конечного продукта (рис. 29, 30).
Реализация указанных мероприятий позволила выявить критические точки риска, апробировать методы контроля и предложить меры по их коррекции, а также повысить результативность и конкурентоспособность производства и снизить себестоимость СК животных. Это подтверждается востребованностью лечебных сывороток практикой, что обусловлено высокой активностью, лечебной и профилактической эффективностью. Полученные результаты были достигнуты также за счет оптимизации процессов управления, повышения эффективности производства и контроля качества продукта на всех этапах технологического цикла, а также своевременного выявления и коррекции нерегламентированных показателей в реальном времени. Кроме того предусматривались и реализовывались на практике процессный и системный подходы к управлению производством, лидерство руководителя, ориентация на потребителя, вовлечение сотрудников в технологический процесс производства, постоянное улучшение и оперативный контроль качества конечного продукта, принятие экстренных решений, основанных на реальных фактах, а также взаимовыгодные отношения с поставщиками исходных материалов.
В настоящий период общепризнано, что ни один из ТП производства не может обеспечить на выходе абсолютно одинаковых тестируемых показателей. Поэтому для коррекции показателей качества и стабильности ТП производства рекомендуются методы математической статистики, в том числе гистограммы и контрольные карты Шухарта. Это связано с тем, что без применения статистических методов контроля и коррекции показателей невозможно результативное функционирование производства, гарантирующее получение качественного и конкурентоспособного продукта. Считается, что ТП стабилен, если «среднее квадратичное отклонение» (б) не превышает ±36, а центр настройки ТП находится в центре допуска. Такой процесс обеспечивает стабильное поддержание технологических показателей производства и выход 99,73% качественной продукции.
В процессе совершенствования и стандартизации производства гипериммунных СК животных был организован постоянный мониторинг качества исходных материалов и ТП и разработана система предупреждающих действий в ККТ на каждом этапе изготовления лечебных препаратов.
Значительное влияние на ростовой потенциал ПС и результативность культивирования микроорганизмов оказывает качество воды. Для производства гидролизатных ПС и растворов использовали воду очищенную (ВО) и воду для инъекций (ВИ) с удельной электропроводностью (УЭ) равной соответственно менее 4,3 и 1,1 мкСм/см, уровень контаминации - менее 100 и 0,1 КОЕ/мл и рН среды в пределах 5,0-7,0.
Бактерии пастерелл, сальмонелл и эшерихий являются сапрофитами, существенно различаются по метаболизму и для своего размножения требуют индивидуального подхода при выборе гидролизатных ПС строго определенного состава. При этом главная цель - обеспечить максимальное накопление с сохранением жизнеспособности (95-98%), антигенных и вирулентных свойств штаммов микроорганизмов. Определяющими показателями качества БХ были выбраны содержание аминного азота (АА) и полипептидной фракции с ММ более 700 и 1000D. Для максимального накопления пастерелл, сальмонелл и эшерихий необходимы ПС с содержанием аминного азота соответственно на уровне 185-200, 230-250 и 200-230 мг%) и полипептидная фракция в пределах 55-67% для размножения пастерелл.
Похожие диссертации на Совершенствование технологии промышленного производства и обеспечение качества поливалентных сывороток крови животных
