Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Структура и свойства ангиогенина из коровьего молока
1.1.1. Структура и физико-химические свойства 7
1.1.2. Ферментативная активность 10
1.1.3. Известные физиологические свойства . .12
1.1.3.1. Ангиогенная активность 13
1.1.3.2. Ангиогенин - как иммуномодулятор 18
1.1.3.3. Цитотоксичность 21
1.1.3.4. Антивирусное действие 23
1.1.4. Биохимические механизмы биологического действия ангиогенина..24
1.2. Идентификация ангиогенина 29
1.3. Очистка ангиогенина из биологических жидкостей 33
1.4. Практическое использование ангиогенина 35
1.5. Заключение к литературному обзору 41
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1. Исходные вещества .. 43
2.2. Биологические объекты 44
2.3. Препаративные методы
2.3.1. Очистка ангиогенина из коровьего молока 45
2.3.2. Выделение pPI IK из печени крыс 47
2.4. Аналитические методы
2.4.1. Определение РНКазной активности пРНКазы А и ангиогенина... 47
2.4.2. Реакция конкурентного взаимодействия ангиогенина и пРНКазы с плацентарным ингибитором РИКазы 50
2.4.3. Белковый SDS-электрофорез в ПААГ 52
2.4.4. Иммуноферментный анализ 53
2.4.5. Определение биологически активных белков молока 56
2.4.6. Исследование кристаллической структуры белков крови 56
2.5. Определение ангиогенной активности ангиогенина
2.5.1. Кожная реакция 57
2.5.2. Метод микрокармана в роговице глаза крысы 57
2.6. Исследование фармакокинетики ангиогенина 58
2.7. Определение продукции лейкоцитами человека интерлейкинов 59
2.8. Микробиологические методы 60
2.9. Статистическая обработка полученных данных 60
Глава 3. Очистка ангиогенина из коровьего молока и его идентификация 61
Глава 4. Иммуноферментный анализ ангиогенина 70
Глава 5. Проникновение ангиогенина в кровь животных через ЖКТ при пероральном введении 81
Глава 6. Антимикробное действие АНГ молока 86
Глава 7. Влияние АНГ на репродукцию лейкоцитами крови иммунных цитокинов 92
Глава 8. Характеристика распределения и элиминации ангиогенина молока в головном мозге и иммунокомпетентных органах животных 98
Выводы 109
Список литературы 111
Приложение 1 127
- Структура и физико-химические свойства
- Практическое использование ангиогенина
- Иммуноферментный анализ ангиогенина
- Характеристика распределения и элиминации ангиогенина молока в головном мозге и иммунокомпетентных органах животных
Введение к работе
Известно, что цельное молоко - богатый природный источник биологически активных белков, обладающих антибактериальными, антиоксидантними, иммуномодуляторными и регенерирующими свойствами. Однако биологически активные компоненты молока изучены еще недостаточно. Особый интерес представляет функциональная рибонуклеаза -ангиогенин (от греч. angion - сосуд). Впервые он был выделен в 1985 году из культуральной жидкости клеток человека, позже найден в сыворотке крови, а в 1988 году - в коровьем молоке. За прошедшие годы новый белок активно изучался: определена его структура, исследованы физико-химические свойства, ферментативная активность. Выявлены некоторые свойства, направленные на поддержание гомеостаза различных систем животного организма. В свете результатов недавних исследований есть основание рассматривать ангиогенин в качестве одного из значимых факторов пассивного иммунитета, передаваемого с молоком от матери к потомству. Биологические свойства ангиогенина мало изучены. Хотя несомненно, что это полифункциональный белок. Предстоит еще немало открытий в этой области. Успехи в исследовании молочного ангиогенина, входящего в комплекс защитных белков молока, намечают перспективу создания на его основе биопрепаратов широкого спектра действия как в биотехнологии, так и в медицинской практике.
Данная работа укладывается в рамки нового направления исследований функций биологически активных белков молока и их комплексов с целью создания на их основе физиологически активных пищевых добавок, а также новых эффективных препаратов лечебного назначения.
Структура и физико-химические свойства
Структура бычьего ангиогенина, также как и ангиогенина человека, изучена достаточно полно. Новейшие представления приведены в обзорах [Fox and Riordan, 1990; Riordan and D Allessio, 1997; Strydom, 1998; Badet, 2000] и новых оригинальных работах [Maes et al., 1988; Bond and Strydom, 1989; Reisdorf et al., 1994; Acharia et al., 1994, 1995; Strydom et al., 1997; Ye et al., 1999].
Бычий ангиогенин — одноцепочечный низкомолекулярный полипептид, молекулярная масса которого может варьировать от 14 до 20 кДа, а изоэлектрическая точка более 10,5. Ангиогенин и панкреатическая РНКаза А обладают 33% гомологией по аминокислотной последовательности.
В последнее время установлено, что выделенный из коровьего молока ангиогенин может быть представлен несколькими изоформами. Существует по крайней мере три молекулярные формы белка. Наиболее представительным является полипептид из 125 аминокислотных остатков с молекулярной массой 14595 Да [Maes et al., 1988]. По структурно-функциональной организации он оказался идентичным ангиогенину, выделенному ранее из крови быка [Bond and Strydom, 1989]. В связи с этим независимо от того, из крови или молока выделена данная изоформа белка, его обозначают одинаково - бычий ангиогенин-1. Идентичность его с ангиогенином человека 71 %. Шесть полуцистановых остатков (27-82, 40-93, 58-108) связаны в три дисульфидных мостика. Для сравнения соответствующими остатками в молекуле ангиогенина человека являются 26-81, 39-92 и 57-107. Главный остов молекулы ангиогенина быка (Рис.1) состоит из Р-структуры с парой антипараллельных лент ВЗ-В4 (аминокислотные остатки 70-74 и 77-85) и В5-В6 (остатки 94-102 и 104-109). Две дополнительные ленты В1 (остатки 42-48) и В7 (остатки 112-117) сбоку от этих центральных лент дополняют основную складчатую структуру. В основании молекулы находится короткая добавочная лента В2 (остатки 63-66). Спираль HI (остатки 4-15) расположена на N-конце. Спирали Н2 (остатки 23-34) и НЗ (остатки 50-59) ориентированы по отношению к р-складкам под углом -70. Эти спирали связаны между собой Р-лентой В1. Остальные остатки образуют петлевые структуры. Все вставки, делеции и фактически все неконсервативные замещения находятся в петлевых структурах и на N- и С-концах.
Наиболее консервативны участки, ответственные за функциональную активность ангиогенина. Рентгено-структурный анализ и ядерно-магнитный резонанс кристаллического ангиогенина быка и человека позволили установить сходства и различия в пространственном расположении таких участков [Reisdorf et al., 1994; Acharia et al., 1994, 1995]. В-частности, исследование кристаллической структуры ангиогенина быка при разрешении 1,5 А позволило установить, что как и в молекуле ангиогенина человека, сайт рибонуклеазной активности состоит из нескольких частей. Каталитический центр (Р1), на котором расщепляются фосфодиэфирные связи, включает три аминокислотных остатка Гис-14, Лиз-41 и Гис-115, положение которых совпадает с таковым соответствующих аминокислотных остатков в АНГ человека (Гис-13, Лиз-40, Гис-114). Сайт В1, связывающий пиримидин-З -нуклеозиды, содержащий остатки Глн-13, Тре-45 и Сер-119, также экранируется Глу-118 (Глу-117 соответственно для АНГ человека). Сайт В2, преимущественно связывающий пуриновое кольцо 5 - нуклеозида, представлен Глу-109 (Глу-108 для АНГ человека). Не исключено, что с этим связаны определенные функциональные особенности сравниваемых белков.
Стридом и соавт. [Strydom et аЦ 1997] обнаружили в молоке, кроме ангиогенина-1, другой ангиогенный белок, обозначенный ими как ангиогенин-2. Одноцепочечный полипептид из 123 аминокислотных остатков имеет более высокую, чем ангиогенин-1, молекулярную массу - -20 кДа. Это обусловлено его гликозилированием при Асн-33. Обработка N-гликоназой снижала молекулярную массу на 6 кДа. Показано, что амино- и карбоксил-концевые остатки представлены пироглютаминовой кислотой и пролином соответственно. Идентичность ангиогенина-2 с ангиогенином-1 составляет 57 %. У всех известных ангиогенинов имеется три дисульфидных мостика, которые определяют довольно жесткую пространственную структуру молекулы, вследствие чего она устойчива к механическим воздействиям, действию протеаз и низким значениям pIL
Китайскими исследователями в коровьем молоке найден еще один ангиогенный белок, названный ими лактогенином [Ye et al., 1999]. Его молекулярная масса 17 кДа, то есть несколько выше, чем бычьего ангиогенина-1. Однако белок не идентичен ангиогенину-2, хотя и сходен с ним в позициях 4-25 аминокислотных последовательностей. По своей первичной структуре лактогенин более гомологичен с щелочной рибонуклеазой из печени быка, чем с найденными в коровьем молоке ангиогенными белками. Наличие изоформ ангиогенина может быть связано с разными генами, поскольку в геноме быка их два, а также, возможно, с посттрансляционными химическими модификациями [Strydom, 1998].
Ангиогенины обладают рибонуклеазной активностью, отличной от действия панкреатической РНКазы А, что выражается, прежде всего, в их субстратной специфичности [Riordan and D Allessio, 1997; Strydom, 1998; Riordan and Shapiro, 2001; Jardin et al., 2001; Madhusudhan et al., 2001; Leland et al., 2002]. Ангиогенины не расщепляют субстраты, характерные для панкреатической РНКазы А, в-частности, РНК зародышей пшеницы, некоторые синтетические полинуклеотиды, а также гибриды РНК ДНК, двухцепочечные полирибонуклеотиды, 2 ,5 -связанные динуклеотиды. В то же время ангиогенины из различных источников проявляют ограниченную рибонуклеазную активность относительно 28S и 18S рибосомных РНК. При изучении влияния ангиогенина на препарат РНК из опухолевых эпителиальных клеток аденокарциномы толстой кишки человека НТ-29, состоящий, в-основном, из 28S и 18S рРНК (-5000 и -2000 нуклеотидов соответственно), с помощью электрофореза в агарозном геле обнаружено, что ангиогенин расщепляет рРНК на продукты, состоящие из 100-500 нуклеотидов, которые образуются уже через 60 минут, и более глубокий гидролиз при увеличении времени инкубации (до 4 часов) не происходит.
Практическое использование ангиогенина
Специфическим свойством ангиогенина является цитотоксичность, в основе которой, как полагают [Strydom, 1998; Badet, 1999], лежит угнетение синтеза белка из-за повреждения рибосом. Ангиогенин полностью подавляет синтез белка в системе лизата кроличьих ретикулоцитов в концентрациях, при которых РНКаза вызывает лишь частичное ингибирование [St. Clair et at., 1987, 1988]. Плацентарный ингибитор РНКазьг снимает эффект, и при повторном добавлении к лизату ретикулоцитов кролика, обработанному ангиогенином, интактных рибосом синтез белка восстанавливается. Подавление синтеза белка в присутствии А1ЇГ происходит быстро через 20 минут после его внесения в среду до конечной концентрации 40 нМ. Подобно пуромицину, АНГ является ингибитором элонгации трансляции. Торможение белкового синтеза при столь низкой концентрации ангиогенина (40 нМ) можно объяснить тем, что инактивации лишь небольшого числа рибосом достаточно для блокирования продвижения других вдоль полисомы. Следует отметить, что ангиогенин разрушает 18S и 28S рРНК, но не 5S или 5,8S рРНК [Rybak and Vallee, 1988]. Причем продолжительная инкубация рибосом с АНГ приводит к ограниченному разрезанию 18S рРНК и к интенсивной деградации 28S рРНК. Однако, по мнению авторов, именно 18S рРНК ответственна за угнетение синтеза белка. Торможение бесклеточного синтеза белка ангиогенином обусловлено специфическим расщеплением рРНК до сравнительно длинных фрагментов.
В работе [Olson et at., 1994] было показано, что исследуемый по включению 535-метионина синтез белка в присутствии ангиогенина отменялся. На электрофореграммах изолированного из рибосом белка отсутствовали радиоактивные пятна, соответствующие вновь синтезированному белку на рибосомах контрольных образцов. Если ангиогенин прединкубировали с моноклональными к нему антителами, он терял способность угнетать синтез белка в рибосомах ретикулоцитов. В работе [Saxena et а]., 1992] показано, что при внутриклеточной инъекции ангиогенина в ооциты лягушки угнетение синтеза белка так же имеет место, но авторы полагают, что связано оно с повреждением тРНК. Не исключено, что имеются альтернативные биохимические пути реализации цитотоксического эффекта, например, через повреждение рибосом в цитоплазме с одной стороны, и тРНК в ядре - с другой. Не исключено так же, что оба события для цитотоксичности необходимы. Следует, однако, отметить, что цитотоксическое действие ангиогенина установлено только в бесклеточных системах или при инъекции внутрь клетки, и пока неясно, какую роль этот процесс играет в эффектах ангиогенина на клетку с неповрежденной клеточной мембраной.
Все известные изоформы ангиогенина коровьего молока способны проявлять цитотоксичность, что установлено по их ингибирующему влиянию на синтез белка рибосомами лизатов ретикулоцитов кролика [Strydom et al., 1997; Ye et al., 1999]. Однако в активности этих ангиогенинов отмечены некоторые отличия. Так, бычий ангиогенин-2 оказался более токсичен, чем бычий ангиогенин-1. Он сравним с ангиогенином-1 человека. Полное ингибирование трансляции эти белки вызывали уже при концентрациях 30-70 нМ. Выделенный из коровьего молока лактогенин ингибировал синтез белка при концентрации ниже 100 нМ на 40% (что почти в 2 раза сильнее, чем бычий ангиогенин-1) [Ye et al., 1999]. Однако, сравнивая результаты работ [Strydom et al., 1997; Ye et al., 1999], можно заключить, что лактогенин оказался менее активным, чем бычий ангиогенин-2, который сравним по токсичности с ангиогенином человека.
Физиологическая роль цитотоксичности ангиогенина пока не ясна. Не исключено, что он участвует в трофических процессах, проявляя действие в отношении клеток с нарушением поверхностной мембраны и способствуя в итоге поддержанию тканевого гомеостаза. Пока остается недостаточно ясным вопрос о роли в цитотоксическом эффекте ангиогенина связывание его с клеточным рецептором, и последующие события - проникновение в цитоплазму и в ядро. Не решен вопрос, о роли цитотоксичности ангиогенина в механизме индукции ангиогенеза. Как объяснить, что один и тот же агент способен проявлять цитотокснчность и активировать клеточную пролиферацию? Можно только предполагать, что в основе этих процессов, которые отражают, вероятно, регулирующую функцию ангиогенина, лежат различные биохимические механизмы.
Получены данные, на основании которых просматривается перспектива создания лекарственных препаратов для лечения вируса иммунодефицита человека. Полученный из коровьего молока ангиогенин оказывал ингибирующее влияние на обратную транскриптазу вируса иммунодефицита человека тип-1 (ВИЧ-1) [Wang et al., 2000; Ng et al., 2001]. Известно, что открытый в 1970 году фермент "обратная транс криптаза" синтезирует ДНК на матрице РНК и входит в состав РНК-содержащих вирусов, в том числе, и ВИЧ-1. Оказалось, что эффект зависит от изоформы ангиогенина. Так, было показано, что лактогенин активнее, чем ангиогенин-1. При концентрации 5 мг/мл ингибирование активности обратной транскриптазы ВИЧ-1 для лактогенина составляло 61,81+2,11%, а для ангиогенина-1 - 44,02+1,73%. Концентрации 50%"го ингибирования активности обратной транскриптазы ВИЧ-1 соответствовали 290 мкМ для лактогенина и 330 мкМ для ангиогенина-1. На ингибиторную активность против обратной транскриптазы ВИЧ-1 были исследованы и другие биологически активные белки молока (лактоферрин, а-лактоальбумин, р-лактоглобулин, лактопероксидаза, казеин, гликолактин). Показано, что только а-лактоальбумин и казеин оказались не активными, а все остальные исследованные ферменты ингибировали активность обратной транскриптазы ВИЧ-1, хотя и в разной степени: бычий лактоферрин лактоферрин человека лактопероксидаза лактогенин ангиогенин-1 гликолактин Р-лактоглобулин.
Биохимический механизм действия ангиогенина на клетку-мишень запускается через связывание с рецептором поверхностной клеточной мембраны. Следующий этап включает трансдукцию ангиогенина в цитоплазму, затем в ядро и аккумуляцию в ядрышке [Strydom, 1998; Badet, 1999].
Установлено, что на поверхностной мембране эндотелиальных клеток находятся рецепторы инвазии и адгезии, с которыми связываются соответствующие им сайты в молекуле ангиогенина [Soncin, 1992; Hollahan et al., 1992]. Есть основание утверждать, что рецепторы ангиогенина включают в качестве критического компонента гликопротеиды. Так, ангиогенин узнает протеогликаны на поверхности НТ-29 клеток. Полагают, что протеогликановые рецепторы ангиогенина — основное семейство рецепторов, участвующих в адгезии [Soncin et al., 1994]. В ангиогенине человека существенными аминокислотными остатками для узнавания рецептора на поверхности клетки является Асн-61, Арг-66 и Асн-109, тогда как для бычьего ангиогенина - это Асн-62, Арг-67 и Асн-110. Связанный мембранным рецептором ангиогенин во-первых, осуществляет определенные перестройки в самой клеточной мембране, а во-вторых, индуцирует целую цепочку биохимических превращений в цитозоле.
Иммуноферментный анализ ангиогенина
В настоящее время иммуноферментный анализ (ИФА) широко используется в различных областях научной и практической деятельности (медицина, пищевая промышленность, сельское хозяйство и т.д.), поскольку данный метод отличается высокой воспроизводимостью получаемых результатов, стабильностью используемых реагентов, чувствительностью и быстротой. Высокая чувствительность ИФА достигается, как правило, за счет специфичности применяемых в нем иммунохимических реагентов, особенно коньюгатов фермента-маркера с лигандами различной природы (антигены, антитела, кофакторы и др.). В данной работе использована пероксидаза хрена, как маркерный фермент, и антитела к ангиогенину, в качестве лиганда.
Очищенный до гомогенности (по данным электрофореза в ПААГ) ангиогенин использовали для получения поликлональных кроличьих антител. Максимальный иммунный ответ при стандартной схеме иммунизации появлялся на 37-й день после первичной иммунизации и детектировался до 66 дня методом радиальной иммунодиффузии в агаровом геле (Рис. II). Титр антисыворотки, полученной в пик иммунного ответа, был равен 1:8. Аналогичные данные были получены при определении титра антисыворотки методом непрямого твердофазного иммуноанализа, титр составил 1:12800 для стандартной схемы иммунизации (Рис. 12).
Коньюгат поликлональные антитела к ангиогенину - пероксидаза хрена (АТаиг-ПХ), полученный модифицированным периодатным методом, использовали при проведении твердофазного иммуноферментного анализа. Очистку коньюгата ATa„r-nX проводили методами ионообменной хроматографии, детекцию проводили 2 способами: спектрофотометрически (при 280 нм) и иммунохимически. Как показано на рисунке 13, оптимальная концентрация коньюгата для детекции антигена составляет от 1 до 5 мкг/мл. Фоновое значение поглощения раствора субстрата в отсутствие связавшегося с твердой фазой иммуноферментного коньюгата при длине волны 405 нм составляло - 0.060 ± 0.020. Одним из наиболее чувствительных вариантов иммуноферментного анализа, позволяющим определять пикограммовые количества веществ, является конкурентный метод, в основе которого лежит конкуренция за связывание с коньюгатом АТ-ПХ между антигеном, сорбированным и вносимым в лунки планшетов в анализируемом растворе. Как следует из графика, приведенного на рисунке 14, конкурентный метод применим для количественного определения ангиогенина в чистых растворах при использовании коньюгата поликлональных антител к ангиогенину с пероксидазой. Минимальная концентрация ангиогенина, определяемая этим методом, составляет 10 нг/мл, что соответствует чувствительности ИФА при использовании меченных пероксидазой антител.
Возникает вопрос, в какой мере поликлональные антитела к ангиогенину правомерно использовать для его определения методом ИФА в такой многокомпонентной системе, как молочная сыворотка? Не могут ли при этом происходить перекрестные реакции с белками, имеющими общие с ангиогенином антигенные детерминанты? Прежде всего, это касается панкреатической рибонуклеазы, молекула которой характеризуется высокой гомологией с ангиогенином по аминокислотной последовательности [Vallee et al., 1985]. Так как панкреатическая рибонуклеаза, как и ангиогенин, является сывороточным белком и содержится в молоке в значительных количествах [Шидловская, 1985], ставилась задача выяснить ее взаимодействие с поликлональными антителами к ангиогенину. Был проведен твердофазный ИФА на основе поликлональных антител к ангиогенину растворов РНКазы с различными концентрациями. В лунках планшетов были сорбированы 2 и 10 мкг рибонуклеазы (в контрольных лунках планшета сорбировано 2 мкг стандартного образца ангиогенина). Исследования показали, что при реакции взаимодействия поликлональных антител с ангиогенином величина экстинции в лунке при 405 нм составляла 13+0.18, тогда как с рибонуклеазой всего 0.04+0.01 и 0.09±0.02, для 2 и 10 мкг соответственно. Согласно литературным данным, концентрация панкреатической рибонуклеазы в молоке коров колеблется от 12 до 32 мкг/мл [Шидловская, 1985], Полученные результаты свидетельствуют о том, что при концентрациях даже значительно больших (от 40 до 200 мкг/мл) величина экстинции существенно не повышается. Следовательно, при твердофазном ИФА перекрестная реакция AT к ангиогенину с панкреатической рибонуклеазой практически не имеет место. При исследовании перекрестных реакций в гомогенной фазе были получены аналогичные данные.
На результаты ИФА не влияют также другие белковые компоненты сыворотки молока. Молочную сыворотку с помощью аффинной хроматографии, носителем в которой являлся синтезированный коньюгат поликлональных AT с бромциан-активированной сефарозой 4В, очищали от ангиогенина. На этой сыворотке готовили растворы стандартного препарата ангиогенина с различной концентрацией. Проводили ИФА при концентрации коньюгата АТа„г-ПХ I мкг/мл, определенной ранее как оптимальная для детекции ангиогенина. Типичная калибровочная кривая для определения концентрации ангиогенина методом конкурентного ИФА представлена на рисунке 15. Калибровочная кривая, построенная при использовании в качестве фонового раствора в ИФА очищенной от ангиогенина молочной сыворотки, может быть применима для определения ангиогенина в образцах молока, состав сывороточных белков в котором может варьировать, что имеет место, например, при исследовании индивидуальных различий в содержании ангиогенина молока коров.
Полученные данные свидетельствуют о достаточно высокой специфичности поликлональных антител к ангиогенину, что дает возможность на их основе проводить количественный анализ ангиогенина в молочной сыворотке независимо от содержания в ней других сывороточных белков и, что особенно существенно, в присутствии РНКазы - белка, первичная структура которого высоко гомологична первичной структуре ангиогенина.
Характеристика распределения и элиминации ангиогенина молока в головном мозге и иммунокомпетентных органах животных
Гуморальная составляющая межклеточных взаимодействий в иммунной системе опосредуется продуктами взаимодействующих клеток - цитокинами. Это белковые или полипептидные продукты активированных клеток иммунной системы, которые являются медиаторами межклеточных коммуникаций при иммунном ответе, гемопоэзе и развитии воспаления, эффекторами некоторых реакций иммунитета и служат связующим звеном между иммунной и другими системами организма. Цитокины традиционно подразделяют на несколько групп: интерлейкины (факторы взаимодействия между лейкоцитами), интерфероны (цитокины с противовирусной активностью), факторы некроза опухолей (цитокины с цитотоксической активностью) и колониестимулирующие факторы (гемопоэтические цитокины). Учитывая высокую чувствительность цитокиновой системы к защитным белкам молока [Wong et al., 1997], в качестве теста на иммуномодулирующее влияние ангиогенина, также входящего в "защитный комплекс" молока, нами была выбрана репродукция вторичных иммунных мессенджеров клетками иммунной системы (лейкоцитами) в отсутствии и присутствии известного индуктора - фитогемагглютинина (ФГА). Изучали влияние АНГ на продукцию интерлейкина-1р (ИЛ-ір), интерлеЙкина-6 (ИЛ-6) и фактора некроза опухолей-а (ФІ Юа) - цитокинов, играющих важнейшую роль в первой линии защиты организма при иммунном ответе. ИЛ-ір является цитокином широкого спектра действия, он обуславливает пусковые реакции иммунитета, играет ключевую роль в развитии воспаления, участвует в регуляции гемопоэза и является медиатором взаимодействий между иммунной и нервной системами. Многие биологические эффекты ИЛ-ір осуществляются в кооперации с ИЛ-6 и ФПОа. Интерлейкин-6 более, чем два других флогогенных цитокина, влияет на синтез белков острой фазы гепатоцитами. Выделяясь несколько позже, чем ИЛ-1Р и ФНОа, ИЛ-6 подавляет их образование (они, наоборот, стимулируют его выработку) и поэтому относится к цитокинам, завершающим развитие воспалительной реакции. Кроме этого, ИЛ-6 участвует в регуляции кроветворения, служит ростовым фактором плазматических клеток и участвует в межсистемных взаимодействиях. ФПОа по спектру клеток-мишеней и биологических эффектов близок к ИЛ-ір и ИЛ-6. Помимо флогогенного действия и участия в регуляции иммунного ответа и гемопоэза, он обладает способностью влиять на трансформированные клетки, вызывая их гибель, и участвует в морфогенезе лимфоидных органов. Таким образом, исследуемые цитокины функционально связаны между собой и являются пусковыми в механизмах иммунного ответа, оказывая влияние на выработку других цитокинов и дальнейшее развитие иммунной реакции.
Как следует из данных, приведенных на рисунке 20, АИГ индуцировал в лейкоцитах продукцию цитокинов: ИЛ-1р, ИЛ-6 и ФНОа. Уровень продуцируемых цитокинов зависел от концентрации ангиогенина и времени, прошедшего после начала его контакта с лейкоцитами. Продукция ИЛ-6 была зарегистрирована при концентрации препарата начиная с 2 мкг/мл и ФНОа - с 10 мкг/мл; при концентрации АНГ 50 мкг/мл наблюдалась максимальная продукция всех цитокинов: для ФНОа - к 6 часам после начала индукции, а для ИЛ-IJJ и ИЛ-6 - к 24 часам после начала индукции. Следовательно, сам ангиогенин обладает способностью индуцировать в неактивированных лейкоцитах человека продукцию цитокинов.
С целью изучения влияния ангиогенина на способность лейкоцитов продуцировать цитокины при одновременном действии с известным иммуномодулятором - фитогемагтлютинином, в культуральную среду лейкоцитов вводили препараты в концентрациях - ФГА (15 мкг/мл), АНГ (50 и 200 мкг/мл). Как следует из данных, представленных на рисунке 21, через 6 часов после контакта с ангиогенином (независимо от дозы) активация продукции ИЛ-ір в равной мере проявлялась как для активированных, так и неактивированных ФГА лейкоцитов. Однако через 24 часа проявлялся синергический эффект при двойной индукции (ФГА+АНГ). Через 48 часов влияние контакта с индукторами проявлялось незначительно как при раздельном, так и совместном действии.
Как следует из данных, представленных на рисунке 22, при использованных дозах ангиогенин являлся более сильным индуктором в отношении продукции ИЛ-6, чем ИЛ-1 р. Как через 6 часов, так и через 24 часа после контакта с лейкоцитами, АНГ (в дозах 50 мкг/мл и 200 мкг/мл) являлся также более активным индуктором, чем ФГА. При их совместном действии не происходило по сравнению с действием одного АНГ статистически достоверного изменения уровня продуцируемого ИЛ-6. Через 48 часов еще сохранялся эффект АНГ (при дозе 200 мкг/мл). При двойной индукции эффект усиливался.
Установленный факт способности ангиогенина индуцировать в лейкоцитах крови человека продукцию цитокинов (ИЛ-ір, ИЛ-6, ФНОа) позволяет предположить участие ангиогенина в механизмах функционирования иммунной системы на уровне цитокинового звена. Так как продуцентами перечисленных цитокинов являются клетки крови: моноциты/макрофаги, ТЫ, ТЪ2, можно заключить, что именно эти клеточные популяции активируются ангиогенином.
Иммуномодулирующие свойства ангиогенина [Елисеева и Мертвецов, 1993, 1997] могут реализоваться, очевидно, не только непосредственно через иммунокомпетентные клетки крови [Matousek et al., 1995], но и их предшественников в лимфоидных органах. Другая важная для этих процессов мишень — головной мозг, так как иммунитет находится под контролем центральной нервной системы [Корнева, 1993]. В связи с этим нами исследовалась фармакокинетика вводимого животным ангиогенина с учетом распределения в головном мозгу, тимусе и костном мозге.
Основная цель фармакокинетических исследований — количественный анализ и описание процессов поглащения, распределения, метаболизма и выведения препарата из организма. Для того чтобы количественно описать характер этих процессов создаются специальные кинетические модели. Самой простой из них является однокамерная модель, в которой весь организм представлен единственной камерой. Камера фармако кинетической модели представляет собой характеристику некоего "усредненного" состояния процессов, воздействующих на введенный в организм препарат; в некоторый воображаемый объем, вмещающий в себя все количество препарата, которое находится в организме в средней концентрации, равной его концентрации в плазме крови. Использование однокамерной модели позволяет провести первоначальную оценку основных фармакокинетических параметров со своеобразным усреднением и оценить общую картину проникновения препарата в организм.
