Содержание к диссертации
Введение
Глава 1.Обзор литературы 15
1.1. Хитозан в качестве средства доставки генов 15
1.1.1. Носители на основе хитозана в генной терапии 19
1.1.1.1. Комплексы хитозан-ДНК 20
1.1.1.2. Наночастицы хитозана 21
1.1.1.3 Наночастицы на основе хитозана/альгината 23
1.1.2. Свойства хитозана в качестве носителя для доставки генов 23
1.1.2.1. Основные свойства хитозана 23
1.1.2.2. Образование наночастиц с ДНК/миРНК 25
1.1.3. Факторы, связанные с подготовкой хитозана, влияющие на доставку ДНК 26
1.1.3.1. Молекулярная масса хитозана 27
1.1.3.2. Степень дезацетилирования хитозана 29
1.1.3.3. Отношение азота к фосфору N/P 30
1.1.3.4. Солевые формы хитозана 32
1.1.3.5. Концентрация плазмиды 32
1.1.3.6. pH культуральной среды 33
1.1.3.7. Наличие сыворотки 45
1.1.3.8. Влияние добавок 36
1.1.3.9. Стабильность к полианионам 37
1.1.3.10. Хитозан в качестве добавки 37
1.1.3.11. Методы приготовления хитозановых наночастиц 39
1.1.3.12. Влияние пути применения 39
1.2. Система доставки белков на основе хитозана 41
1.2.1. Хитозан (производные) 41
1.2.2. Методы подготовки хитозан-содержащих частиц с белками 44
1.2.2.1. Химические методы сшивки 45
1.2.2.2. Методы ионного сшивания 46
1.2.2.3. Методы с использованием сушки 50
1.3. Хитозан и его дериваты в орган-специфичной доставке лекарств 50
1.3.1. Адресная доставка лекарств в толстый кишечник 50
1.3.2. Адресная доставка в печень 53
1.3.3. Адресная доставка в почки и легкие 55
1.4. Хитозан и его производные в адресной доставке противоопухолевых лекарств 56
1.4.1. Пассивный таргетинг – эффект повышенной проницаемости и удерживания 57
1.4.1.1. Конъюгаты хитозан-лекарство 58
1.4.1.2. Поперечно-сшитые наночастицы хитозана 59
1.4.1.3. Наночастицы на основе комплекса хитозан – полиэлектролиты 60
1.4.1.4. Наночастицы ПЭГ-хитозан 62
1.4.2. Активное нацелевание — рецептор-опосредованный эндоцитоз 62
1.4.3. Физическое нацеливание 65
1.4.3.1. Соединения на основе хитозана чувствительные к стимулам среды 65
1.4.3.2. Магнитные наночастицы на основе хитозана 67
Экспериментальная часть 68
Глава 2. Материалы и методы исследований 68
2.1. Реактивы и оборудование 68
2.2. Выделение плазмид 73
2.3. Приготовление альгинатных комплексов с инкапсулированным пропранолом 74
2.4. Подготовка наночастиц хитозан, хитозан / альгината и хитозана / альгината-декстран сульфата загруженной пДНК. 76
2.5. Приготовление хитозан/декстран сульфат-пДНК композитных наночастиц. 78
2.6. Клеточные линии 80
2.7. Оценка цитотоксичност наночастиц 80
2.8. Трансфекция In-vitro 82
2.9. Определение эффективности трансфекции 83
2.10. Характеристика хитозан/декстран композитных наночастиц с инкапсулированной ДНК 84
2.10.1. Размер частиц, ИП, зета-потенциал 84
2.10.1.1. Анализ альгинатных частиц, содержащих пропранол 84
2.10.2. Морфология 84
2.10.2.1. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) альгинатных частиц с пропранолом 85
2.10.3. Электрофорез в агарозном геле 86
2.11. Набухание альгинатных частиц с пропранолом 86
2.12. Определение инкапсулирующей активности 86
2.12.1. Эффективность инкапсуляции Пропранол-HCl 87
2.13. Высвобождение пропранола из альгинатных комплексов in vitro 87
Глава 3. Результаты исследований 88
3.1. рН чувствительная система доставки лекарственных средств, инкапсулированная пропранол гидрохлоридом. 89
3.1.1. Характеристика частиц с инкапсулированным пропранол гидрохлоридом. 90
3.1.1.1. Влияние напряжения, диаметра сопла, концентрации 90 раствора и скорости потока на размер получаемых частиц.
3.1.1.2. Влияние напряжения, диаметра сопла, концентрации раствора и скорости потока на ЭИЛ. 93
3.1.1.3. Влияние усиления матрицы на размер частиц и ЭИЛ 95
3.1.2. Изучение частиц с помощью сканирующей электронной микроскопии(СЭМ) 97
3.1.3. Набухание частиц в СЖР и СКР 98
3.1.4. Высвобождение пропранол гидрохлорида 100
3.2. Биополимерные наночастицы с инкапсулированной плазмидной ДНК 101
3.2.1. Характеризация альгинатных наночастиц, инкапсулированных плазмидной ДНК Characterization of pDNA-loaded nanoparticles based on alginate 103
3.2.1.1.Размер частиц, индекс полидисперсности, зета-потенциал. 103
3.2.1.2. Изучение эффективности инкапсуляции 106
3.2.1.3.Связывание ДНК в наночастицах 106
3.2.2. Изучение наночастиц на основе хитозана с инкапсулированной ДНК. 107
3.2.2.1. Размер частиц, индекс полидисперсности, зета-потенциал наночастиц на основе хитозана 108
3.2.2.1.1. Влияние параметров на размер частиц 108
3.2.2.1.2. Влияние концентраций биополимеров на Индекс Полидисперсности (ИП) 109
3.2.2.1.3. Влияние концентраций биополимеров на зета-потенциал 111
3.2.2.2. Эффективность инкапсуляции 112
3.2.2.3. Изучение морфологии наночастиц 114
3.2.2.4. Связывание ДНК 114
3.2.3. Тестирование цитотоксичности наночастиц 118
3.2.4. Исследование трансфекции in-vitro 120
Глава 4. Выводы
Список литературы
- Комплексы хитозан-ДНК
- Методы ионного сшивания
- Приготовление альгинатных комплексов с инкапсулированным пропранолом
- Изучение эффективности инкапсуляции
Комплексы хитозан-ДНК
В последние несколько лет исследователи обнаружили возможность терапии на основе нуклеиновых кислот в лечении различных заболеваний глаз, демонстрируя увеличение важного сегмента в терапевтическом арсенале в офтальмологии (Borras T., 2003; Fattal E. et al., 2006; Hauswirth W.W. et al., 2000; Pleyer U. et al., 2003; Reich S.J. et al., 2003). Данная терапия предлагает важные преимущества по сравнению с традиционным лечением, особенно, что касается селективности. Представляет интерес трансфекция слизистой оболочки глаза не только для местного лечения роговицы и/или эпителия конъюнктивы, но также и для лечения патологий внутреннего глаза (Toropainen E. et al., 2007). Множество синтетических носителей было предложено для достижения данной цели в последние несколько лет (Gaudana R. et al., 2009).
В целом, можно рассмотреть несколько критических шагов для создания оптимальных синтетических векторов, необходимых для доставки генов в область глаза. Во-первых, наночастицы, несущие гены должны обладать способностью связывать нуклеиновые кислоты и эффективно доставлять в клетки глаза. Во-вторых, они должны взаимодействовать с клетками слизистой оболочки и трансфецировать при физиологических условиях с целью достижения желаемого терапевтического эффекта.
Чаще всего, работа невирусных наноносителей основана на создании электростатического взаимодействия отрицательно заряженных нуклеиновых кислот с положительно заряженными полимерами (полиплексы), липидами (липоплексы) и дендримерами (дендриплексы). Малоизвестные катионные полимеры, такие как полиэтиленимин, а также катионные липиды и дендримеры продемонстрировали многообещающие результаты как in vivo, так и in vitro в генной терапии глаза (Hornof M. et al., 2008; Hudde T. et al., 1999; Pleyer U. et al., 2001).
Хитозан широко исследовался в связи с его способностью формировать комплексы с нуклеиновыми кислотами и выступать в роли эффективного переносчика генов (Borchard G., 2001; Chen H.H. et al., 2008; MacLaughlin F.C. et al., 1998; Mao H.Q. et al., 2001). Некоторые ключевые свойства полисахаридов, такие как их молекулярная масса, степень дезацетилирования и стехиометрия комплексов изучались систематически, так как данные параметры влияют на эффективность трансфекции хитозановыми нанокомплексами.
Наибольшее влияние на трансфекцию клеток млекопитающих оказывает молекулярная масса хитозана. Как обсуждалось в некоторых работах, низкая молекулярная масса способствует процессу трансфекции генов (MacLaughlin F.C. et al., 1998; Sato T. et al., 2001; Ishii T. et al., 2001; Erbacher P. et al., 1998; Turan K. et al., 2006; Liu X. et al., 2007; Richardson S.C. et al., 1999; Koping-Hoggard M. et al., 2004). Успех нанокомплексов на основе хитозана в доставке нуклеиновых кислот к поверхности слизистой оболочки был показан in vivo после применения легочным путем (Regnstrom K. et al., 2006; Koping-Hoggard M. et al., 2001). Что касается их применения для доставки интерферентов, нанокомплексы хитозана, загруженные малой интерферирующей РНК были способны эффективно тушить экспрессию модельного белка-мишени EGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок), после интраназального применения на трансгенных мышах (Howard K.A. et al., 2006).
Кроме данных многообещающих результатов, одним из главных недостатков нанокомплексов хитозана и полиплексов в целом является простота их структуры. Так как плазмиды и полимеры удерживаются вместе благодаря простому электростатическому взаимодействию, наличие полианионов, обычно присутствующих в теле, такие как гепарин и глюкозаминогликаны, могут привести к распаковке и высвобождению плазмидной ДНК до того, как они достигнут мишени (Ruponen M. et al., 2003; Ruponen M. et al., 2004; Danielsen S. et al., 2005; Csaba N. et al., 2009). Данное ограничение вероятно может объяснить отсутствие информации, касающейся использования комплексов хитозана для доставки генов в клетки глаза. В связи с этим, разработка более стабильной системы доставки в форме наночастиц может пониматься в качестве пути усиления потенциала хитозана в генной терапии глаза.
1.1.1.2. Наночастицы хитозана
Наночастицы хитозана, получаемые путем ионотропного застывания считаются удобными нано-носителями для инкапсулирования лабильных нуклеиновых кислот. Механизм, который регулирует образование наночастиц, контролируется гелеобразованием хитозана благодаря его взаимодействию с фосфатными группами кросслинкерного агента трифосфата натрия (Calvo P. et al., 1997). Данное контролируемое гелеобразование позволяет формировать сферические и гомогенные наночастицы, вне зависимости от молекулярной массы полисахарида (Janes K.A. et al., 2001; Gan Q. et al., 2005), что рассматривается в качестве важного параметра в применении доставки генов. Некоторые исследователи опубликовали работы, в которых описывают использование наночастиц хитозана в качестве системы доставки ДНК (Csaba N. et al., 2009; Csaba N. et al., 2009), олигонуклеотидов (Dung T.H. et al., 2007), и РНК для интерференции (малую интерферирующую РНК) (Katas H. et al., 2006; Wang S.L. et al., 2009). Данные нано-носители имеют специфические преимущества, по сравнению с простыми хитозановыми нанокомплексами, такие как сферическая и гомогенная форма, улучшенная стабильность (молекулы ДНК не замещаются другими анионами) и контролируемое высвобождение связанной ДНК (Csaba N. et al., 2009).
Данные преимущества также были показаны и для молекул малых интерферирующих РНК (Katas H. et al., 2006). В конечном счете, дополнительным преимуществом хитозановых наночастиц являются их физико-химические свойства, такие как размер и зета-потенциал, которые важны и определяют эффективность трансфекции генов, и которые могут контролироваться соответствующим подбором параметров процедуры, таких как соотношение хитозана к тетрациклиновому полипреноиду (Gan Q. et al., 2005). Также была показана успешность применения хитозановых наночастиц для доставки плазмидной ДНК на поверхность слизистых оболочек рта и носа (Chen J. et al., 2004; Khatri K. et al., 2008; Bivas-Benita M. et al., 2003). Что касается их конкретного применения в качестве доставки генов в клетки глаза, доказана их способность трансфецировать клетки глаза in vitro, в особенности клеточные линии, полученные из человеческой роговицы и конъюнктивы, соответственно клетки линий HCE и NHC-IOBA. Данная способность наночастиц хитозана трансфецировать клетки сильно зависит от молекулярной массы хитозана. Действительно, только хитозан с низкой молекулярной массой, т.е. 10-12 кДа, был способен индуцировать экспрессию репортерного белка EGFP в обеих клеточных линиях (Fuente M. et al., 2008). Недавно были разработаны катионные полимерные наночастицы на основе хитозана путем простого комплексообразования или ионного гелеобразования, которые были способны связывать и транспортировать нуклеиновые кислоты (Juntapram K. et al., 2012).
Альгинат является еще одним интересным полисахаридом, который ранее использовался для приготовления системы доставки генов в клетки глаза в комбинации с другими материалами, такими как альгинат/гидроксипропил метилцеллюлозовые гидрогели (Liu Z. et al., 2006), альгинат/коллагеновые микросферы (Liu W. et al., 2008), или альгинат/хитозановые пленки (Gilhotra R.M. et al., 2008). Недавно было обнаружена возможность образования хитозан/альгинатных наночастиц ионным гелеобразованием (Sarmento B. et al., 2007; Goycoolea F. et al., 2009; Goycoolea F.M. et al., 2008; Zhang H. et al., 2006). В результате наночастицы показали способность эффективно связывать и хранить биомолекулы, представляющие терапевтический интерес.
Методы ионного сшивания
Хитозан растворим только в кислых растворах, но его солевые формы, такие как хлорид или лактат соли, как правило, растворимы в воде и, следовательно, могут повысить эффективность трансфекции. Совсем недавно, Weecharangsan и др. исследовали эффективности трансфекции комплексами хитозан/ДНК, полученных с использованием различных солей хитозана, включая гидрохлорид хитозана (CHy), лактат хитозана (CLa), ацетат хитозана (CAс), аспартат хитозана (CAs) и глутамат хитозана (CGl) и обнаружили, что эффективность трансфекции комплексов хитозан /ДНК в клетках линии СНО К1 (яичника китайского хомячка) зависит от вида соли. Максимум эффективности трансфекции было найдено также при различных отношениях N/P. CHy/ДНК, CLa/ДНК, CAc/ДНК, CAs/ДНК и CGl/ДНК комплексы показали максимальную эффективность трансфекции при отношениях N/P 12, 12, 8, 6 и 6 соответственно. Все формы солей имеют более высокую эффективность трансфекциипо сравнению с основным хитозаном (Weecharangsan W. et al., 2008).
Концентрация плазмиды В дополнение к вышеупомянутым параметрам, количество ДНК, включенное в полиплекс, играет фундаментальную роль в эффективности процесса трансфекции. Согласно литературным данным, эффективность трансфекции увеличивается с концентрацией плазмиды до критической точки, после чего, уровень трансфекции будет постоянным или значительно снижен.
MacLaughlin и др. (MacLaughlin F.C. et al., 1998) показали, что, по мере увеличения концентрации плазмиды, диаметр комплексов также растет. Значительное увеличение размеров наблюдалось по мере увеличения концентрации плазмиды с использованием хитозана с более высокой молекулярной массой (102 кДа), нежели с меньшей (32 кДа), что означает, что можно сформировать комплексы необходимого диаметра путем регуляции концентрации плазмиды и молекулярной массы хитозана.
Аналогичным образом, Romren и др. показали, что увеличение концентрации плазмидной ДНК от 0,5 до 2,5 мкг/лунку привело к увеличению экспрессии люциферазы. Насыщение уровня экспрессии наблюдалось в клетках эпителиомы окуня (EPC) как следствие дальнейшего увеличения концентрации ДНК до концентрации 5 мкг/лунку (Romren K. et al., 2003).
Zhao и др. показали, что, поскольку дозировка плазмиды увеличена от 0 до 8 мкг/лунку, уровень эффективности трансфекции увеличивается соответственно в первичных хондроцитах. Когда концентрация плазмиды подошла к 16 и 32 мкг/лунку, эффективность трансфекции значительно уменьшилась. Данное уменьшение связано с агрегацией наночастиц при увеличении их количества, что в результате приводит к нарушению поглощения клетками (Zhao X. et al., 2006).
Эффективность трансфекции комплексов хитозана в значительной степени зависит от рН культуральной среды, поскольку плотность заряда хитозана зависит от рН. При рН 5,5-5,7, около 90% аминогрупп протонированы (Mao H.Q. et al., 2001). При нейтральном рН, степень протонирования уменьшается. ДНК-связывающая способность хитозана увеличивается при снижении рН вследствие того, что протонированные амины хитозана способствуют его связыванию с отрицательно заряженной ДНК, и могут формироваться малые и стабильные полиплексы (Koping-Hoggard M. et al., 2003).
Было показано, что зета-потенциал резко снижается при рН около 7 и электростатически нейтральные частицы были обнаружены при рН 7,0-7,4 (Mao H.Q. et al., 2001). Согласно литературным данным, значение рН немного ниже, чем 7 является оптимальным для достижения хорошего баланса между ассоциации и диссоциации ДНК.
Sato и др. (Sato T. et al., 2001) сравнили уровень эффективности трансфекции в клетках А549 при рН между 6,9 и 7,6. Результаты показали, что эффективность трансфекция при рН 6,9 была выше, чем рН 7,6, так как комплексы ДНК/хитозан при рН 6,9 заряжаются положительно, и могут связываться с отрицательно заряженными клетками через электростатическое взаимодействие.
Кроме того, Lavertu др. (Lavertu M. et al., 2006) сообщали, что эффективность трансфекции при рН 6,5 с хитозаном 10 кДа была выше, чем рН 7,1 в НЕК 293 клетках. Кроме того, Zhao и др. (Zhao X. et al., 2006) исследовали влияние рН среды на эффективность трансфекции на первичных хондроцитах. Было обнаружено, что высокий уровень экспрессии был получен при рН 6,8 и 7,0, и что эффективность трансфекции резко уменьшается, когда рН среды трансфекции увеличивается до 7,4, что объясняется диссоциации свободной плазмиды из комплекса при более высоком рН (Ishii T. et al., 2001).
В отличие от этого, при более кислом значении рН, эффективность трансфекции уменьшается из-за очень сильных электростатических взаимодействий между отрицательно заряженной ДНК и положительно заряженными наночастицами, что в конечном итоге замедляет высвобождение ДНК. Это явление также сообщает Liu и др. (Liu W.G. et al., 2005).
В дополнение к пониженной плотности заряда с увеличением значения рН, агрегация полиплексов также может быть отнесена и к плохой трансфекции хитозаном при нейтральном рН. Результаты Erbacher и др., а также Strand и др., оба из которых описали бимодальное распределение по размерам и образование агрегатов для хитозан/ДНК полиплексов при физиологических условиях, согласуются с данными результатами (Strand S.P. et al., 2005; Erbacher P. et al., 1998). Полиплексы хитозана/ДНК показали способность быть очень стабильными при кислых значениях pH и низкой ионной силе в ряде экспериментов по анализу поглощения этидия бромида и рассеяния лазерного света. Однако после изменения физиологических условий, полиплексы хитозана имеют тенденцию к образованию агрегатов и демонстрируют пониженную связывающую аффиность по отношению к плазмидной ДНК с нейтральным зета-потенциалом 0,95 ± 2,56 мВ, вероятно из-за низкой степени ионизации при этих условиях (Strand S.P. et al., 2005).
Приготовление альгинатных комплексов с инкапсулированным пропранолом
Происхождение концепции пассивного таргетинга относится к концу 1970-х годов, когда Маэда и др. обнаружил селективное накопление высокомолекулярных лекарств в опухолевых тканях (Matsumura Y. et al., 1986; Maeda H., 2001). Специфическое пассивное накопление макромолекул было связано с дефектом сосудистой системы опухоли, дезорганизованным эндотелием и плохим лимфатическим дренажем. С тех пор, исследователи используют эту концепцию для доставки различных лекарственных средств путем конъюгации их с полимерами или инкапсуляции в наночастицы. В настоящее время, очевидно, что долго циркулирующие макромолекулы (конъюгаты полимер-лекарственное средство) и наноразмерные частицы (например, мицеллы и липосомы) накапливаются в опухоли (Duncan R., 2003).
В 1975 году Рингстдорф первым предложил концепцию конъюгатов полимер-лекарственное средство для доставки гидрофобных препаратов к сайту их действия (Ringsdorf H., 1975). Конъюгаты полимер-лекарственное средство состоят из водорастворимого полимера, химически конъюгированного с препаратом, биоразлагаемым спейсером. Как правило, спейсер стабилен в кровотоке, но разрушается в клетке-мишени путем гидролиза или ферментативного расщепления. Такие конъюгаты могут избирательно накапливаться в опухоли, с последующим высвобождением лекарственного средства путем расщепления спейсера. Основываясь на этой концепции было разработано несколько полимерных препаратов, которые недавно вступили в фазу I / II клинических испытаний (Seymour L.W. et al., 1991).
В последние годы, коньюгаты хитозан-лекарство были также исследованы. Например, доксорубицин, конъюгированный с гликольхитозан (DOX–GC) с цис-аконитиловым спейсером (Son Y.J. et al., 2003). DOX-GC конъюгаты, содержащие 2-5 мас. % DOX самоорганизуются в наночастицы в водном растворе, но при увеличении концентрации DOX выше 5,5 мас.% осаждаются из-за увеличения гидрофобности. Интересно отметить, что гидрофобный характер DOX способствует его удержанию внутри наночастиц.
Скорость высвобождения DOX из наночастиц в значительной степени зависит от рН условий среды, так цис-аконитильный спейсер легко расщепляется при низком рН. Когда наночастицы DOX-GC систематически вводились в мышцы, они преимущественно накапливались в опухолевой ткани, как полагают благодаря эффекту пассивного таргетинга (Son Y.J. et al., 2003). Низкомолекулярный хитозан, конъюгированный с паклитакселом (LMWC-PTX) был также синтезирован с помощью химической конъюгации LMWC и PTX с сукцинатным линкером, который может расщепляться при физиологических условиях (Lee E. et al., 2008). Этот конъюгат оценивали в качестве носителя для пероральной доставки паклитаксела. Преимуществом LMWC-PTX для пероральной доставки PTX является то, что LMWC-PTX имеет возможность обойти P-гликопротеиновый барьер в желудочно-кишечном тракте и CYP450-зависимый путь в печени (Song Y. et al., 1992). N-сукцинил-производные хитозана конъюгировали с митомицином С (MMC) с использованием карбодиимидных соединений (Song Y. et al., 1992). Из-за гидрофильности N-сукцинил-хитозана, конъюгат растворим в воде, когда содержание MMC в конъюгате составляет менее 12%. Коньюгаты имели хорошую противоопухолевую активность в отношении различных опухолей, таких как мышиный лейкоз (L1210 и P388), В16 меланома, саркома 180, метастатическая опухоль печени мыши (М5076) и мышиная карцинома печени (MH134) (Kato Y. et al., 2004).
Хитозан и его производные могут быть ковалентно сшиты с лекарством с образованием наноразмерных частиц (Prabaharan M. et al., 2005). Процесс сшивки включает в себя образование ковалентных связей между цепью хитозана и сшивающим агентом. Широко используются следующие сшивающие бифункциональные сшивающие агенты: PEG, дикарбоновые кислоты, глутаровый альдегид, из монофункциональных - эпихлоргидрин (Goldberg M. et al., 2007; Bodnar M. et al., 2005).
Как упоминалось ранее, для получения частиц доступны несколько методов, как например, эмульгирование, ионотропное гелеобразование, испарение растворителя, сушка распылением, коацервация и просеивание (Ohya Y et al., 1994; Calvo P. et al., 1997; Agnihotri S.A. et al., 2007). Большое количество гидрофильных и гидрофобных лекарственных средств может быть загружено в наночастицы хитозана, эффективность загрузки зависит от физико-химических характеристик препарата и способа приготовления наночастиц. Способы получения микро- и наночастиц хитозана подробно проанализированы в (Prabaharan M. et al., 2005; Agnihotri S.A. et al., 2007). Гидрофильный 5-фторурацил успешно загружен в наночастицы хитозана (250-300 нм в диаметре) с применением метода эмульсии «вода-в-масле», с последующей химической сшивкой хитозана в присутствии глутаральдегида (Ohya Y et al., 1994).
Изучение эффективности инкапсуляции
Влияние концентрации хитозана, декстран сульфата и пДНК на зета-потенциал анализировали методом Тагучи в программном пакете Minitab-16 (Рисунок 16). Зета потенциал наночастиц уменьшался с уменьшением концентрации декстран сульфата и пДНК, а также с увеличением концентрации хитозана.
Как видно из Таблицы 5 зета потенциал наночастиц вариировал в пределах от -11.5 до 23.3 (при pH 5.5). Наименьший зета потенциал наблюдался в образце E9, с наименьшей концентрацией хитозана. Самый высокий зета потенциал был у образцов E10 и E12 с наименьшей концентрацией пДНК и наибольшей концентрацией хитозана. Образцы с низким зета потенциалом имели низкие концентрации хитозана и высокие – декстран сульфата. Негативный заряд на поверхности или низкий зета потенциал наночастиц (образцы E3,E5, E6 – E9) указывает на избыток пДНК и/или декстран сульфата в смеси, а также на то, что связывание ДНК и декстран сульфата с хитозаном было неполным.
Заряд частиц E1, E2 ,E4 и всех приготовленных наночастиц с высокой конценрацией хитозана (E10 – E18) был достаточно позитивным, для того чтобы частицы не стали отрицательно заряженными. Более того, появление свободных аминогрупп на поверхности ответственно за положительный зета потенциал частиц (Hallaj-Nezhadi S. et al., 2011). Концентрация хитозана(о/о в/об) Концентрация пДНК (рг/мл)
Количество пДНК, инкапсулированное в частицы определялось как разница между количеством внесенной и свободной ДНК в растворе. За эффективность инкапсуляции (%) принимали отношение количества инкапсулированной ДНК к количеству внесенной ДНК. Влияние концентраций хитозана, декстран сульфата и пДНК на эффективность инкапсуляции анализировали с помощью метода Тагучи с использованием программного пакета Minitab-16 (Рисунок 17)
Как видно из Рисунка 17 эффективность инкапсуляции композитных наночастиц значительно увеличивалась в присутствии декстран сульфата, однако этот эффект пропадал при дальнейшем увеличении декстран сульфата от 0.001 до 0.002%. Эффективность инкапсуляции также росла при увеличении концентрации хитозана и снижении количества пДНК. Увеличение эффективности инкапсуляции пДНК в присутствии декстран сульфата можно объяснить общим усилением структуры наночастицы по сравнению с частицами где использован только хитозан (Khorram M. et al., 2015).
Эффективность инкапсуляции пДНК у частиц, состоящих из декстрана и хитозана варьировала в пределах от 47.31 до 98.32. Как сообщалось раньше, связь между хитозаном и ДНК (Li XW et al., 2003), и связь между хитозаном и декстран сульфатом (Chen Y. et al., 2007) была очень стабильной, что приводило к сильному ионному взаимодействию в парах пДНК – хитозан и декстран сульфат – хитозан. Кроме того, следует учитывать, что гидрофобные взаимодействия и водородные связи, которые могут возникать между ДНК и сахарами, также могут вносить вклад в стабилизацию структуры композитной наночастицы.
Эти результаты поддерживают идею множественного взаимодействия между биополимерами: хитозаном, декстран сульфатом и ДНК. Наименьшая эффективность инкапсуляции наблюдалась в образце E9, где содержалось наименьшее количество хитозана, самую большую эффективность инкапсуляции показал образец Е12, в котором были самые высокие концентрации хитозана и декстран сульфата и самые низкие концентрации пДНК.
Исследование с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) показала, что инкапсулированные ДНК наночастицы, содержащие хитозан и декстран сульфат имеют сферическую форму. Также было обнаружена аггрегация частиц, согласно результатам DLS. Размер частиц уменьшался в процессе высушивания, так например частицы образца E14 согласно данным СЭМ имели размер около 100 нм, в то время как измерения DLS показывали размер частиц 213 нм. Последний анализ производится в водном растворе, где наночастицы имеют тенденцию к набуханию, тогда как в случае СЭМ образцы высушивают. Различия в условиях подготовки образцов, по-видимому, и являются причиной разных показаний этих двух методов (Dickerson R. E. et al., 1982). Известно, что для поддержания спиральной структуры ДНК также необходима вода, без которой структура схлопывается (Guo R. et al., 2013). Кроме того, в частицах, приготовленных без добавления декстран сульфата наблюдались тороидальные и палочковидные структуры (Рисунок 18). Такие изменения при высушивании, очевидно, свидетельствуют о стабилизирующей роли декстран сульфата.
Способность хитозана и декстрана образовывать комплексы с ДНК и способность сформированых наночастиц удерживать инкапсулированную ДНК изучалась с помощью элекрофореза в агарозном геле. Результаты эксперимента приведены на Рисунке 18. За исключением образцов E7, E8 и E9 ДНК, заключенная в наночастицы, теряла электрофоретическую подвижность и оставалась в лунках связанная с наночастицами. Эти данные хорошо согласуются с эффективностью инкапсуляции, которая для образцов E7, E8 и E9 была низкой (Таблица 5), в связи с чем, в препаратах оставалась несвязанная пДНК. Об этом же свидетельствует соотношение азота и фосфора в данных частицах, которое равняется 1.4, то есть о избытке ДНК, которую можно видеть мигрирующей в агарозном геле.
