Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ. 10
ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ 11
ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 15
I. Методы изготовления биочипов 15
1. Синтез вещества на биочипе 15
2. Методы нанесения белков на поверхность биочипа 16
2.1. Последовательные методы 16
2.1.1. Нанесение капель автоматической пипеткой 1 6
2.1.2. Микроконтактное нанесение 16
2.1.3. Микроструйное нанесение 17
2.1.4. Ближнее электронапыление 17
2.2. Параллельные методы 18
2.2.1. Микроконтактная печать 18
2.2.2. Метод микропроточных сетей 19
2.2.3. Фотоактивируемая иммобилизация белка 19
2.2.4. Дальнее электронапыление 20 3 Заключение 21
П. Методы иммобилизации белка на биочипах 22
1. Адсорбция 23
2. Химическое связывание 25
2.2. Связывание молекул белка с твердой поверхностью с помощью молекул, имеющих альдегидные группы
2.3 Аминирование поверхности твердого субстрата 28
2.4 «Пришивка» молекул белка через Шиффовы основания и их восстановление
3. Методы, при которых осуществляется ковалентное связывание белка с предварительно адсорбированным на поверхности подложки веществом
3.1 Активация поверхности пластика глутаровым диальдегидом
4. Методы, при которых осуществляется прочное не ковалентное связывание молекул белка с предварительно иммобилизованным на поверхности подложки веществом.
5. Заключение 31
III. Методы определения поверхностных антигенов клеток крови 32
1. Иммуноцитохимические методы 32
1.1. Прямой метод З 3
1.2. Двойной непрямой метод 33
1.3. Тройной непрямой метод 33
1.4. Метод растворимых ферментных комплексов 34
1.5. Авидин-биотиновые методы 35
2. Иммунофлюоресцентное маркирование мембранных антигенов 36
2.1. Прямой метод 36
2.2 Непрямой метод 36
3. Проточная цитофлюориметрия 36
4. Заключение 40
IV. Поверхностные антигены клеток крови 42
1. Поверхностные антигены эритроцитов 42
1.1. Антигены системы АВО 42
1.2. Антигены системы Rhesus (Rh) 43
2. Поверхностные антигены клеток иммунной системы 44
V. Лимфопролиферативные заболевания 45
1. Иммунная диагностика опухолей системы крови. 46
2. Панель антител, наносимых на биочип. 50
3. Выбор нозологической формы опухоли, клетки которой будут использованы при проведении дальнейших исследований с помощью биочипов.
VI. Анализ зарубежного опыта по созданию биочипов для определения поверхностных антигенов клеток
VII. Условия проведения анализа на биочипах 62
1. Подавление неспецифического связывания клеток 62
2. Устранение не специфически связавшихся клеток 64
3. Регистрация результата 64 VIII. Заключение и постановка задачи 64
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ I. Материалы
1. Подложки для биочипов
2. Реагенты 66
3. Антитела 67
3.1. Антитела, специфичные к поверхностным антигенам 67 эритроцитов
3.2. Антитела, специфичные к поверхностным антигенам, 67 относящимся к CD (cluster differenciation) номенклатуре
3.3. Антитела, специфичные к антигенам лимфоцитов, не 67 относящимся к CD номенклатуре
68
3.4 Сыворотки, специфичные к антигенам системы HLA I класса
4. Растворы
5. Расходные материалы
П. Оборудование 68
1. Серийно выпускаемое оборудование 68
2. Нестандартное оборудование 69
2.1. Проточная установка для работы с биочипами 69
2.2. Установка для обработки подложек в 70 высокочастотном газовом разряде
2.3. Влажная камера 71
III. Методы
1. Изготовление биочипов на подложках, обеспечивающих не ковалентное связывание молекул белка
1.1. Изготовление (подготовка) подложек 72
1.1.1 Полистироловые подложки 72
1.1.2. Полистироловые подложки с поверхностью, обработанной в высокочастотном газовом разряде
1.1.3. Подложки из стекла 72
1.1.3.1. Обезжиривание стекол 73
1.1.3.2 Нанесение нитроцеллюлозного покрытия на поверхность обезжиренных стекол
1.1.4. Подложки из поливинилхлорида (ПВХ) 73
1.2. Нанесение антител на подложки. 73
1.2.1. Изготовление биочипов методом 74 микроконтактной печати на установке «Genetix-Q-Array»
1.2.2. Изготовление биочипов путем нанесения на подложку капель растворов антител с помощью автоматической микропипетки
2. Изготовление биочипов на подложках, обеспечивающих ковалентное связывание молекул белка
2.1. Изготовление биочипов на полистироловых подложках с поверхностью, обработанной глутаровым альдегидом.
2.2 Изготовление биочипов на подложках А1/ПА/декс 75
2.2.1. Предварительная очистка алюминиевой поверхности обработкой в высокочастотном газовом разряде 76
77
2.2.2. Аминирование поверхности
2.2.3. Окисление декстрана 78
2.2.4. Обработка поверхности подложки окисленным декстраном
2.2.5. Нанесение антител на подложку 78
2.2.6. Восстановление Шифровых оснований
3. Хранение биочипов.
4. Подготовка биочипов к использованию 79
5. Проведение исследований с помощью биочипов 79
5.1. Эксперименты с биочипами без использования проточной 80 камеры
5.1.1. Блокирование сайтов неспецифического 80 связывания
5.1.2. Инкубация биочипа с клеточной суспензией 80
5.1.3. Отмывка биочипа 80
5.2. Эксперименты с использованием проточной установки 81
5.2.1. Подготовка к проведению эксперимента 81
5.2.2. Блокирование сайтов неспецифического 81 связывания
5.2.3. Инкубация биочипа с клеточной суспензией 82
5.2.4. Отмывка биочипа в проточной камере 82
5.2.5. Концентрирование клеток в области пятен биочипа 82
6. Определение плотности связывания клеток 83
7. Дополнительные исследования связавшихся клеток 84
7.1. Окраска связавшихся с биочипом клеток по Романовскому-Гимзе и их морфологическое исследование
7.2. Окраска связавшихся с биочипом ядросодержащих клеток акридиновым оранжевым
7.3. Окраска связавшихся клеток флюоресцентно-меченными 85 антителами (прямой метод окраски)
8. Приготовление клеточной суспензии 85
8.1. Приготовление суспензии лимфоцитов 85
8.2. Приготовление суспензии эритроцитов из цельной крови 86
8.3. Приготовление суспензии из отмытых эритроцитов 86
ГЛАВА 4.
РЕЗУЛЬТАТЫ 87
I. Определение возможности связывания клеток с антителами, иммобилизованными на твердых поверхностях. Выбор материала подложек для изготовления биочипов
1. Определение возможности связывания клеток с антителами, адсорбированными в лунках иммунологических планшетов
2. Определение возможности связывания клеток с антителами, адсорбированными на стекле
3. Определение возможности использования подложек из нитроцеллюлозы
4. Определение возможности использования стеклянных подложек с покрытием из нитроцеллюлозы
5. Определение возможности использования подложек из полистирола
6. Определение возможности использования подложек из полистирола с поверхностью, активированной в высокочастотном газовом разряде
7. Определение возможности использования полистироловых подложек обработанных глутаровым альдегидом
8. Определение возможности использования подложек из поливинилхлорида.
9. Определение возможности использования подложек с покрытием А1/АПТЭС/окисленный декстран
10. Заключение. Обоснование выбора материала подложки 104
И. Выбор способа нанесения пятен на подложку биочипа 105
III. Влияние некоторых факторов на результат анализа, Ю6 проводимого с помощью биочипов
1. Влияние на результаты экспериментов замораживания и сроков хранения биочипов
2.Влияние содержания в суспензии клеток, экспрессирующих соответствующие антигены на плотность заполнения пятен биочипа.
3. Влияние концентрации клеток в суспензии на плотность заполнения пятен биочипа и на соотношение субпопуляции связавшихся клеток
IV. Дополнительные исследования связавшихся с биочипом клеток 114
1. Окраска и морфологическое исследование связавшихся с 114 биочипом клеток
2. Окраска связавшихся клеток флуоресцентным красителем 117
3. Окраска связавшихся клеток флюоресцентно-меченными антителами. Определение специфичности связывания клеток
V. Оценка чувствительности анализа, проводимого с помощью биочипов
VI. Разработка способа повышения чувствительности анализа, проводимого с помощью биочипов
1. Отмывка биочипов в проточной камере 122
2. Исследование процесса отрыва клеток не связанных с антителами при отмывке биочипа в проточной камере
3. Исследование процесса отрыва клеток связавшихся с антителами при отмывке биочипа в проточной камере
VII. Разработка метода концентрирования клеток в области пятен биочипа
VIII. Исследование с помощью биочипов клеток здоровых доноров 133
1. Эксперименты с эритроцитами здоровых доноров 133
2. Эксперименты с лимфоцитами здоровых доноров 135
IX. Исследование с помощью биочипов клеток больных лимфопролиферативными заболеваниями.
1. Определение в исследуемых образцах содержания клеток, экспрессирующих различные антигены.
2 Окраска и морфологическое исследование опухолевых 1клеток
X. Создание экспериментальных биочипов для определения антигенов системы HLA I класса.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 151
ВЫВОДЫ 153
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 154
Благодарности.
Введение к работе
В современных биологических и медицинских исследованиях все большее распространение получает скрининговой подход, требующий параллельного проведения большого числа анализов. Все большее применение в последние годы находят биочипы (микрочипы, микроматрицы небольшие аналитические устройства, имеющие в себе компоненты биологического происхождения и предназначенные для проведения одновременного параллельного анализа многих межмолекулярных взаимодействий.
Биочип представляет собой твердый субстрат, на поверхность которого нанесен упорядоченный рисунок (чаще всего решетка) микропятен одного или нескольких биологических веществ [28]. Именно это определение биочипа (микроматрицы, микрочипа) и будет в дальнейшем использоваться в данной работе.
Применение биочипов открывает большие перспективы. При массовом производстве себестоимость 1 биочипа очень мала, а при его использовании расходуется минимальное количество реактивов.
В основу создания биочипов положены следующие принципы: 1)миниатюризация;2) параллельность и одновременность проведения многих тестов; 3) объединение множества аналогичных тест-систем на одном носителе. [22,60]
Огромный вклад в развитие микрочипов внесли академик А.Д. Мирзабеков [5,6,22,27,33,58] и профессор из Лондонского университета R. Ekins [60,62], показавшие, что размеры аналитической системы в иммунологии могут быть уменьшены без потери чувствительности. Несколькими годами ранее к подобным выводам пришел Tse-Wen Chang [56].
На подложке биочипа могут быть иммобилизированы молекулы различных веществ биологического происхождения. Чаще всего это молекулы белков или нуклеиновых кислот. Работа над глобальным проектом «Геном человека» дала мощный стимул развитию олигонуклеотидных биочипов, на их создание выделялось огромное финансирование. В настоящее время олигонуклеотидные биочипы производятся промышленно и включают свыше 400000 различных нуклеотидов [18]. Они успешно применяются для биологических и медицинских исследований [111].
Создание ДНК-биочипов было более простой задачей по сравнению с созданием белковых биочипов. Это связано с тем, что молекулы ДНК менее разнообразны в химическом и биофизическом плане, более стабильны и менее подвержены повреждениям.
Для создания белкового биочипа необходимо было преодолеть большое количество технологических и биохимических проблем. В частности, в отличие от нуклеотидов, химические свойства различных белков сильнее отличаются между собой, и химически связать с подложкой одинаковые количества разных белков достаточно сложно. Растворы различных белков обладают различной вязкостью и поверхностным натяжением, что создает проблемы при переносе равных количеств различных белков на подложку контактными методами. При контакте с подложкой нативная структура белков может изменяться. Молекулы белков имеют различный электрический заряд, в связи с этим между ними и подложкой (также имеющей определенный электрический заряд) действуют силы электростатического притяжения или отталкивания [1,14,16].
Тем не менее, в течение последних нескольких лет многие сложности были преодолены, и ряд зарубежных биотехнологических компаний освоил выпуск иммунологических биочипов, предназначенных для различных целей (выявление аллергенов, гаптенов, антигенов возбудителей инфекционных заболеваний, опухолевых антигенов, для выявления антител, для мониторинга наличия белковых токсинов в окружающей среде и др.) [28]. Весьма перспективным представляется создание иммунологических биочипов, предназначенных для исследования поверхностных антигенов клеток. Но их создание является еще более сложной задачей по сравнению с созданием обычных белковых биочипов, предназначенных для выявления свободных молекул.
Помимо сложностей, общих для всех белковых биочипов, здесь возникают дополнительные ограничения.
1) Должны использоваться высоко аффинные антитела, прочно
связывающиеся с клетками.
2) Молекулы антител должны быть прочно прикреплены к подложке, чтобы не происходило их отрыва после связывания с клетками при отмывке биочипа.
3) Сайты неспецифического связывания должны быть блокированы веществом, не способным связываться с молекулами адгезии клеток.
4) При контакте с подложкой не должно происходить разрушения клеток.
В 1983 г. Chang создал, пожалуй, первый в мире биочип для иммунофенотипирования клеток [56]. С помощью микропипетки он наносил капли растворов антител на покровные стекла в условиях низкой температуры и 100% влажности. Иммобилизация белка на подложке обеспечивалась за счет адсорбции. Созданные им биочипы позволяли определять некоторые поверхностные антигены лимфоцитов. Но эти работы вскоре были надолго забыты, так как нанесение капель вручную было чрезвычайно трудоемким и достаточно длительным.
Вместе с тем в современных условиях такие биочипы могут оказаться чрезвычайно полезными для иммунофенотипирования клеток и найти свое применение в области гематологии и онкологии.
В гематологии диагноз ставится по совокупности результатов нескольких исследований опухолевых клеток [34]: 1) определения иммунофенотипа; 2) морфологических исследований; 3) цитохимических исследований; 4) кариологических исследований; 5) генетических исследований.
Определение иммунофенотипа клеток и морфологическое исследование являются ведущими лабораторными диагностическими методами.
Иммунофенотипирование клеток осуществляется с помощью проточной цитофлюориметрии или ряда иммуноцитохимических (иммунофлюоресцентных) методов.
Проведение исследований с помощью данных методов является трудоемким, требует высокой квалификации персонала, дорогостоящего оборудования и относительно высокого расхода антител и может быть доступно только в небольшом числе ведущих гематологических учреждений.
Создание и последующее внедрение иммунологических биочипов, предназначенных для определения поверхностных антигенов клеток в значительной мере могло бы способствовать решению этих проблем.
Автору не известно о проведении работ в данном направлении, в нашей стране. На момент написания данной работы в зарубежной литературе было опубликовано лишь несколько статей, посвященных этой теме [46-49,54,63,73,77,83,101,106,119].Созданные иностранными авторами биочипы еще не вышли за пределы их лабораторий.
Кроме того, в опубликованных работах не уделяется внимания морфологическим и иным исследованиям клеток, связавшихся с биочипом.
Такой подход не позволяет получить информацию о том, какие именно клетки оказалась связанными с теми или иными антителами на поверхности биочипа. Информация об иммунофенотипе дается в отрыве от информации о других характеристиках связавшихся клеток, что снижает ее диагностическую ценность. Еще не исследованы очень многие вопросы, связанные с закономерностями связывания клеток с биочипом и их отрыва. Целью работы является создание иммунологических биочипов, позволяющих осуществлять определение поверхностных антигенов, а также проводить морфологическое исследование связавшихся клеток.
