Введение к работе
В связи со старением населения развитых стран и, соответственно, ростом онкологической заболеваемости, на сегодняшний день остро стоит проблема диагностики. И если инструментальные методы позволяют диагностировать заболевание на поздней стадии, то задача молекулярной биохимии - разработать методы, позволяющие диагностировать заболевания на возможно более ранней стадии, а также - дифференцировать злокачественные опухоли от заболеваний доброкачественной природы.
Рак предстательной железы представляет собой самое распространенное онкологическое заболевание мужской половой сферы. В последние годы много работ направленно на изучение этиологии и патогенеза РПЖ, однако, до сих пор не существует единой общепризнанной концепции причины развития данного заболевания. Научные открытия последних лет позволили по-новому рассмотреть патогенез РПЖ с позиции нарушений различных регуляторних звеньев метаболизма предстательной железы.
В настоящее время во многих клиниках по всему миру активно развивается молекулярная диагностика онкологических заболеваний, в том числе и рака предстательной железы. Особенностью данной патологии является отсутствие четкой симптоматической картины опухолевого процесса и, в связи с этим, поздняя диагностика и лечение РПЖ. Использование различных молекулярных маркеров для диагностики аденокарциномы предстательной железы позволит в будущем диагностировать самое начало опухолевого процесса. На сегодняшний день открыты и изучаются десятки молекулярных маркеров, в т.ч. и маркеров РПЖ. Нами были отобраны 2 таких маркера: метилированная форма гена, кодирующего глутатион-S-трансферазу класса %\ (GSTP1) и сериновая протеаза II типа хепсин.
Одним из наиболее значимых механизмов регуляции процессов канцерогенеза в организме является метилирование CpG - островков, расположенных в промоторной области генов-супрессоров. Инактивация генов-супрессоров опухолевого роста в результате метилирования промоторных областей широко распространена в опухолях различного типа, в том числе и при аденокарциноме предстательной железы. Одним из первых генов, для которых при данном заболевании было показано гиперметилирование промоторной области, является ген GSTP1. GSTP1 - это фермент, отвечающий за детоксикацию электрофильных и кислых ксенобиотиков и выполняющий антиоксидантную роль в организме человека. Метилирование промоторной области гена GSTP1 является одним из наиболее
частых событий из когда-либо описанных при образовании аденокарциномы предстательной железы, а также наиболее ранним.
Сериновая протеаза хепсин в норме экспрессируется клетками предстательной железы на очень низком уровне, но при развитии РПЖ ее экспрессия значительно увеличивается и коррелирует со стадией заболевания. Также из литературных данных известно, что уровень мРНК хепсина в 90% образцах опухолей простаты возрастает примерно в 10 раз по сравнению с нормой. Что касается роли хепсина в процессах канцерогенеза, то предполагают, что хепсин участвует в разрушении белков межклеточного матрикса и облегчает тем самым миграцию опухолевых клеток предстательной железы. Также высказывается предположение о том, что хепсин может быть активатором фактора роста гепатоцитов. HGF экспрессируется клетками разных тканей, в том числе клетками предстательной железы. Известно, что экспрессия HGF увеличивается при РПЖ. HGF является потенциальным стимулятором рецептора тирозинкиназы C-met, и играет важную роль в развитии опухолевого процесса. Таким образом, активация HGF хепсином - это один из возможных механизмов, приводящих к развитию онкологического процесса. Как и большинство сериновых протеаз, хепсин обладает узкой субстратной специфичностью и преимущественно гидролизует пептидную связь Р5-Р4-РЗ-Р2-Р1 между Р2 и Р1, где Р5 - Lys, Pro, Р4 - Lys, Gin, РЗ - Asn, Leu, Thr, P2 - Arg, PI - X. Именно это свойство хепсина было нами использовано при подборе субстрата. В качестве последнего, в эксперименте был использован коммерческий субстрат SPECTROZYME РСа, который специфично гидролизуется хепсином. Мы остановили свой выбор на этом субстрате, т.к. известно, что SPECTROZYME РСа используется для контроля активности рекомбинантного хепсина.
Важным преимуществом нашей работы явилась неинвазивность используемых методов: клетки предстательной железы, используемые для анализа, получены нами из мочи после пальцевого ректального исследования. Очевидно, что в настоящее время при диагностике невозможно избежать биопсии, но мы надеемся, что данная методика позволит пациентам хотя бы на ранних стадиях избежать этой процедуры.
Цель работы и задачи исследования.
Целью данной работы явилась разработка новых методов неинвазивной диагностики РПЖ на ранних стадиях заболевания. Для выполнения цели исследования были поставлены следующие задачи:
1. Разработать методику определения метилированного статуса промоторного участка гена GSTP1 и оценить эффективность ее применения при
исследованиях мочи больных с различными патологиями предстательной железы.
-
Проанализировать и оценить статус метилирования гена gstpl у пациентов с различными патологиями предстательной железы.
-
Разработать методику определения активности сериновой протеазы хеисин в моче больных с различными патологиями предстательной железы.
-
Провести исследование амидолитическои активности хепсина в моче пациентов с раком и другими патологиями предстательной железы.
-
Оценить и сравнить диагностическую точность и положительную прогностическую ценность индивидуального и совместного применения исследуемых маркеров при раке предстательной железы.
Научная новизна исследования.
Впервые была разработана и использована методика определения метилированного статуса гена gstpl в моче пациентов с подозрением на рак предстательной железы.
Впервые была разработана методика определения активности сериновой протеазы хепсин на клетках предстательной железы человека. Данный метод является неиивазивным и удобным в применении, что выгодно отличает его от биопсии и анализа крови на ПСА.
Впервые для больных раком предстательной железы и простатической интраэпителиальной неоплазией применена методика определения активности сериновой протеазы хепсин.
Практическая значимость работы.
Разработана и предложена в клиническую практику современная методика ранней диагностики РПЖ методом определения амидолитическои активности сериновой протеазы хепсин.
Разработана и апробирована методика совместной оценки амидолитическои активности хепсина и метилированного статуса гена gstpl для диагностики рака предстательной железы.
Апробация работы. Результаты работы были доложены и обсуждены на:
-
Заседании кафедры биологической химии ММА им. И. М. Сеченова (май 2008 г., г. Москва)
-
Конференции кафедры урологии ММА им. И. М. Сеченова (февраль 2008 г., г. Москва)
-
X урологической конференции молодых ученых (сентябрь 2007г, г. Москва).
4. XXXII конгрессе FEBS «Molecular Machines» (июль 2007 г., г. Вена).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 в центральных периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Основные положения диссертации, выносимые на защиту
-
Метилирование промоторной области гена gstpl является значимым показателем оценки состояния предстательной железы в норме и при патологических процессах в ткани предстательной железы.
-
Определение активности сериновой протеазы хепсин является специфичным при онкологических заболеваниях предстательной железы.
-
Изменение активности сериновой протеазы хепсин на поверхности клеток предстательной железы является маркером патологического процесса в ткани.
-
Предпочтительно совместное использование исследуемых маркеров для диагностики патологического состояния предстательной железы.
-
Использование предложенной методики исследования мочи для ранней диагностики РПЖ и ПИН является более информативным, чем применяемый на сегодняшний день метод определения ПСА в крови.
Структура и объем работы. Диссертация содержит разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы; список литературы содержит 162 ссылки. Работа изложена на 117 страницах, содержит 6 таблиц и 29 рисунков.
