Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 5
1.Процесс фибриллообразования 9
1.1 Актуальность проблемы 9
1.2 История изучения фибриллообразования 10
2. Искусственные белки 13
2.1 Дизайн и свойства искусственного белка альбебетина 13
2.2 Биологически активные производные альбебетина 17
2.2.1 Альбеферон (ABBI) - ABB с фрагментом l30LKEKKYSP137 человеческого интерферона-а2 19
2.2.2. ABB-df- ABB с фрагментом 4iTGENHR46 фактора дифференцировки HLDF клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека 20
3. Предфибриллярное или промежуточное состояние белка ..22
3.1 Общая характеристика расплавленной глобулы н ее роль в биологических процессах 22
3.2 Расплавленная глобула и фибриллообразование 24
4. Современные исследования фибриллообразования 25
4.1 Модели фибриллообразования 25
4.2 Исследование цитотоксичности предфибриллярных образований 31
3. Материалы и методы 35
3.1. Материалы 35
3.1.1 Штаммы Е. coli. 36
3.1.2 Питательные среды 36
3.2. Методы получения искусственных белков 37
3.2.1 Экспрессия генов гибридных белков 37
3.2.2 Выделение и очистка гибридных белков 38
3.2.3 Выделение и очистка целевых искусственных белков 39
3.3 Методы исследований амнлоидообразования искусственных белков 40
3.3.1 Метод флуоресцентного анализа 41
3.3.2 Метод атомно-с иловой микроскопии 41
3.3.3 Метод кругового дихроизма 44
3.3.4 Методы исследования цитотоксичной активности амилоидных структур ABB 44
4. Результаты 46
4.1. Сравнительный анализ кинетики амилоидообразования ABB и его производных 46
4.2 Влияние электростатических взаимодействий на амилоидообразование искусственных белков , 47
4.3 Влияние температуры и амилоидообразования на вторичную структуру искусственных белков 51
4.4 Модель фибриллогенеза искусственных белков. Полиморфизм амилоидных структур и пути их олигомеризации 53
4.5 Исследование цитотоксичности амилоидных структур ABB 60
5. Обсуждение 63
5.1 Роль электростатических взаимодействий в амилоидообразовании ABB 63
5.2. Предфибриллярное состояние белка 66
5.3. Модель фибриллогенеза белков de novo 68
5.4. Амилоидные структуры ABB и цитотоксичность 70
5.5. Заключение 72
Выводы 76
- Биологически активные производные альбебетина
- Исследование цитотоксичности предфибриллярных образований
- Методы исследований амнлоидообразования искусственных белков
- Модель фибриллогенеза искусственных белков. Полиморфизм амилоидных структур и пути их олигомеризации
Биологически активные производные альбебетина
На примере ABB была показана принципиальная возможность использования искусственных белков в качестве носителей биологически активных природных последовательностей. Нативное состояние ABB было охарактеризовано, как близкое к таковому расплавленной глобулы, которая играет важнейшую роль во многих природных процессах (51, 52). Такое нативное состояние и низкая собственная иммуногенность (53) делают ABB удобным инертным носителем для активных фрагментов. При выборе активных фрагментов необходимо было учитывать следующие факторы: биологическая активность должна легко тестироваться, вводимая последовательность должна иметь малые размеры и не должна существенно влиять на структуру альбебетина. Поскольку белок обладает высоким отрицательным зарядом, то желательно, чтобы вводимый фрагмент имел основную природу. Данным характеристикам соответствовали 130 137 октапептид LKEKKYSP из природной последовательности человеческого интерферона-а2 (49, 54) и гексапептид 4ITGENHR46 (HLDF-6) (55) фактора дифференцировки HLDF клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека (56). Производные альбебетина были сконструированы путем присоединения коротких последовательностей к JV-концевой части белка (рис. 2). Они не изменили заданную вторичную и, по-видимому, не очень жесткую третичную структуру ABB, а также сохранили свойственные биологически активным фрагментам функции (50,57). Интерфероны. Интерфероны были открыты в середине 50-х годов прошлого столетия как соединения с антивирусной активностью, и затем разделены на два основных класса по антигенным, биологическим и физико-химическим свойствам. К первому классу относятся интерфероны, стабильные при рН 2 — фибробластный или р-интерферон (продукт одного гена) и лейкоцитарный или а-интерферон (продукт примерно 15 неаллельных генов). Остальные подтипы этого класса мало изучены. Второй класс включает не стабильный при рН 2 иммунный или у-интерферон, синтезируемый активированными Т-лимфоцитами. Интерфероны аир имеют общую рецепторную систему, тогда как для у-интерферона существует свой рецептор. Помимо обнаруженной антивирусной активности было показано, что они функционируют также как ингибиторы клеточной пролиферации, регулируют иммунный ответ и активируют многие гены. Интерферон-а2 широко используется в медицине для лечения хронического гепатита С (58), гепатита В (59), саркомы Капоши у ВИЧ-инфицированных (60) и злокачественных новообразований (61).
Методы биоинженерии позволяют получать новые молекулы - интерфероновые гибриды, и, таким образом, изучать механизмы биологических активностей интерферона, имеющего три сайта связывания с рецептором и вспомогательными молекулами, обеспечивающими проявление различных активностей (62). В данном случае биоинженерные исследования направлены на снижение побочных эффектов при клиническом применении препаратов. Например, гибридный интерферон аг/ag проявляет высокоспецифическую активность ccg-ro и намного более низкие побочные эффекты а2-интерферона (61). Использование искусственного белка в качестве инертного носителя активного фрагмента интерферона а2 стало принципиально новым подходом к этой проблеме. Альбеферон. Октапептид U0LKEKKYSP137 из природной последовательности человеческого интерферона-а2 (как и септапептид LKDRHDF36) играет ключевую роль в формировании пространственного центра взаимодействия с субъединицей рецептора интерферона-аг. Активный фрагмент был введен в последовательность ABB путем присоединения к TV-концу молекулы искусственного белка. Ген альбеферона (ABBI) был синтезирован химически и экспресс ирован сначала в бесклеточной системе трансляции, а затем в штамме E.coli. Методом КД было показано, что октапептид стабилизировал молекулу ABB, увеличив ее компактность и кооперативи ость взаимодействий (49). Процентное содержание а- и р1- структур для ABBI составило 27% и 35% соответственно. При исследовании биологической активности было показано, что альбеферон также как и сам октапептид, обладает требуемой биологической активностью, индуцируя процесс бласттрансформации мышиных тимоцитов in vitro эффективнее самого интерферона при концентрации 10"11 М (50). Раздел 2.2.2. ABB-df - ABB с фрагментом 4ITGENHR46 фактора дифференцироеки HLDF клеток линии HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека. Фактор дифференцироеки HLDF. Развитие опухолевых образований связано с нарушением механизма клеточной дифференцироеки, поэтому огромный интерес для исследователей представляют эндогенные факторы, индуцирующие клеточную дифференцировку и, таким образом, останавливающие рост злокачественных опухолей. В ходе дифференцироеки клеток линии HL-60 острого промиелоиитарного лейкоза человека, был обнаружен лейкоцитарный биорегулятор дифференцироеки по гранулоцитарному пути клеток линии HL-60 (Human leukemia differentiation factor). Это небольшой гликозилированный белок, содержащий 51 аминокислоту и имеющий молекулярную массу 8.2 кДа (56). Полноразмерный фактор HLDF способен индуцировать дифференцировку клеток HL-60 в фенотипически зрелые гранул оциты и снижать общий уровень их пролиферации (56). Гексапептидный фрагмент фактора дифференцировки HL-60, - HLDF 6. Фактор HLDF был синтезирован твердофазным синтезом, так как из-за высокой ДНК/РНК гидролизующей активности продуцировать его в прокариотических системах не удалось (56). По мере удлинения поли пептидной цепочки фактора отбирали аликвоты синтезированных пептидов и анализировали их дифференцирующую активность. Было показано, что гексапептид 4iTGENHR46 проявляет дифференцирующую активность и подавляет деление клеток, как и полноразмерный нативный фактор HLDF, при этом дифференцирующая активность гексапептида определяется тремя наиболее функционально значимыми аминокислотами - Glu3, His5 и Arg6. Помимо того, что HLDF-6 обладает дифференцирующей и антипролиферативной активностью полноразмерного фактора дифференцировки HL-60, он проявляет противоопухолевое действие на модели перевиваемой миеломы NSO.
Получение рекомбинантного фактора HLDF сопряжено с большими сложностями, а пептидные препараты, исследуемые в лабораторных условиях, не пригодны в клинической практике, поэтому особенно актуально конструирование белковых препаратов, воспроизводящих противоопухолевые свойства эндогенных биорегуляторов. Гексапептидный фрагмент HLDF-6 был включен в ЛГ-концевую последовательность ABB. При этом TV-концевой аминокислотный остаток (Metl) молекулы ABB был удален (как и в случае ABBI), так как его присутствие могло негативно сказаться на конформации гексапептида. Полученная конструкция была названа ABB-df. ABB-df, как и ABBI, был экспрессирован в штамме E.coli. Исследования методом КД показали, что введение гексапептидного фрагмента HLDF-6 не привело к существенным отличиям в составе вторичной структуры полученного белка ABB-df от исходного ABB. Содержание а-структуры составило 28%, а р- 33%. Спектры ЯМР ABB, ABBI и ABB-df сходны между собой и свидетельствуют, что белки не обладают жесткой пространственной структурой. Отсутствие выраженных пиков плавления у искусственных белков подтверждает, что они находятся в состоянии, близком к состоянию расплавленной глобулы (48). Глава 3. Предфибриллярное, или промежуточное состояние белка. Состояние расплавленной глобулы заслуживает особого внимания при исследовании стадий сворачивания белка, предшествующих амилвидообразованию. Во время приобретения нативной структуры белок претерпевает ряд преобразований, при которых его структура обладает нежесткой конформацией, по физическим параметрам близкой к состоянию расплавленной глобулы. В этом состоянии молекула наиболее пластична и доступна для различных трансформаций, которые при определенных условиях или мутационных изменениях могут привести к фибриллообразованию. Для многих белков, образующих фибриллы, было показано наличие промежуточного предфибриллярного состояния молекулы, близкого к состоянию расплавленной глобулы.
Исследование цитотоксичности предфибриллярных образований
Работы последних лет показали, что амилоидные образования различных белков вызывают нарушение работы клеток и их гибель. Как оказалось, цитотоксические свойства проявляют не только белки, участвующие в патогенезе амилоидных заболеваний, но и белки, не формирующие фибриллы in vivo (92), например, апомиоглобин (93) и HypF-Af белок Е. col і. (94). Предполагается, что амилоидные олигомеры белков, не связанных с заболеваниями, проявляют общий механизм цитотоксического действия (94). Многими авторами было показано, что наибольшим цитотоксическим эффектом обладают структуры, характерные для ранних стадий фибриллогенеза. Фибриллогенез любого белка начинается с формирования предфибриллярных сферообразных структур, в состав которых может входить от 15 до 40 мономеров, в зависимости от природы белка. Округлые олигомеры способны объединятся в цепевидные структуры, замыкающиеся в кольцо и/или продолжающие рост в длину. Если не происходит замыкания в кольцо, то удлиняющиеся цепи олигомеров формируют протофибриллы, которые затем объединяются в зрелые фибриллы (95). Все больше научных работ свидетельствует о том, что ранние амилоидные образования, такие как первичные олигомеры, кольца и протофибриллы, являются наиболее опасными для жизнедеятельности клеток. Современные представления о фибриллогенезе позволяют говорить об общих чертах механизма этого процесса в белках различной природы, независимо от того, имеют ли они отношение к патогенезу амилоидных заболеваний или нет. Для амилоидогенеза различных белков характерны как общие черты развития фибрилл, сходные структурные характеристики амилоидов, так и наличие цитотоксичного эффекта определенных стадий процесса. Вероятно, существует и общность механизма цитотоксичного действия амилоидных образований различных белков. Однако вопрос о причинах, вызывающих дегенерацию клеток, до сих пор остается открытым, поскольку нет строгих доказательств того, чем обусловлена цитотоксичность различных белков - механическим повреждением клеток в результате накопления амилоидных отложений или особым молекулярным механизмом взаимодействия. Сходные данные по токсичности амилоидных структур были получены для многих белков. Так, для лошадиного лизоцима было показано, что растворимые амилоидные ол игом еры на ранней стадии фибрилл огенеза токсичны в большей степени для культур первичных нейрональных клеток и первичных фибробластов и в меньшей степени для культуры фибробластомы IMR-32 (96). Выживаемость клеток коррелировала с размерами олигомеров - 20ти-меры оказались более токсичными, чем тетра- и октамеры. Амилоидные олигомеры лошадиного лизоцима, как и других амилоид образующих белков, способны формировать кольца, однако, прямой связи между количеством колец и степенью цитотоксичности обнаружено не было.
Растворимые амилоидные олигомеры лизоцима вызывали гибель трех исследованных клеточных культур, при этом зрелые фибриллы, сформированные в тех же условиях, не оказывали цитотоксичного действия. Авторы предполагают, что предфибриллярные образования лизоцима могут вызывать разрушение мембран при их встраивании в липидный бислой. Данные о цитотоксичности амилоидных олигомеров и отсутствие таковой у зрелых фибрилл совпадают для многих белков (97-100). Две известные патогенные мутации а-синуклеина повышают его способность к агрегации, а также усиливают сродство к мембранам. При этом одна из мутаций - АЗОР - стимулирует образование колец скорее, чем фибрилл (95). Способность а-синуклеина связываться с мембранами, также как и цитотоксичность, увеличивается при образовании амилоидных олигомеров или кольцеобразных структур. Поэтому авторы полагают, что способность проникать в мембрану и цитотоксичность обусловлены деятельностью кольцеобразных или порообразующих амилоидов и что амилоидные белки работают подобно бактериальным порообразующим токсинам, увеличивая проницаемость мембран и вызывая тем самым дисфункцию и смерть нейрональных клеток (95). Одна из теорий нейрональной дегенерации при болезнях Альцгеймера и Паркинсона связывает проникающую способность предфибриллярных образований с включением апоптозного механизма клетки (101). При развитии болезни Альцгеймера амилоидные предшественники концентрируются в эндоплазматическом ретикулуме и вне клетки, а при болезни Паркинсона а-синуклеин накапливается в аксонах и синапсах нейрональных клеток. Накопление нетоксичных мономеров до определенной концентрации приводит в конечном счете к формированию токсичных олигомеров и протофибрилл. В случае образования телец Леви этот процесс усугубляется тем, что Ар-пептид способен провоцировать накопление а-синуклеина. Оба белка вызывают разрушение митохондриальных и цитоплазматических мембран путем транслокации через них или встраивания в них предфибриллярных образований. Накопление олигомеров в митохондриальных мембранах, приводящих к появлению пор, может вызывать высвобождение цитохрома-с с последующей активацией апоптозного каскада. Апоптозный каскад ведет к увеличению проводимости мембран и дальнейшему высвобождению цитохрома-с, что, в свою очередь, вызывает олигомеризацию Ар-пептида и а-синуклеина (101). Таким образом, транслокация через митохондриальную мембрану неправильно свернутых белков может быть причиной гибели клеток через апоптозный механизм с участием цитохрома-с. Эксперименты in vivo показали, что формирование зрелых фибрилл не всегда коррелирует с симптомами болезни, поэтому, вероятно, в патогенезе участвуют именно предфибриллярные цитотоксичные формы а-синуклеина и Аї-пептида (102).
Было показано, что именно предфибриллярные структуры вызывают иммунный ответ в сыворотке при болезни Альцгеймера. При этом на ранних стадиях болезни иммунный ответ менее специфичен, что отражается в повышении уровня антител не только на протофибриллы Ар-пептида, но и на предфибриллярные структуры человеческого лизоцима (4). Авторы считают, что на ранних стадиях заболевания включается естественная защитная система организма, предотвращающая амилоидную олигомеризацию любого белка, в том числе лизоцима, а на более поздних стадиях, проявляется специфичный иммунный ответ на олигомерные образования Ар-пептида. Полученные результаты свидетельствуют о постоянном присутствии ранних амилоидных образований белка в ходе течения болезни Альцгеймера. В то время как цитотоксичное действие оказывают в основном амилоидные олигомеры и/или другие ранние стадии амилоидогенеза (94), зрелые фибриллы инертны, но могут вызывать механические повреждения в органах и тканях (103). Остается открытым вопрос, зависит ли токсичность амилоидов от аминокислотной последовательности белка и его происхождения или она определяется конформацией амилоидных формирований. Поскольку искусственный белок альбебетин был выбран нами как модель для фибриллогенеза, характерного для природных белков, нами был поставлен вопрос, проявляют ли токсичность, свойственную амилоидам природных белков, амилоиды ABB. Мы полагаем, что исследование токсичности амилоидных структур ABB имеет значение для понимания общих черт механизма и причин токсичности амилоидных образований. В связи с растущей численностью страдающих амилоидными болезнями, исследование молекулярных основ фибриллообразования, причин и механизмов цитотоксичного эффекта ранних стадий фибриллогенеза, а также развитие на этой основе диагностических методов, терапевтических и хирургических методов лечения и предупреждения этих болезней является актуальной задачей настоящего времени.
Методы исследований амнлоидообразования искусственных белков
Для сравнительного анализа фибриллообразования искусственные белки инкубировали в концентрации 20 мг/мл в 20 мМ бис-трис буфере, 0.2% NaN3, рН 7.3 при комнатной температуре и при нагревании до 57С в течение 7-8 суток. Гексапептид HLDF-6 инкубировали в тех же условиях в течение 4-х недель в концентрации 20 мг/мл (ЗОмМ). Концентрационную зависимость амилоидообразования ABB исследовали при 57С в течение 7-8 суток (20 мМ HEPES буфер, рП 7.5, 0.2% NaN3) Для экспериментов по исследованию цитотоксичности амилоидных образований ABB, белок инкубировали при 57С в концентрации 10 мг/мл (20 мМ HEPES буфер, рН 7.5,0.2% NaN3). 3.3.1 Метод флуоресцентного анализа. Исследование кинетики амилоидообразования было проведено с использованием классического флуоресцентного красителя амилоидных структур, тиофлавина-Т (111) Измерение флуоресценции проводили в растворе красителя, содержащем 10 мкМ белка. В работе был использован спектрофлуориметр FluoroMax-2 (JOBIN YVON/PSEX Instruments S.A., US). Длина волны возбуждения тиофлавина-Т составляла 440 нм. Спектр флуоресценции был записан в интервале длин волн от 450 до 550 нм, при ширине световых щелей 5 нм. 3.3.2. Метод атомно-силовой микроскопии. Измерения морфологических параметров амилоидных структур проводили методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Работа была выполнена на атомно-силовом микроскопе PICO PLUS (Molecular Imaging, US) и наноскопе Ilia Multi-Mode microscopes (Digital Instruments, US) с использованием акустически высушенных кантиливеров с радиусом кривизны менее 10 нм (Atomic Force, Germany). Перед получением изображения сканируемую поверхность калибровали в плоскости ху с помощью калибровочной решетки стандартных размеров (1 мкм) и в плоскости z с использованием высокоориентированной пиролитической поверхности графита. Частота сканирования составляла от 1 до 3 кГц в зависимости от размера сканируемой области и разрешения (256 или 512 точек). Одновременно получали высотное, амплитудное и фазовое изображения. Во избежание артефактов, сканирование образца производилось при прямом и обратном ходе сканирующего зонда. С помощью программного обеспечения были сняты параметры фибриллярных структур, полученные на высотном изображении. Точность измерений фибриллярных структур достигалась путем проведения множественных поперечных сечений каждого объекта (112). Точность полученных параметров подтверждали также путем измерения амилоидов не только после испарения жидкости на сухом образце, но и в растворе.
Для сравнения контрольные измерения проводили на двух подложках - слюде и графите, чтобы исключить возможное влияние поверхности подложки на размеры и форму амилоидных структур. Общий вид, размеры и форма ол игом еров и фибрилл были одинаковы в разных условиях. Для получения в растворе той же плотности структур, что и на сухом препарате, необходимо было увеличить время осаждения до 30-40 минут, поскольку высокий отрицательный заряд ABB вызывает электростатическое отталкивание между белком и поверхностью слюды. Присутствие 100 мМ хлорида натрия в образце увеличивало скорость осаждения амилоидных структур и позволяло сократить время выдержки до 3 минут. На поверхности графита плотность популяции фибриллярных образований была очень бедна даже после сорокаминутной выдержки раствора. Во избежание артефактов и для уменьшения времени выдержки дальнейшие измерения проводили на сухой поверхности свежего скола слюды. Для микроскопического анализа растворы белков разводили от 200 до 1000 раз до конечной концентрации от 20 до 100 мкг/мл, соответственно. При измерении биологических объектов методом АСМ обычно наблюдается увеличение их размеров в плоскости ху, что объясняется действием сил адсорбции на мультимерные комплексы белков, которые вызывают их налипание на поверхность слюды и некоторое горизонтальное растяжение, а также геометрическими особенностями сканирующего зонда. Деконволюционный модуль кантиливеров, используемый в программе Scanning Probe Processor (SPIP) (Image Metrology, Denmark) позволил провести сравнительный анализ измерений с использованием эталонных образцов, таких как углеродные нанотрубки с известным диаметром (1 нм), сферические латексные частицы с диаметром 1.5 нм и отдельные молекулы лошадиного лизоцима. Обработка изображений АСМ с использованием деконволюционного кантиливерного модуля SP1P выявила отсутствие топологических артефактов, которые могли быть вызваны геометрическими особенностями сканирующих зондов. Расчеты, проведенные на эталонных образцах, подтвердили предположение, что ошибка измерений горизонтальных параметров компенсируется путем определения диаметра в половинной высоте белковых структур. Высота каждого амилоидного олигомера, как и диаметр на уровне половинной высоты, были многократно измерены и определены как сферические образования. С помощью уравнения (1) был подсчитан молекулярный объем олигомеров: УАсм Оп/бХЗ + Ь2), (1) где h - высота частицы, а г - ее радиус, измеренный на уровне половины высоты. Объем, занимаемый одной молекулой мономерного белка, был вычислен из следующего уравнения: Vm = (M /N0)(V1+dV2), (2) где Мо - молекулярная масса белка, N0 - число Авогадро, d -коэффициент гидратации белка (0.4 мол НгО/мол. белка), а V] и V2 удельные объемы белка (0.74 см г" ) и воды (1 CMV), соответственно. Объемы молекул ABB, ABBI и ABB-df были вычислены из уравнения (2) и составили 14.8, 16.7 и 16.1 нм , соответственно. Количество мономеров, входящих в состав олигомерных частиц, было определено по следующей формуле: n = VACM/Vm (3) 3.3.3. Метод кругового дихроизма. Спектры КД были измерены на спектрополяриметре Jasco J 720 CD UV, снабженном термостатированной ячейкой, для этого использовали кварцевые кюветы со световым путем 0.01 см (Hellma). Спектры КД в дальней УФ области (190-250 нм) были измерены в температурном диапазоне от 20 до 80С с шагом 3-5С. Перед измерением образцы инкубировали 10 мин при каждом значении температуры для достижения термического равновесия. 3.3.4. Методы исследования цитотоксичной активности амилоидных структур ABB.
Цитотоксичность амилоидных структур ABB исследовали на культурах клеток HL-60 промиелоцитарного лейкоза человека, нейробластомы IMR-32, а также на культуре гранулярных нейронов мозжечка 8-дневных крысят (Wistar). К культурам клеток добавляли пробы, содержащие амилоидные структуры ABB на разных этапах амилоидогенеза: после б, 24, 36, 48 и 72-96 часов инкубации, соответствующие формированию первичных олигомеров, колец и цепей (6-24 ч), амилоидных олигомеров (24-36 ч), протофибрилл и фибрилл, соответственно. Культуры клеток инкубировали в присутствии искусственного белка во влажной атмосфере воздуха с 5 % СОг при 37С. Клетки линии HL-60 и гранулярные нейроны мозжечка 8-дневных крысят выдерживали в присутствии амилоидных структур ABB в течение 16 часов при концентрации белка 5 и 25 мкМ и 5, 25 и 50 мкМ, соответственно. Для сравнения выживаемости клеток в присутствии нативного белка и в присутствии амилоидных структур к образцам добавляли только что растворенный белок в соответствующих концентрациях. Выживаемость культуры клеток HL-60 определяли по изменению метаболических процессов и целостности мембран методом МТТ теста (113). МТТ тест — широко используемый колориметрический метод определения клеточной чувствительности, основанный на способности митохондриальной сукцинил дегидрогеназы живых клеток преобразовывать желтый субстрат - соль тетразолия МТТ (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил тетразолиум бромид) - в темно-синий продукт — формазан. При добавлении в среду культивирования клеток бледно-желтого МТТ-тетразолиума в активных митохондриях клеток под действием ферментов происходит процесс восстановления его до темно-синих кристаллов. 5 106 клеток инкубировали в течение 16 часов в присутствии образцов ABB. По завершению инкубации среду заменяли на новую RPMI 1640, содержащую 0.5 мг/мл МТТ-реагента. После этого клетки дополнительно инкубировали 3 часа при 37С. Затем среду отбирали и образовавшиеся кристаллы фор мазана растворяли 0.04 Н НС1 в изопропиловом спирте. Оптическое поглощение измеряли через 15 минут после полного растворения кристаллов на приборе Multiskan МССЛ340 ("Labsystem", Финляндия) на длине волны 540 нм.
Модель фибриллогенеза искусственных белков. Полиморфизм амилоидных структур и пути их олигомеризации
Биоинженерные методы в сочетании с компьютерным дизайном очень продуктивны для создания моделей сворачивания белков. Однако упрощенные модели, такие как модель фибриллообразования короткими пептидами (118), не вполне отражают сложный баланс электростатических и гидрофобных взаимодействий в молекуле белка в этом процессе. Искусственный белок ABB является более сложной моделью, лучше отражающей взаимодействия в молекуле белка и природные процессы агрегации. Так как его свойства и структура хорошо изучены, то тем самым предоставляется возможность для теоретических и практических исследований сложных принципов амилоидообразования, присущих природным белкам. Визуальное наблюдение процесса фибриллообразования выбранных белков было проведено с использованием атомно-силового микроскопа (АСМ) PICO PLUS (Molecular Imaging, US). Инкубацию белков проводили в 20 мМ бис-трис буфере, рН 7.3, при 57С, а также при комнатной температуре. Первоначальная ассоциация молекул белков de novo приводила к формированию первичных (малых) олигомеров (рис. 6а). На изображении АСМ они выглядели как распластанные структуры из-за их налипания на поверхность подложки, в результате чего их горизонтальные размеры заметно превышали вертикальные. Высота олигомеров в плоскости z, измеренная в поперечном сечении, составляла в среднем 1.2 ± 0.3 нм, а горизонтальные параметры в плоскости ху, на уровне половины высоты олигомеров, составляли 18 ± 3 нм. По формулам 1-3 (Материалы и Методы) было подсчитано, что первичные округлые олигомеры искусственных белков включают в себя 8-10 мономерных молекул. Первичные олигомеры с течением времени объединялись в короткие цепочки (2-6 олигомера), наподобие бусин на нитке (рис. 66). Цепочки могли замыкаться в кольца, состоящие из 4-5 первичных олигомеров (рис. 6в). Высота колец соответствовала высоте слагающих их олигомеров, а диаметр составлял 45±10 нм. Он был измерен между двумя противостоящими олигомерами, имеющими максимальную высоту. Образование кольцеобразных структур наблюдалось на различных подложках — как на графите, так и на слюде, и при высоком разведении образца перед нанесением на подложку (в 10 000 раз), что подтверждает их формирование во время инкубации, а не в результате экспозиции образца. В растворе ABB формирование первичных олигомеров, коротких цепей и колец соответствовало лаг-периоду длительностью 24 часа, при котором не происходило увеличения флуоресценции амилоидного красителя. В отличие от подобных структур других белков, кольца и цепи ABB не связывали амилоидный краситель тиофлавин-Т.
Начало роста флуоресценции амилоидного красителя тиофлавина-Т (рис. За) соответствовало формированию более крупных олигомеров, состоящих из 26-30 молекул белка (количество мономеров было рассчитано по формулам 1-3). Их высота в плоскости z была 2.0 ± 0.3 нм, а горизонтальные размеры в плоскости ху на уровне половины высоты составили 25±5 нм. Амилоидные олигомеры ABB (рис. 66), характеризующиеся такими параметрами, появлялись спустя сутки, а амилоидные олигомеры производных ABB формировались с момента начала инкубации. В отличие от первичных олигомеров высотой 1,2 нм, амилоидные олигомеры высотой 2 нм связывали тиофлавин-Т и проявили способность к объединению в протофибриллярные нити (рис. 66, г; 7а). Длина протофибрилл составляла от 100 до 500 нм, а высота в плоскости z 2 ± 0.3 нм. Вдоль главной оси протофибриллы можно было наблюдать несколько повторяющихся элементов (минимально два) длиной в 20-40 нм (рис. 6г, д). На рисунке показано продольное сечение протофибриллы ABB с периодичностью повторений 40 нм. Протофибриллы ABB появлялись на вторые сутки инкубации, и их концентрация возрастала со временем, а протофибриллы производных белков появлялись уже в течение первых часов инкубации (рис. 7а). В образцах производных белков происходил быстрый рост и объединение протофибрилл путем их перекручивания (рис. 7в). Искусственные белки альбебетинового ряда проявили значительное морфологическое разнообразие амилоидных структур, характерное для амилоидобразующих белков, вызывающих болезни человека. ABBI и ABB-df образовывали фибриллярные структуры различные по длине (от 500 нм до нескольких микрон), высоте (от 2 до 12 нм) и по периодичности скручивания (от 20 до 70 нм) (рис. 66, 76, в). Высота фибрилл определялась количеством составляющих ее протофибрилл, а колебания высоты продольного сечения одной фибриллы были обусловлены тем, что протофибриллы скручивались вокруг главной длинной оси (рис, 7в). Периодичность скручивания изменялась в зависимости от количества протофибрилл, составляющих фибриллу. Так, шаг спирали увеличивался от 20 до 40 и 70 нм при изменении высоты фибрилл от 2 до 5 и до 12 нм, соответственно. Присутствие в растворе ABB свободного гексапептида HLDF-6, добавленного в эквимолярном соотношении, как и увеличение ионной силы раствора, вызывало не только ускорение фибрилл ore неза, но и приводило к усложнению морфологической организации фибрилл (рис. 6ж, з). Сеть амилоидов ABB, сформированная в присутствие гексапептида, была не отличимой от сети зрелых фибрилл производных (рис. бз). Присутствие гексапептида или высокой концентрации соли в растворах производных белков не оказывало заметного влияния на морфологию амилоидных структур.
При температуре 25С не происходило фибриллообразования ABB (рис.6 е). В образце формировались первичные олигомеры (1.2 нм высотой), которые существовали в растворе до четвертого дня инкубации. При дальнейшем инкубировании они объединялись в крупные гранулярные агрегаты, высота которых составляла 4 нм и более (рис. бе). Крупные агрегаты ABB, не обладающие амилоидной структурой и не связывающие тиофлавин-Т, сохранялись в течение 24-х дней инкубации. В растворах производных белков наблюдались все вышеописанные этапы фибриллогенеза, но скорость их полимеризации была гораздо ниже, чем при 57С. Первичные олигомеры преобладали в течение четырех дней, а затем развивались амилоидные олигомеры и протофибриллы. Зрелые фибриллы ABBI и ABB-df, сформированные при 25 и 57С морфологически не отличались. Общий вид фибриллярной сети, образованной ими при комнатной температуре, практически не менялся в течение последующих 24-х дней инкубации. Таким образом, ABB не образовывал амилоидных структур при комнатной температуре, в то время как фибриллогенез производных белков происходил, но медленнее, чем при 57С. До сих пор остается открытым вопрос о механизме цитотоксичности, присущей структурам ранних стадний амилоидообразования и характерной для белков различного происхождения и функций. В литературе имеются предположения о наличии общего механизма цитотоксичного действия амилоидов (94) и считается, что причина токсичности не в аминокислотной последовательности и структуре нативной молекулы, а в структуре амилоидных олигомеров и протофибрилл, имеющих сходство у многих белков. Проверку этой гипотезы, а также поиск механизма токсичности амилоидных формирований на ранних стадиях фибрилл огенеза, может обеспечить дальнейшее исследование искусственных белков, поскольку ABB и его производные, созданные de novo, способны формировать классические амилоиды. Небольшой и хорошо изученный белок ABB был использован нами как модель формирования амилоидной структуры, и, в то же время, он может быть использован также в качестве модели для поиска механизма взаимодействия амилоидов с клеточными структурами. Для исследования цитотоксичности ABB инкубировали при концентрации 10 мг/мл при температуре 57С (20 мМ HEPES буфер, рН 7.5.) Пробы ABB, инкубированные в течение 6 часов (первичные олигомеры), 24 часов (амилоидные олигомеры), 36 часов (протофибриллы) и 4-х дней (фибриллы), были добавлены к культурам раковых клеток промиелоцитарного лейкоза человека HL-60 и нейробластомы IMR-2, а также к культуре гранулярных нейронов мозжечка 8-дневных крысят (Wistar). Уровень выживаемости раковых клеток HL-60 и гранулярных нейронов в присутствии амилоидных структур определяли с помощью МТТ теста. Уровень выживаемости клеток нейробластомы IMR-2 оценивали по флуоресценции этидиума бромида -классического красителя ДНК.
