Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 9
1.1. Ненативные состояния белков в живой клетке 9
1.2. Заряженная поверхность мембраны как денатурирующий агент in vivo 12
1.3. Белки и мембраны. Возможные пути взаимодействия 14
1.4. Водно-спиртовые смеси как модель влияния поля мембраны на структуру белков 22
1.5. Пространственная структура и функции миоглобина 23
1.6. Структура и свойства цитохрома b5 26
1.7. Краткая характеристика структуры а-лактальбумина 29
1.8. Заключение 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 31
2.1. Приготовление растворов 31
2.2. Методы исследования третичной структуры
2.2.1. Абсорбционная спектроскопия 34
2.2.2. Флуоресцентная спектроскопия 35
2.2.3. Круговой дихроизм в ближней УФ области 36
2.2.4. Спектроскопия ЯМР высокого разрешения 37
2.2.5. Сканирующая микрокалориметрия 39
2.3. Методы изучения вторичной структуры
2.3.1. Круговой дихроизм в дальней УФ области 40
2.4. Методы исследования взаимодействия белков с мембраной
2.4.1. Высокоэффективная жидкостная гель-хроматография 41
2.4.2. Макроскопическая диффузия 41
2.4.3. Ограниченный протеолиз 42
ГЛАВА 3. Исследование миоглобина 44
3.1. Фосфолипидные везикулы вызывают нарушение третичной структуры миоглобина 45
3.2. Вторичная структура миоглобина в присутствии фосфолипидных везикул сохраняется 56
3.3. Денатурация миоглобина, вызываемая фосфолипидными везикулами, приводит к взаимодействию белка с их поверхностью.. 60
3.4. Стабильность миоглобина в присутствии фосфолипидных везикул.. 68
3.5. Фосфолипидные везикулы облегчают автоокисление оксимиоглобина 74
ГЛАВА 4. Изучение водорастворимого фрагмента цитохрома 77
4.1. Особенности нарушения нативных взаимодействий в третичной структуре цитохрома bj в присутствии фосфолипидных везикул 77
4.2. Сохранение вторичной структуры цитохрома bs в присутствии фосфолипидных везикул 88
4.3. Взаимодействие цитохрома Ь5 с фосфолипидными везикулами 90
4.4. Денатурирующее действие везикул из смеси фосфолипидов на цитохром эффективнее, чем из ненасыщенных отрицательно заряженных фосфолипидов 93
ГЛАВА 5. Сопоставление конформационного состояния различных белков в присутствии везикул и в водно-спиртовых смесях 96
5.1. Конформационные изменения а-лактальбумина в присутствии фосфолипидных везикул 96
5.2. Сопоставление структурных особенностей различных белков в присутствии фосфолипидных везикул 100
5.3. Сравнительная оценка конформационного состояния различных белков в присутствии фосфолипидных везикул и в водно-спиртовых смесях 103
Заключение 109
Выводы 112
Список литературы 113
- Заряженная поверхность мембраны как денатурирующий агент in vivo
- Вторичная структура миоглобина в присутствии фосфолипидных везикул сохраняется
- Сохранение вторичной структуры цитохрома bs в присутствии фосфолипидных везикул
- Сопоставление структурных особенностей различных белков в присутствии фосфолипидных везикул
Введение к работе
Актуальность проблемы. В последние годы генетические заболевания человека, связанные с дефектами в сворачивании белков или их агрегацией, привлекают пристальное внимание ученых. Было показано, что в эти процессы вовлекаются промежуточные состояния различных белков, не имеющих жесткой нативной структуры и способных адаптироваться к различным условиям в клетке. Поэтому, выяснение причин, приводящих к возникновению ненативных промежуточных состояний белков в клетке, является своевременным и актуальным на современном этапе. Изучение условий, приводящих к конформационным изменениям в белках, может помочь в поиске решения для устранения дефектов в сворачивании белков и образования агрегатов. Сюда же примыкают и проблемы выяснения механизмов белок-белковых взаимодействий, транслокации белков через мембраны, деградации белков в лизосомах, обмена лигандами (см. обзор Bychkova & Ptitsyn, 1993). Ранее нами было предположено, что наряду с такими естественными денатурирующими факторами, как пониженное рН в ряде органелл и возникновение тепловых, солевых и других стрессов, отрицательно заряженная мембранная поверхность может служить умеренно денатурирующим агентом в клетке, благодаря усилению электростатических взаимодействий на границе раздела водной и неполярной фаз. Представляемая работа посвящена выяснению особенностей воздействия отрицательно заряженной мембранной поверхности на конформационное состояние белков, функционирующих в ее непосредственной близости. Проведено изучение структурных изменений, которые могут произойти с нативными белками, имеющими различный суммарный заряд, вблизи мембраны при нейтральных значениях рН. Ранее были опубликованы работы по исследованию взаимодействия белков с мембранами, но в условиях, когда белки уже находились в промежуточном состоянии типа расплавленной глобулы или при функционировании должны с ней связываться.
Цель и задачи исследования. Основной целью исследования является изучение влияния отрицательно заряженной мембраны на конформационное состояние глобулярных белков при нейтральных значениях рН. В задачи исследования входило:
охарактеризовать третичную и вторичную структуру слабо положительно заряженных апо- и холомиоглобинов и отрицательно заряженного водорастворимого фрагмента цитохрома Ь3 в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул;
изучить взаимодействие с мембраной белков, имеющих различный суммарный заряд;
сравнить структурные изменения белков в присутствии фосфолипидных везикул и в условиях, моделирующих ближайшее окружение мембраны (в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН).
Научная новизна работы. Впервые проведено исследование влияния отрицательно заряженной мембранной поверхности на конформационное состояние водорастворимых глобулярных белков при нейтральных рН. При нейтральных рН раствора в отсутствие мембран все исследованные белки имеют нативную конформацию с жесткой третичной структурой. Показано, что в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул слабо положительно заряженные холо- и апомиоглобины, а также отрицательно заряженный водорастворимый домен цитохрома Ь5 даже при нейтральных рН претерпевают переход из нативного состояния в промежуточное, которое имеет свойства, сходные с расплавленной глобулой, описанной для различных белков в водных условиях, но не идентично ему. Полученное нами промежуточное состояние характеризуется отсутствием жесткой третичной структуры при сохранении ярко выраженной вторичной структуры. Для разрушения третичной структуры каждого исследуемого белка требуется определенная концентрация фосфолипидов, зависящая от суммарного заряда и структурной организации белка. В промежуточном
состоянии, возникающем под влиянием мембранной поверхности, все исследованные белки связываются с мембраной благодаря электростатическим и гидрофобным взаимодействиям. Флуктуирующая структура белков в непосредственной близости от мембранной поверхности может быть необходима для выполнения их функции. В случае миоглобина это может способствовать более легкому отщеплению кислорода и обмену с другими лигандами, а в случае водорастворимого фрагмента цитохрома Ь5 -облегчению его взаимодействия с белками-партнерами при переносе электрона.
Сопоставление конформационного поведения белков в присутствии мембран и в модельных условиях показало, что основные черты воздействия мембранной поверхности на белки хорошо воспроизводятся в водно-спиртовых смесях при умеренно низких значениях рН. Это подтверждает гипотезу о способе воздействия мембран на белки, связанную с усилением электростатических взаимодействий вблизи ее поверхности.
Диссертационная работа состоит из "Введения", пяти глав, "Заключения", "Выводов" и "Списка литературы". Во "Введении" представлено описание актуальности изучаемой проблемы и цели исследования, а также отражена научная новизна работы. Глава 1 посвящена описанию и анализу литературных данных, отражающих современное положение исследований ненативных состояний белка в клетке и полученных в модельных системах. В главе 2 описаны материалы и методы, используемые в данной работе. В главе 3 представлено экспериментальное исследование структурных свойств апо- и холомиоглобинов в присутствии фосфолипидных везикул. В главе 4 описано конформационное поведение водорастворимого фрагмента цитохрома Ъ$ в присутствии фосфолипидных везикул. В главе 5 представлены структурные данные, полученные для человеческого а-лактальбумина, а также проводится сравнительное описание конформационного состояния различных белков в присутствии везикул и в водно-спиртовых смесях. Раздел "Заключение" содержит основные итоги
работы. В конце диссертации приведены основные выводы данной работы и список Цитируемой литературы в алфавитном порядке.
Основные результаты данной диссертационной работы отражены в 16 публикациях, в том числе в 3 статьях в рецензируемых отечественных и международных научных журналах.
Заряженная поверхность мембраны как денатурирующий агент in vivo
По мере накопления знаний о ненативных состояниях различных белков как в клетке, так и in vitro, возник вопрос, что может служить денатурирующим агентом в клетке, где нет экстремальных денатурирующих условий. Поэтому, больший интерес представляет анализ ситуаций, когда белок, изначально имевший нативную структуру, трансформируется под действием каких-либо внутренних факторов в клетке в денатурированное состояние. Некоторые условия в клетке, такие как умеренно низкие рН (4.5-5.0) в лизосомах или около отрицательно заряженных мембранных поверхностей, наличие мембран и цитоскелета, являются умеренно-денатурирующими условиями для белков.
В работах группы Шатца было показано, что частичное разворачивание белка на поверхности мембраны может иметь физиологическое значение. Они показали, что частичное разворачивание белка обусловленоотрицательными зарядами на поверхности мембраны (Endo & Schatz, 1988; Eilers et al, 1989; Endo et al, 1989). В самом деле, еще в 1979 году было обнаружено (Eisenberg et al, 1979), что мембранная поверхность с сильным электростатическим потенциалом может притягивать протоны, приводя к локальному понижению рН по крайней мере на 2 единицы на расстоянии 5-15 А ОТ поверхности мембраны в соответствии с простой электростатической теорией. Именно низкие значения рН in vitro дают возможность получить состояние расплавленной глобулы для многих белков (Ptitsyn, 1987, 1992, 1995). Поэтому, вероятно, мембрана не только нуждается в состоянии расплавленной глобулы для транслокации белков, но и сама способствует переходу в это состояние своей собственной отрицательно заряженной поверхностью. Значение рН около мембраны митохондрий может понижаться также за счет выброса протонов, выделяемых дыхательной системой в межмембранное пространство, через поры внешней мембраны (Скулачев, 1989). Однако такого понижения рН (порядка 2 единиц рН) обычно недостаточно для кислой денатурации белка. В связи с этим было выдвинуто предположение (Bychkova & Ptitsyn, 1993) о дополнительном денатурирующем воздействии поверхности мембраны - локальном понижении эффективной диэлектрической проницаемости вблизи мембранной поверхности, что может усиливать электростатические взаимодействия, помогая локально низким рН трансформировать белки в состояние расплавленной глобулы. Расчеты показывают (Ландау и Лифшиц, 1982), что по мере приближения к границе раздела двух сред (например, водной и органической) значение эффективной диэлектрической проницаемости в водной среде уменьшается, достигая в предельном случае величины почти вдвое меньшей, чем диэлектрическая проницаемость воды вдали от границы раздела. На рис. 1.1 представлено схематичное изображение поверхности отрицательно заряженной мембраны. Действительно, величина диэлектрической проницаемости водного окружения белковой молекулы постоянна и равна —80 при 20С, но в случаях, когда возникают сильные электростатические потенциалы или локальные высокие концентрации сольватированных ионов, она может меняться. Таким образом, необходимо принимать во внимание зависимость диэлектрической проницаемости среды от расстояния вблизи заряженной гидрофобной поверхности. Были проведены теоретические оценки такой зависимости и получены экспериментальные данные при помощи флуоресцентных зондов чувствительных к полярности окружения, которые свидетельствуют о том, что диэлектрическая проницаемость среды вблизи заряженной гидрофобной поверхности значительно ниже диэлектрической проницаемости воды в среде и может составлять 30-50.данный физиологический процесс вовлечено ненативное состояние белка, появилось в работах группы Шатца, посвященных изучению транслокации белков, ренатурированных из растворов сильного денатуранта (Eilers & Schatz, 1988; Vestweber & Schatz, 1988; Glick & Schatz, 1991). Было показано, что эти ренатурированные белки транслоцируются быстрее и намного эффективнее нативных предшественников белков и не ингибируются ни низкой температурой, ни специфическими лигандами, но теряют эту способность при инкубации без мембран в течение длительного времени.
В работах этой же группы (Endo & Schatz, 1988; Endo et al., 1989) было сделано наблюдение, что нативный предшественник, будучи связанным на внешней мембранной поверхности митохондрии, трансформируется в состояние, компетентное к транспорту, которое может быть сходным с промежуточным состоянием в сворачивании белка. Авторы отметили, что "подобное частичное разворачивание не может не иметь физиологического значения".
Дальнейшие исследования группы Шатца ясно показали, что для транслокации белка ерез мембрану требуется его денатурация.Во-первых, имеются данные о том, что стабилизация белка связыванием лигандов ингибирует транслокацию: метотрексат или другие аналоги фолата, присоединяясь к дигидрофолатредуктазе, стабилизируют ее структуру против протеолиза и не позволяют ей пройти через мембрану (Eilers & Schatz, 1988). Кроме того, дестабилизация этого белка мочевиной, точечными мутациями или связыванием к мембране, резко ускоряет его импорт в митохондрию (Eilers & Schatz, 1988; Endo & Schatz, 1988; Vestweber & Schatz, 1988; Eilers et al, 1988).Было обнаружено, что холобелки или их предшественники, например, цитохромы типа с и Ь, импортируются после биосинтеза в их апоформах, тогда как связывание гема ингибирует транслокацию (Hay et al, 1984); дикий тип апоформы мальтоза-связывающего белка, который чувствителен к протеолизу, экспортируется быстро и эффективно (Randal & Hardy, 1986).
Во-вторых, было показано, что ненативные белки транслоцируются существенно легче. Дигидрофолатредуктаза без С-концевых остатков транслоцируется даже в отсутствие АТФ (Verner & Schatz, 1988).
Вторичная структура миоглобина в присутствии фосфолипидных везикул сохраняется
Круговой дихроизм в дальней УФ области является наиболее удобным методом для характеристики вторичной структуры белка в различных состояниях. Спектры КД в дальней УФ области получены для холомиоглобина в тех же условиях, что и в измерениях флуоресценции (рис. 3.7 д, б). Спектр холомиоглобина в нативном состоянии (/V), который представлен на рисунках для сравнения, имеет типичную для а-спиральных белков форму с двумя выраженными минимумами в области 208 и 220 нм. В присутствии фосфолипидных везикул при молярном соотношении POPG/holoMb 25:1 при рН 7.2 спектр меняется незначительно и по всем параметрам близок к спектру нативного белка, т.е. вторичная структура почти не меняется. При больших молярных концентрациях спектры КД холомиоглобина претерпевают более существенные изменения, при этом абсолютное значение эллиптичности в области 208 нм становится несколько большим, чем таковое на 220 нм. Таким образом, спектры белка в присутствии везикул становятся похожи на спектр белка в промежуточном состоянии (рис. 3.7 я), который, в свою очередь, имеет форму, описанную для состояния расплавленной глобулы ряда белков (Vassilenko & Uversky, 2002). При рН 6.2 (рис. 3.7 б) наблюдается сходное изменение спектров холомиоглобина в присутствии везикул, однако уже при молярном соотношении POPG/holoMb 25:1 минимум на 208 нм становится более выраженным вследствие увеличения абсолютного значения эллиптичности на этой длине волны. При этом значение эллиптичности на длине волны 220 нм близко к его величине для нативного состояния белка. По форме спектры холомиоглобина в присутствии везикул при рН 6.2 похожи на спектры КД в дальней УФ области для этого белка при большой концентрации спирта (Babu & Douglas, 2000). Следует отметить, что для достижения тех же конформационных изменений при рН 6.2, что при рН 7.2, требуется существенно меньшая концентрация фосфолипидов, следовательно, даже столь незначительное понижение рН системы приводит к более эффективной денатурации белка в присутствии везикул. Большие концентрации фосфолипидов при рН 6.2 не приводят к заметным изменениям формы спектра, т.е. вторичная структура, если и меняется, то незначительно (рис. 3.7 б). Но все спектры холомиоглобина, полученные в присутствии везикул, сильно отличаются от спектра белка в полностью развернутом состоянии (С/). Таким образом, спиральная вторичная структура холомиоглобина в присутствии отрицательно заряженной мембраны сохраняется достаточно выраженной, хотя и отличается от характерной для нативного белка, что связано с конформационными перестройками пространственной структуры белка.
Спектры КД апомиоглобина в дальней УФ области получены для молярных соотношений POPG/apoMb 25:1, 100:1 при рН 7.2 и 50:1 при рН 6.2 (рис. 3.8). Для сравнения представлены спектры белка в нативной форме (N) в растворе, в промежуточном состоянии расплавленной глобулы (MG) и в полностью развернутом состоянии (С/)- Спектры апомиоглобина в присутствии везикул при всех молярных соотношениях и обоих значениях рН по форме и значению эллиптичности мало отличаются от спектра нативного белка. Спектр нативного белка имеет сходные минимумы на 220 и 208 нм, а в присутствии везикул минимум на 208 нм незначительно увеличивается по абсолютному значению эллиптичности, т.е. по форме становится похож на спектр белка в состоянии расплавленной глобулы, но еще больше - на спектры белка при больших концентрациях метанола (Kamatari et al., 1999). Однако эти изменения спектров не столь существенны, так как они сильно отличаются от спектра белка в полностью развернутом состоянии в растворе (/) При рН 6.2 для достижения тех же изменений спектра апомиоглобина в присутствии везикул, что при рН 7.2, требуется существенно меньшее количество фосфолипидов. Наличие нативоподобной вторичной структуры косвенно свидетельствует о сохранении достаточной компактности белка в присутствии везикул.
Таким образом, вторичная структура холо- и апоформ миоглобина в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул сохраняет свою спиральную природу, но отличается как от характерной для нативного, так и полностью развернутого состояний белка. Небольшие изменения формы спектров связаны, по-видимому, с конформационными перестройками пространственной структуры белка в этих условиях. Из данных по КД в дальней УФ области также можно сказать, что структурные преобразования в молекуле холомиоглобина намного существеннее, чем в его апоформе.везикулами, приводит к взаимодействию белка с их поверхностью
Анализ результатов, полученных спектральными методами при изучении третичной и вторичной структуры холо- и апоформ миоглобина, показывает, что холомиоглобин в присутствии везикул полностью утрачивает свою жесткую третичную структуру при молярном соотношении POPG/holoMb 200:1 при рН 7.2 и 25:1 при рН 6.2, а апомиоглобин - при POPG/apoMb 25:1 при рН 7.2. Для холомиоглобина при молярных соотношениях POPG/holoMb меньше 200:1 еще заметен вклад молекул белка с нативной структурой. При меньших концентрациях везикул присутствует смесь молекул белка с нативными свойствами и в денатурированном состоянии.
С целью определения локализации ненативных молекул белка при различных молярных концентрациях фосфолипида (везикул) при рН 7.2 и 6.2 были использованы методы высокоэффективной жидкостной гель-хроматографии, макроскопической диффузии и Н-ЯМР высокого разрешения.
Сохранение вторичной структуры цитохрома bs в присутствии фосфолипидных везикул
Спектры кругового дихроизма в дальней УФ области получены для цитохрома Ь3 в тех же условиях, что и в измерениях поглощения и флуоресценции (рис. 4.6). Спектр цитохрома bf в нативном состоянии (7V) (рис. 4.6а, б) имеет один ярко выраженный минимум в области 220 нм и плечо на 208 нм. В состоянии расплавленной глобулы (Басова и др., 2002) при рН 3.0 форма спектра меняется, и плечо на 208 нм превращается в четко выраженный минимум (рис. 4.6а,б). При молярном соотношении POPG/Cyt bs 50:1 при рН 7,2 изменения спектра КД незначительны, и по всем параметрам он похож на спектр белка в нативном состоянии. Спектры цитохрома bs в присутствии больших концентраций фосфолипидов при рН 7.2 по форме становятся похожи на спектр белка в состоянии расплавленной глобулы, при этом они сильно отличаются от спектра белка в полностью развернутом состоянии (/) (рис.4.6 а). Следовательно, при рН 7.2 вторичная структура цитохрома b; в присутствии везикул меняется незначительно, а изменение формы спектров связано с конформационными перестройками молекулы белка. Понижение рН до 5.5 приводит к увеличению абсолютного значения эллиптичности на 220 нм уже при молярном соотношении POPG/Cyt Ьэ 50:1 по сравнению со спектром белка в состоянии расплавленной глобулы, хотя по форме спектры похожи друг на друга (рис. 4.66). Увеличение концентрации везикул приводит к еще большему росту амплитуды спектра. Эти результаты свидетельствуют об увеличении содержания вторичной структуры белка в этих условиях. Аналогичное изменение спектров КД в дальней УФ области наблюдается для этого белка при больших концентрациях метанола (Wang et al., 1999). Такой эффект можно объяснить увеличением стабильности водородной связи внутри полипептидной цепи при попадании белка в более гидрофобное окружение. Можно предположить, что увеличение содержания вторичной структуры происходит вследствие частичного погружения молекулы белка в бислой, где уже сказывается влияние гидрофобной части мембраны. Это согласуется с данными по сканирующей микрокалориметрии. Таким образом, цитохром Ьз в присутствии отрицательно заряженных фосфолипидных везикул, так же как и в состоянии расплавленной глобулы, имеет хорошо выраженную вторичную структуру, которая, однако, отличается от нативной. При рН 5.5 наблюдается увеличение содержания спиральной вторичной структуры, что больше похоже на таковую в присутствии больших концентраций спирта, т.е. в среде с более низкой диэлектрической проницаемостью.
При изучении структуры цитохрома bj в присутствии фосфолипидных везикул спектральными методами показано, что жесткая третичная структура белка нарушается, а вторичная структура сохраняется. Данные по сканирующей микрокалориметрии и КД в дальней УФ области указывают на возможность взаимодействия белка с везикулами. В главе 3 было показано, что миоглобин при нарушении жесткой структуры связывается с везикулами. Используя высокоэффективную гель-хроматографию, была изучена локализация цитохрома Ь3 в присутствии везикул. Известно, что нативный водорастворимый фрагмент этого белка не взаимодействует с мембраной, поэтому связывание с мембраной также косвенно свидетельствует о денатурации белка. На рис. 4.7а представлены профили элюции, полученные для молярных соотношений POPG/Cyt b3 от 50:1 до 500:1 при рН 7.2, и для сравнения приведен профиль элюции цитохрома Ь5 в нативном состоянии (N) без везикул. Отдельно была проведена гель-хроматография свободных везикул, используя длину волны регистрации 226 нм, т.к. на 280 нм они не поглощают. Для белка в присутствии везикул наблюдается два пика поглощения: один - в области выхода нативного белка, другой - в области выхода везикул, в данном случае, в свободном объеме колонки. Появление второго пика может быть характерно как для белка, связанного с везикулами, так и для белка в агрегатах. Возможность небольшой агрегации белка в присутствии везикул исключить нельзя, но наличие агрегатов белка, сопоставимых с размерами везикул исключено, так как это проявилось бы при использовании спектральных методов. При молярном соотношении POPG/Cyt b; 50:1 при рН 7.2 величина поглощения в области выхода нативного белка уменьшается незначительно по сравнению с таковой для нативного белка (на 10%). Кроме этого наблюдается пик в области элюции везикул, но он очень мал по сравнению с пиком в области выхода нативного белка, что свидетельствует о незначительной доле связанного с везикулами белка. В данном случае количество молекул цитохрома Ь5 в растворе не превышает его количество, которое теоретически может связаться с поверхностью везикул, т.е. поверхности везикул достаточно для того, чтобы весь белок мог связаться с мембраной, но этого не происходит. Увеличение молярной концентрации фосфолипидов приводит к уменьшению высоты пика в области элюции нативного цитохрома Ь5, и одновременно наблюдается увеличение площади под пиком в области выхода везикул. соотношении POPG/Cyt Ьз 500:1 (рис. 4.7а), хотя площадь поверхности везикул во много раз больше ( в 20 раз), чем площадь всего белка. Для рН 5.5 профили элюции при молярных соотношениях POPG/Cyt b3 25:1, 100:1 и 200:1 представлены на рис. 4.7 б. Тенденция изменений величины пиков элюции сходна с таковой при рН 7.2, однако полное связывание белка с везикулами происходит при значительно меньшей концентрации фосфолипидов, а именно, при молярном соотношении POPG/Cyt Ьз 200:1. Таким образом, для цитохрома Ь5 также наблюдается взаимодействие с везикулами, однако для этого требуется более высокая молярная концентрация фосфолипидов, чем для холомиоглобина. Дестабилизация белка, вызванная понижением рН до 5.5, приводит к переходу белка из нативного в промежуточное состояние и последующему связыванию при меньшем молярном соотношении POPG/Cyt b5, чем при рН 7.2.
Как известно, в липидном составе биологической мембраны наряду с отрицательно заряженными содержатся и нейтральные фосфолипиды, и, в частности, это справедливо для мембраны эндоплазматического ретикулума. В связи с этим было изучено влияние везикул из смеси (50:50) насыщенных незаряженных (DPPC) и ненасыщенных отрицательно заряженных (POPG) фосфолипидов на конформационное состояние цитохрома bs при рН 7.2, поскольку в клетке он связан с мембраной эндоплазматического ретикулума. Для оценки состояния третичной структуры использовали метод сканирующей микрокалориметрии. Кривые теплопоглощения были получены для цитохрома bs в присутствии смешанных везикул при рН 7.2 при молярных соотношениях DPPC:POPG/Cyt b3 25:1, 50:1, 100:1 (рис. 4.8), а также для везикул в отсутствие белка и для белка без везикул. Плавление
Сопоставление структурных особенностей различных белков в присутствии фосфолипидных везикул
Проведено исследование влияния отрицательно заряженных фосфолипидных везикул на конформационное состояние слабо положительно заряженных холо- и апомиоглобинов, отрицательно заряженного водорастворимого фрагмента цитохрома Ъ$ при нейтральных значениях рН растворов. Кроме этого, были получены экспериментальные данные по структурным переходам цитохрома Ъ$ и бескальциевой формы отрицательно заряженного а-лактальбумина в присутствии везикул из смеси насыщенных незаряженных и ненасыщенных отрицательно заряженных фосфолипидов. Все исследованные белки функционируют вблизи мембраныи не связываются с ней, но могут испытывать ее влияние. Показано, что фосфолипидные везикулы оказывают денатурирующее действие на все эти белки, при этом для них прослеживается общая тенденция структурных изменений, несмотря на различия в пространственных структурах белков. Экспериментально показано, что третичная структура этих белков в присутствии везикул нарушается, в то время как сохраняется регулярная вторичная структура. Такое состояние белков является промежуточным между нативным и полностью развернутым состоянием белков в водном растворе и по свойствам близко к состоянию расплавленной глобулы. Однако полученное промежуточное состояние белка в присутствии мембраны нельзя называть состоянием расплавленной глобулы, наблюдаемом в водных условиях, т.к. все эти белки связываются с везикулами, образуя комплекс, что не позволило нам определить размеры белка доступными методами. Связывание белков с везикулами происходит благодаря электростатическим взаимодействиям, а после проникновения части белка в мембрану подключаются и гидрофобные взаимодействия. Если рассмотреть поведение каждого белка в присутствии везикул отдельно, то обнаруживается ряд особенностей, связанных со структурными характеристиками белка и различием суммарного заряда. Апомиоглобин и бескальциевая форма а-лактальбумина не содержат лигандов, которые стабилизируют белковую молекулу, поэтому их денатурация и связывание с везикулами происходят уже при минимально используемой концентрации фосфолипидов (25:1). При еще меньшей концентрации фосфолипидов (10:1) для апомиоглобина наблюдалась видимая агрегация в системе, что затруднило его изучение. Вторичная структура эти белков в присутствии везикул меняется незначительно. Холомиоглобин и цитохром Ь5 содержат нековалентно связанный гем, что приводит к увеличению стабильности белков, т.е. жесткости третичной структуры при нейтральном значении рН. Однако, несмотря на большую стабильность третичной структуры, добавление отрицательно заряженных везикул при рН 7.2 приводит к увеличениюподвижности боковых групп и, в итоге, к нарушению их плотной упаковки. В данном случае, процессы денатурации и связывания, в отличие от апобелков, происходит ступенчато, т.е., при низких концентрациях фосфолипидов лишь часть молекул белка утрачивает плотную упаковку боковых групп и связывается с везикулами. Постепенно при увеличении концентрации фосфолипидов все большее количество молекул белка денатурирует, пока все белковые молекулы не перейдут в промежуточное состояние и не провзаимодействуют с мембраной. Для миоглобина при рН 7.2 все молекулы полностью связываются с везикулами при молярном соотношении POPG/holoMb 200:1, а для цитохрома Ъ5 - при POPG/Cyt b3 500:1, хотя по теоретическим расчетам в данных системах доступная для связывания площадь поверхности везикул превышает площадь всего белка, особенно это справедливо для цитохрома hs. Можно предположить, что это объясняется разницей в суммарном заряде белка, сильно отрицательного для цитохрома Ьз, что сказывается на его взаимодействии с отрицательно заряженными везикулами. Это подчеркивает важность электростатических взаимодействий при связывании белков с мембранами. Несвязанные с везикулами молекулы миоглобина, которые присутствуют при более низких концентрациях фосфолипидов, находятся в нативном состоянии, которое, однако, становится менее стабильным относительно денатурированных молекул белка, связанных с везикулами. В случае цитохрома hs свободные молекулы белка в присутствии везикул дольше сохраняют нативность третичной структуры, пока столкновения с мембраной не приведут к переходу в промежуточное состояние, компетентное к связыванию. Понижение рН до 6.2 для миоглобина и до 5.5 для цитохрома Ьз облегчает денатурацию и связывание с мембраной благодаря дополнительной дестабилизации нативного состояния, вызванной рН-зависимостью стабильности нативного состояния. Если учитывать локальное понижение рН вблизи мембраны на 2 единицы (Prats et al., 1986), то холомиоглобин попадает в начало своего рН-индуцируемого перехода и не должен претерпевать нарушения третичной структуры, ацитохром bj окажется уже в середине рН-перехода. Тем не менее, кроме локального понижения рН, добавление второго денатурирующего фактора, как понижение диэлектрической проницаемости среды на границе раздела водной и неполярной сред почти в два раза, вызывает усиление электростатических взаимодействий и, как следствие, денатурацию белков, приводящую к образованию промежуточного состояния. Исходя из наших данных, эффективное понижение рН около поверхности заряженных везикул для апомиоглобина составляет порядка 3 единиц рН при используемых нами условиях низкой ионной силы. Зависимость свойств холомиоглобина и цитохрома Ь5 от содержания фосфолипидов напоминает в общих чертах зависимость от рН стабильности этих белков.
