Введение к работе
Актуальность темы. Проблема сворачивания белка, т.е., выяснение того, каким образом формируется нативная конформация белка на основе первичной структуры, признана одной из актуальных в физико-химической биологии. Понимание механизма сворачивания белков необходимо для решения многих фундаментальных и практических задач биологии, медицины и биотехнологии на молекулярном уровне. Важнейшими среди них являются: предсказание и разработка методов предсказания пространственной структуры белков и пептидов, изучение влияния специфических мутационных изменений на структуру белков и активность ферментов, создание мутантных белков со специфическими характеристиками и искусственных белков с заданными свойствами, разработка и создание новых физиологически активных пептидов, изучение механизмов болезней, связанных с неправильным сворачиванием белков, таких как болезни Альцгеймера, Паркинсона, Кройесфельда-Якобса.
Решением этой проблемы интенсивно занимаются во многих научных коллективах мира исходя из двух концепций. Согласно одной из них белки сворачиваются в процессе биосинтеза, по мере выхода полипептидной цепи из рибосомы, котрансляционно (рис.1). Концепция была обоснована тем, что синтез белковой цепи на рибосоме происходит с N-конца к C-концу направленно и подтверждается результатами многочисленных экспериментов in vivo и на белоксинтезирующих модельных системах. Однако неизвестно, как могут сворачиваться белки котрансляционно.
Рис.1. Ко- (слева) и посттрансляционное (справа) сворачивание белков
Вторая концепция посттрансляционная, согласно которой нативная конформация белка формируется после синтеза и полного выхода полипептидной цепи из рибосомы из состояния случайного клубка (рис.1). Концепция была основана на результатах in vitro двух типов экспериментов. Один тип эксперименты по денатурации-ренатурации белков, по результатам которых некоторые малые глобулярные белки приобретали вид случайного клубка при денатурации и быстро восстанавливали нативную структуру спонтанно после удаления денатурирующего воздействия. Результаты другого типа экспериментов связаны с получением синтетических аналогов ряда нативных белков путем химического синтеза, в частности рибонуклеазы А, лизоцима, инсулина человека. На этих же результатах базируется теоретическая основа концепции в виде двух гипотез и пара утверждений. Одной из них гипотеза случайного клубка, согласно которой полипептидные цепи денатурированных и новосинтезированных на рибосоме белков представляются как случайные клубки. Вторая гипотеза – термодинамическая, которая устанавливает, что нативной конформации белка соответствует наименьшая свободная энергия Гиббса системы полипептидная цепь и физиологическая среда. Общеприняты утверждения, что процесс сворачивания белка может быть представлен как переход «клубок – глобула», и что сворачивание белков in vivo и ренатурация денатурированных белков происходят по одинаковым или схожим механизмам из состояния случайного клубка. Опираясь на эти гипотезы и утверждения, преобладающее большинство исследований по выяснению механизма процесса сворачивания белков ведутся на основе посттрансляционного подхода. При этом широко используют как эксперименты по денатурации и ренатурации белков, так и различные теоретические подходы, в частности, основанные на соображениях статистической механики, как удобные in vitro модели. Однако решить проблему сворачивания белков на этой основе до сих пор не удается.
Важный фундаментальный вопрос на пути решения проблемы сворачивания – объяснение быстрого сворачивания белков, поскольку число доступных полипептидной цепи дискретных конформаций астрономическое, и поэтому потребовалось бы астрономическое время, чтобы цепь приобретала соответствующую нативному белку единственную конформацию путем перебора всевозможных вариантов. Тем не менее, белки сворачиваются и это они делают очень быстро (парадокс Левинталя).
Итак, решение проблемы сворачивания белков требует ответить на обозначенные выше три фундаментальных вопроса: 1) сворачиваются ли белки ко- или посттрансляционно, т.е., в процессе, или после синтеза полипептидной цепи на рибосоме, 2) каков механизм сворачивания белков, 3) каково объяснение быстрого сворачивания белков?
Движущей силой процесса сворачивания белка является спонтанное стремление системы полипептидная цепь – вода (основная компонента физиологической среды) к стабилизации, уменьшению свободной энергии Гиббса. Она может быть записана в виде
Gстаб. = Hцепь – T Sцепь + Gгидрат. (*)
где Hцепь- энтальпия цепи, которая представляет собой внутримолекулярные и межмолекулярные взаимодействия полипептидной цепи и растворителя суммарно, Sцепь- энтропия цепи, Gгидрат.- свободная энергия гидратации (сольватации) цепи, которая включает в себе также свободную энергию растворителя, Т- температура. Предложены различные формулы и рецепты для вычисления каждого из входящих в выражение (*) вкладов. Эти рецепты, однако, далеки от совершенства. В частности, давно известно, что популярные функционалы, построенные на основе потенциалов невалентного взаимодействия типа “6-ехр” или “6-12” и торсионных потенциалов, используемые для оценок потенциальной энергии полипептидов, страдают от очевидных серьезных недостатков. Поэтому является актуальным создание простых и надежных расчетных методов для реалистической оценки потенциальной энергии, внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий полипептидов.
Цель работы. На основании вышеизложенного, основной целью данной диссертационной работы являлось исследование проблемы сворачивания белков с использованием расчетно-теоретических и аналитического подходов. Работа посвящена фундаментальным вопросам проблемы: 1) сворачиваются ли белки котрансляционно в процессе биосинтеза, или после синтеза и выхода из рибосомы посттрансляционно, 2) каков механизм сворачивания белков, а также оценки 3) энтальпийного вклада в свободную энергию сворачивания белков и 4) величины барьеров внутреннего вращения вокруг единичных связей основной цепи полипептидов и их роли в сворачивании белков.
Задачи исследования. В ходе работы были определены и решались следующие фундаментальные задачи.
- Создание надежного расчетного метода для конформационного анализа и изучения взаимодействия полипептидов и других органических молекул – модифицированного метода фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ);
- Создание алгоритмов и вычислительных программ для: построения молекулярной модели олигопептидов, расчетов поверхности потенциальной энергии (ППЭ) олигопептидов и отдельных аминокислотных остатков в них, обработки данных банка белковых структур и вычисления конформации полипептидных цепей из атомных координат белков, статистического анализа конформаций аминокислотных остатков в трехмерных структурах белков, построения конформационных карт;
- Расчетно-теоретическое исследование ППЭ олигопептидов аминокислот методом ФФВ и оценка величины БВВ вокруг связей NC и CC полипептидной цепи белков;
- Анализ конформаций аминокислотных остатков в трехмерных структурах белков из банка белковых данных;
- Систематизация литературных данных по химически синтезированным белкам и выяснение их отношение к проблеме сворачивания белков;
- Выяснение наличия остаточной упорядоченной структуры в белках при их денатурации на основе анализа известных экспериментальных данных;
- Выяснение степени адекватности ко- и посттрансляционного подходов изучению механизма сворачивания белков;
- Выдвижение возможного механизма сворачивания белков и предъявление подтверждающих этот механизм данных.
Научная новизна работы. Проведено фундаментальное исследование по выяснению реалистических оценок барьеров внутреннего вращения в белках:
Разработан надежный расчетный метод для оценок барьеров внутреннего вращения (БВВ) в белках – модифицированный метод фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ) для конформационного анализа и изучения взаимодействия полипептидов и других органических молекул.
Установлено, методом ФФВ, что величины БВВ вокруг связей NC и CC основной цепи полипептидов, которые традиционно считаются незначительными, около 0,7 ккал/моль для обеих величин, достаточно значительны и составляют соответственно около 16 ккал/моль - что сопоставимо с транс-цис барьером пептидной связи, и 6 ккал/моль.
Обоснована невыгодность нахождения в структуре белков неглициновых остатков в положительной - с положительным значением угла вращения вокруг связи NC - конформации. Представлено надежное косвенное экспериментальное подтверждение наличия высокого энергетического барьера при вращении вокруг связей NC в белках на основе анализа трехмерных структур белков из банка белковых данных.
Обоснована, на основе анализа известных данных о химически синтезированных белках, что возможность получения синтетических белков подтверждает наличия взаимосвязи между первичной структурой и нативной конформацией белков и вряд ли свидетельствует о посттрансляционном сворачивании белков.
Выявлена общая закономерность, из систематизации литературных данных, о наличии остаточных упорядоченных структур в белках в сильно денатурирующих условиях в отличие от традиционных представлений, рассматривающих денатурированные белки как случайные клубки, что свидетельствует о недостаточной обоснованности представления процесса сворачивания белка как переход клубок – глобула.
Представлено обоснование котрансляционного в процессе биосинтеза полипептидной цепи на рибосоме сворачивания белков. Предложен механизм сворачивания белков и предъявлены подтверждающие этот механизм и его универсальность данные.
Научно-практическая значимость полученных результатов. Разработан расчетный метод для конформационного анализа и изучения взаимодействия органических молекул и полипептидов. Метод может быть использован для изучения структуру, конформаций, энергию взаимодействия, дипольные моменты различных молекул и молекулярных комплексов. Даны реалистические оценки величины БВВ вокруг связей NC и CC основной цепи полипептидов, что может способствовать развитию структурной протеомики и сыграть важную роль в исследованиях проблемы сворачивания и пространственной структуры белков. Обоснована концепция котрансляционного сворачивания белков, что существенно облегчает целенаправленный поиск эффективных путей для реалистического описания соотношения между аминокислотной последовательностью и пространственной структурой белков. Предложен механизм сворачивания белков, что позволит разработать адекватные алгоритмы и методы для предсказания пространственной структуры пептидов и белков на основе известной первичной структуры. Полученные по теме диссертации результаты используются в учебных курсах по молекулярной биофизике в ряде университетах США, по меньшей мере, и могут быть использованы в учебных курсах других вузов по молекулярной биофизике, биохимии, молекулярной биологии. Они могут найти активное применение в биотехнологических разработках и молекулярной медицине, при проектировании и создании новых эффективных лекарственных препаратов пептидной природы.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на: VI и VII Всесоюзных симпозиумах по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Вильнюс, 1982; Рига, 1986), I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), IХ Всесоюзном совещании по квантовой химии (Иваново, 1985), I международной школе-конференции молодых ученых стран-членов СЭВ по биофизике (Братислава, 1985), Российской научной конференции с участием зарубежных ученых «Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах» (Тверь, 1994), Международной научной конференции «Математические модели нелинейных возбуждений, переноса, динамики, управления в конденсированных системах и других средах» (Тверь, 1996), International Symposium “Protein Structure, Stability and Folding. Fundamental and Medical Aspects” (Moscow, 1998), 3-rd International Conference on Molecular Structural Biology (Vienna, 1999).
Личный вклад автора в проведенных исследованиях. Постановка задач и их решение, создание алгоритмов и компьютерных программ, проведение расчетов, получение и интерпретация представленных в диссертации результатов принадлежат самому автору.
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 27 статьей в отечественных и зарубежных журналах.
Объем, структура, общая характеристика диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов исследования и их обсуждения, выводов, списка опубликованных по теме диссертации и цитированных работ. Объем диссертации составляет 203 стр. и включает 39 рисунков, 37 таблиц и 498 ссылок. Во введении представлены актуальность проблемы и краткий анализ известных подходов к ее решению, цель исследования, отражена научная новизна работы. В обзоре литературы представлены успехи, достигнутые в исследованиях проблемы сворачивания белков. Раздел «результаты и обсуждение» состоит из трех частей, включающих 10 глав. В первой части рассматриваются основы гипотезы случайного клубка применительно к белкам, где внимание сосредоточено на обсуждении БВВ в белках. Для оценок БВВ в белках предлагается новая улучшенная версия расчетного метода ФФВ. Приведены результаты расчетов поверхности потенциальной энергии олигопептидов ряда аминокислот, полученные с применением метода ФФВ. Значительное место уделено результатам обработки данных о трехмерных структурах белков из банка белковых структур и анализу конформаций аминокислотных остатков встречаемых в этих структурах. Вторая часть посвящена анализу концепции посттрансляционного сворачивания белков. Результаты указывают на недостаточную обоснованность адекватности посттрансляционного подхода решению проблемы сворачивания белков. В третьей части вкратце прослежен биогенез белковой цепи от начала ее биосинтеза на рибосоме и до завершения сворачивания в разных водных компартментах клетки. Имеющиеся данные позволили обосновать, почему белки должны сворачиваться котрансляционно, и предложить возможный механизм сворачивания белков. Приведены данные, известные из литературы экспериментальные, и собственные, полученные в расчетах олигопептидов, которые поддерживают предлагаемую схему сворачивания белков.
