Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. 8
1.1. Экспериментальные исследования кинетики самоорганизации белков. 8
1.1.1. Процедура экспериментального исследования кинетики и термодинамики сворачивания белков. 8
1.1.2. Открытие механизма нуклеации. 18
1.2. Аналитические теории и теоретические работы по изучению сворачивания белков . 22
1.3. Эмпирические методы предсказания скоростей сворачивания белков. 29
ГЛАВА 2. Теория моделирования разворачивания белка . 32
2.1. Модель последовательного разворачивания белка. 32
2.2. Свободная энергия «полусвернутой» белковой цепи. 33
2.3. Скорость элементарного шага. 35
2.3.1. Экспериментальная оценка скорости конформационной перестройки аминокислотного остатка . 36
2.4. Алгоритм расчета скорости сворачивания-разворачивания белка. 36
2.5. Алгоритм расчета ядра сворачивания белка. 40
ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение. 45
3.1. Моделирование процесса сворачивания-разворачивания белка. 45
3.1.1. Предсказание скорости сворачивания-разворачивания белка в окрестности точки термодинамического равновесия. 45
3.1.2. Предсказание вовлеченности аминокислотных остатков белка в ядро сворачивания в точке термодинамического равновесия . 51
3.2. Эмпирические зависимости: что можно сказать о скорости сворачивания без моделирования процесса сворачивания белка? 54
3.2.1. Предсказание скорости сворачивания белка по его трехмерной структуре. 57
3.2.2. Предсказание скорости сворачивания белка по его аминокислотной последовательности. 61
Заключение. 65
Благодарности. 67
Выводы. 68
Список публикаций по теме диссертации. 69
Список литературы.
- Процедура экспериментального исследования кинетики и термодинамики сворачивания белков.
- Аналитические теории и теоретические работы по изучению сворачивания белков
- Экспериментальная оценка скорости конформационной перестройки аминокислотного остатка
- Предсказание вовлеченности аминокислотных остатков белка в ядро сворачивания в точке термодинамического равновесия
Введение к работе
Белки (наряду с ДНК и РНК) являются важнейшими для жизни биополимерами. При участии белков происходит подавляющее большинство процессов в живой природе, которые без участия белков либо идут с
ничтожной скоростью, либо не идут вообще.
Рис.1, (а) Первичная структура (то есть аминокислотная последовательность) белка — N-концевого домена виллина. Каждая буква соответствует одной аминокислоте, (б) Трехмерная нативная структура того же белка; показан только ход главной цепи: боковые группы не изображены для упрощения рисунка, (в) Скелетная модель нативной структуры (боковые группы — тонкие линии, главная цепь — толстая), (г) Атомная модель нативной структуры.
Белки состоят из аминокислотных остатков 20 типов, соединенных друг с другом ковалентными связями в неразветвленную линейную структуру, в которой последовательность аминокислотных остатков (называемая
первичной структурой, Рис.la) для каждого белка строго определена [Sanger, Tuppy, 1951]. Белок функционален только в свернутом состоянии, в котором имеет уникальную пространственную структуру (эта биологически активная структура называется «нативной», Рис.16), что впервые было показано Перутцем и Кендрью в 1950-х годах [Kendrew et al., 1958; Perutz et al., 1960]. Специфичность функции белка связана с тем, что в клетке, при биологических условиях (обычно: 25-37С, нейтральный рН, отсутствие денатуранта), нативная структура намного стабильнее всех других структур, от которых отделена барьером свободной энергии, а разрушение структуры (вследствие изменения условий) происходит кооперативно по типу «все-или-ничего» [Privalov, 1979;Privalov, 1982].
В клетке обретение белком нативной структуры происходит сразу после биосинтеза полипептидной цепи на рибосоме. Изначально было непонятно, необходима ли рибосома для формирования пространственной структуры белка. Однако в 1961 году Анфинсен показал, что трехмерная структура бычьей рибонуклеазы определяется только ее первичной структурой — при медленном восстановлении физиологических условий развернутый белок in vitro опять приобретал свою нативную структуру [Anfmsen et al., 1961; Anfinsen, 1973]. Позже было показано, что химически синтезированный белок также способен сворачиваться в нативную структуру [Gutte, Merrifield, 1969; Merrifield, 1969], несмотря на то, что он ни разу в жизни не «видел» рибосомы. С тех пор способность к ренатурации была продемонстрирована для очень большого числа белков (см. обзор [Jackson, 1998]).
Со времен опытов Анфинсена проблема сворачивания белка стала физической (ее также называют проблемой самоорганизации белка) и до сих пор является одной из самых важных и актуальных проблем биофизики. В ходе экспериментальных и теоретических исследований самоорганизации белка возникло множество вопросов: «Как белок находит нативную структуру из астрономического числа возможных?» (т.н. парадокс Левинталя [Levinthal,
1968]), «Каков механизм сворачивания белка?», «Чем определяется скорость и путь сворачивания белка?» и др. На некоторые вопросы ответы уже получены, на другие — едва намечены.
Целью данной диссертационной работы является выявление факторов, определяющих скорость самоорганизации белков2, и степени их влияния на скорость сворачивания белков.
Для этого нами, во-первых, разработан метод анализа сети путей сворачивания-разворачивания белков с известной трехмерной структурой, основанный на решении системы кинетических уравнений, написанных для всех «полусвернутых» структур, возникающих в процессе сворачивания белка. Предложенный метод был успешно применен для расчета скоростей сворачивания и разворачивания более чем 80 белков с экспериментально исследованной на сегодняшний день кинетикой сворачивания. Этот метод также позволяет более или менее удовлетворительно предсказывать локализацию ядер сворачивания белков.
Во-вторых, нами предложены два феноменологических метода, которые позволяют проще и быстрее — при той же эффективности — предсказывать скорость сворачивания белка в «биологических» условиях, когда нативная структура намного стабильнее развернутой. Для использования первого метода необходимо знать трехмерную структуру белка — скорость сворачивания предсказывается по среднему числу остатков, разделяющих атомы, контактирующие в нативной структуре. Для второго метода нужно знать только число неспиральных остатков в нативной структуре белка, которое может быть успешно определено по одной лишь первичной структуре белка.
Согласно сложившейся традиции, в этой работе под словом «скорость» мы подразумеваем константу скорости,
2 Для краткости мы будем называть «белками» однодомспные водорастворимые глобулярные белки, а также отдельные глобулярные домены мі ю го доменных белков, и, кроме того, не глобулярные, но имеющие определенную пространственную структуру маленькие пептиды. Строго говоря, в данной работе рассматриваются только белки, не имеющие в своей нативной структуре ни S-S связей, ни ковалентних связей слигапдами.
Процедура экспериментального исследования кинетики и термодинамики сворачивания белков.
Для надежного измерения скоростей сворачивания и разворачивания начальная и конечная населенности должны сильно отличаться. Поэтому при измерении скорости сворачивания начальная концентрация денатуранта должна быть высокой (чтобы большинство молекул белка было денатурированным), а при измерении скорости разворачивания — низкой. Именно поэтому невозможно измерить скорость сворачивания в области высоких концентраций, и скорость разворачивания — при низких: в этом случае разность начальной и конечной интенсивности сигнала практически равна нулю. Поэтому зависимость констант скоростей сворачивания и разворачивания во всем диапазоне концентраций денатуранта определяют путем экстраполяции ветви сворачивания в область высоких значений D, а ветви разворачивания — в область низких (Рис.5).
Коэффициенты mf и ти определяют из шевронного графика. Поскольку они пропорциональны изменению площади поверхности белка, доступной растворителю, при переходах V о Г5 и N TS (так же, как т — при переходе U - N), соответственно, то координату переходного состояния Prs (РИС.4) можно выразить следующим образом: Если /77S близка к 1, то доступная растворителю поверхность белка в TS близка к таковой нативного белка; если же p!S близка к 0, то структура белка в TS почти так же развернута, как и денатурированная структура. В случае, когда координата переходного состояния меняется с изменением концентрации денатуранта (случай «широкого» барьера), наблюдается нелинейная зависимость скоростей сворачивания-разворачивания от концентрации денатуранта — ветви шевронного графика изогнуты [Otzen et al., 1999; Oliveberg, 2001].
Обычно белок считают одностадийным, если: (1) зависимости населенностей от времени (найденные разными методами) удовлетворяют уравнениям (1.13) и (1.14), (2) начальное и конечное значения населенностей совпадают со значениями, ожидаемыми из равновесных графиков, (3) константы равновесия, найденные из кинетического и равновесного исследований, совпадают друг с другом, и (4) коэффициенты т, mf и ти удовлетворяют уравнению (1.11). Невыполнение одного из этих условий свидетельствует о наличии по крайней мере одного интермедиата (если при этом он не наблюдается при равновесном исследовании, его называют кинетическим).
Надо заметить, что в случае, когда у белка есть хотя бы один пролин, кинетические исследования сворачивания затрудняются гетерогенностью развернутого состояния: быстрое сворачивание возможно только для тех молекул, у которых угол со у пролина такой же, какой и в нативной структуре. Для остальных молекул белка сначала должна поменяться конформация пролина по углу о (константа скорости этого процесса составляет примерно 0.1 с ), и лишь затем возможно сворачивание, то есть наблюдаются две стадии сворачивания (нижняя кривая на Рис.4). В этом случае скоростью сворачивания считается скорость быстрой стадии [Guijarro et а]., 1998; Lopez-Hernandez, Serrano, 1996 и др.], так как изучается процесс самоорганизации белка, а не процесс цис-транс пролиновой изомеризации. Конечно, эти затруднения наблюдаются, только если процесс цис-транс пролиновой изомеризации происходит медленнее процесса сворачивания белка.
При экспериментальном исследовании белков с пролинами экспериментаторам приходится определять, является ли некая стадия процесса сворачивания цис-транс пролиновой изомеризацией или нет. Есть несколько способов убедиться в этом:
1) Скорость стадии зависит от концентрации фермента, ускоряющего изомеризацию (Рис.4) [Taddei et al., 1999; Lopez-Hernandez, Serrano, 1996 и др.];
2) Скорость стадии практически не зависит от концентрации денатуранта. Действительно, так как цис-транс пролиновая изомеризация происходит между двумя развернутыми структурами, то ее скорость не должна зависеть от концентрации денатуранта, поскольку поверхность, доступная растворителю, одинакова для клубкового состояния белка, независимо от того, в какой конформации находятся пролины [Ikura et ah, 2000 и др.];
3) Скорость стадии составляет примерно 0.1 с \ что является характерным значением для скорости цис-транс пролиновой изомеризации в клубковом состоянии белка [Tang et al., 1999; Schreiber, Fersht, 1993 и др.];
4) Амплитуда сигнала медленной фазы составляет 10-30%, если в нативной структуре белка пролины находятся в транс-кон формации (поскольку транс-конформация более предпочтительна) [Golbik et al., 1998]. Если же хоть один пролин в нативном положении находится в цис-положении, то амплитуда медленной стадии будет равна -70-90% [Schreiber, Fersht, 1993];
5) Мутация пролина приводит к исчезновению медленной фазы [Lopez Hernandez, Serrano, 1996];
6) Так называемый эксперимент с двойным прыжком (double-jump experiment): сначала белок, долго находящийся в нативных условиях, быстро помещают в денатурирующие условия, а затем, после недолгого времени ожидания г (которое в идеале должно быть намного больше времени разворачивания белка, но намного меньше времени пролиновой изомеризации), условия возвращают обратно. В этом случае стадия изомеризации не наблюдается (поскольку за время г денатурированное состояние с негативной конформацией пролина не успевает населиться) [Brandts et al., 1993]. Кстати говоря, этот эксперимент является прямым экспериментом по измерению скорости цис-транс пролиновой изомеризации — ее можно вычислить по зависимости восстановления амплитуды медленной стадии от времени г.
Аналитические теории и теоретические работы по изучению сворачивания белков
Теоретические исследования сворачивания белка шли параллельно, а иногда и совместно с экспериментальными работами. Результаты этих работ внесли большой вклад в понимание механизма сворачивания белков.
Во-первых, следует особенно отметить работы группы Шахновича по моделированию процесса сворачивания белка при помощи компьютерного моделирования сворачивания простых модельных цепей на кубической решетке методами Монте-Карло. Эти работы оказали огромное влияние на понимание результатов эксперимента. Они показали, что, как правило, результатом быстрого и воспроизводимого сворачивания является наиболее
стабильная укладка цепи (особенно когда ее стабильность усилена специальным «редактированием» последовательности) [Sail et al., 1994]. Другой важный результат этих работ состоит в том, что, как было показано, гидрофобный коллапс на ранней стадии сворачивания не является обязательным [Gutin et al., 1995], а обязательным является формирование определенного набора нативных контактов между удаленными участками сворачивающейся цепи [Abkevich et al., 1994]. Эти специфические контакты («ядро сворачивания») обязательно должны быть сформированы в TS (и приводят к последующей быстрой самоорганизации белка), в то время как другие контакты необязательны и появляются в TS с низкой вероятностью.
Открытие процесса нуклеации дало ключ для решения парадокса Левинталя и для оценки характерных времен сворачивания белков. Хотя эксперименты (как in vitro [Fersht, 1997], так и in silico [Galzitskaya, Finkelstein, 1995; Gutin et al., 1996]) показывают, что дальнейшая стабилизация нативного состояния ускоряет сворачивание, процесс нуклеации особенно просто выглядит вблизи точки термодинамического равновесия между нативной и развернутой структурами [Финкелыптейн, Бадретдинов, 1997; Finkelstein, Badretdinov, 1997]. В этой точке скорости сворачивания и разворачивания равны по определению. Однако моделирование процесса разворачивания намного проще, чем сворачивания, так как при этом можно опираться на известную трехмерную структуру нативного белка, и можно не учитывать неправильно свернутые структуры, — поскольку они менее стабильны, чем и нативное, и развернутое состояния, они просто не возникают в регистрируемых концентрациях.
Так как в точке термодинамического равновесия свободные энергии нативного и развернутого состояний равны, то дополнительная свободная энергия ядра, соответствующая барьеру свободной энергии нуклеации, возникает только благодаря границе, разделяющей нативнуго и развернутую фазы (Рис.7). Максимальный размер поверхности этой границы L2n для цепи из L остатков. В зависимости от топологии белка граница нативной части ядра может быть либо покрыта петлями, энтропия которых добавляется к обычной поверхностной энергии границы, либо нет. Можно показать, что свободная энергия границы составляет \.5L2/3RT в случае, когда вся граница покрыта петлями, и 0.5L2nRT — в противном случае. Поскольку характерное время перехода одного остатка из одной конформации в другую составляет -10 не [Zana, 1975], преодоление такого барьера свободной энергии нуклеации займет ехр(1.512/3/?Г) не в первом случае, и только ехр(0.5L2nRT) не — во втором [Финкельштейн, Бадретдинов, 1997; Finkelstein, Badretdinov, 1997]. Этот диапазон значений полностью согласуется с наблюдаемыми временами сворачивания белков [Galzitskaya et al., 2001; Галзитская и др., 2001; Финкельштейн и др., 2005] (см. также пункт 3.2, Рис.16). Однако в рамках общей теории, без тщательного моделирования процесса сворачивания, получить точную численную оценку для коэффициента, стоящего перед экспонентой, невозможно.
Тот факт, что подавляющее число белков попадает внутрь предсказанного теорией Финкельштейна-Бадретдинова диапазона, означает, что механизм нуклеации справедлив не только для сворачивания одностадийных белков (для которых он был открыт), но и для сворачивания маленьких пептидов, а также многостадийных белков (пока они не разделены на домены).
Одновременно Гутин и др., исследуя процесс сворачивания модельных белковых цепей на кубической решетке [Gutin et al., 1995], пришли к выводу, что в том случае, когда стабильность нативного состояния максимальна, натуральный логарифм скорости его сворачивания должен зависеть от длины цепи как InJfc;--lnI.
Еще одну, на этот раз аналитическую оценку зависимости скорости сворачивания белка от длины его цепи в условиях, когда нативное состояние намного стабильнее развернутого, предложил Тирумалай [Thirumalai, 1995]:
Несмотря на различный вид зависимости скорости сворачивания от длины цепи, все эти аналитические теории схожи в том, что, как интуитивно и кажется, скорость сворачивания должна уменьшаться с увеличением длины цепи белка.
В недавних компьютерных экспериментах было показано [Koga, Takada, 2001], что скорость сворачивания модельных белков на решетке с упрощенными потенциалами зависит от длины цепи как In А" І Ш018, что хорошо согласуется с зависимостями, найденными и Финкелынтейном, и Тиру мал аем.
Экспериментальная оценка скорости конформационной перестройки аминокислотного остатка
Значение константы ка »108сч мы взяли из эксперимента, где она была измерена как скорость перехода аминокислотного остатка аланина из клубковой конформации в спиральную [Zana, 1975]. Мы считаем, что она примерно одинакова для всех типов аминокислотных остатков (при этом важно то, что эта константа много больше скоростей сворачивания белков и пептидов, разбросанных в интервале от 10"3с" для р2-субъединицы триптофан-синтетазы до 107с для альфа-спирали из 21 остатка, см. Таблицу 2 Приложения Б).
Алгоритм расчета скорости сворачивания-разворачивания белка. Построение сети путей сворачивания-разворачивания предполагает, что если элементарного перехода из состояния / в состояние j нет. В частности, поскольку число звеньев цепи больше 1, то есть начальное и конечное состояния не могут быть соединены элементарным переходом. Кроме того, для удобства записи положим: к„=0 (/ = 07МТЇ). Населенности микросостояний щ (/ = 0,Л/ + і) будут изменяться со временем в соответствии с обычными кинетическими уравнениями: - =-Хм + ЕМу ( = м+0- (2-6)
Заметим, что полное число молекул в системе со временем не изменяется. Действительно, правые части (2.6) состоят из членов типа куПп каждый из которых встречается ровно два раза — один раз со знаком «+» (в уравнении для узла у) и один раз со знаком «-» (в уравнении для узла /). Поэтому если просуммировать все уравнения системы (2.6), справа получится нуль, а слева будет полное изменение количества всех молекул в системе:
Поскольку мы считаем, что в окрестности точки термодинамического равновесия имеются в наблюдаемом количестве только два состояния — нативное и развернутое, то для всех остальных микросостояний мы можем использовать квазистационарное приближение [Эмануэль, Кнорре, 1984]: -=0 (і = \:м). (2.8) С его учетом система (2.7) в векторном виде будет выглядеть как: dt dnn 2.10)
To есть, скорости сворачивания и разворачивания белка будут равны, соответственно, А/=й-В А-1В = С А- В, (2.11) ки=с-С А-1С = в А-,С (2.12) а число молекул, покинувших начальное состояние, будет равно числу молекул, пришедших в конечное (в соответствие с тем, что изменение со временем населенностей всех промежуточных состояний равно нулю): dn0 = dnM+] dt dt Вектор n(/)=A lB найдется решением матричного уравнения An(/)=B, а вектор n(u = А" С — уравнения An(u) =С. Вектор п(/) описывает населенность промежуточных микросостояний в том случае, если населенность состояния О поддерживается равной единице, а населенность состояния М + \ — равной нулю. Вектор п00 описывает населенность промежуточных микросостояний в противном случае, то есть если населенность состояния 0 поддерживается равной нулю, а населенность состояния М + \ — равной единице. Оба уравнения, Ап{/) -В и An " = С, мы решаем численно, с помощью компьютера, методом итераций Зейделя. [Бахвалов и др., 1987]. Уместно указать, почему квазистационарное приближение справедливо в рассматриваемом случае. Для этого достаточно рассмотреть необратимый поток из состояния 0 в состояние М+ \ (здесь мы рассматриваем те же условия, при которых был вычислен вектор п(/), то есть, когда населенность состояния 0 поддерживается равной единице, а населенность состояния М + Ї — равной нулю). При этом населенность каждого микросостояния / в каждый момент времени / будет выражена через населенность узла 0 в этот же момент времени: где /і; — некая величина, зависящая от микросостояния /, но не от времени.
Тогда скорость изменения населенности микросостояния / будет равна dn, (О dnJt) — = р, — = -и,кгщ{1) = -kfnf(t). Поскольку мы ожидаем, что процесс перехода через всю сеть путей сворачивания будет медленным по сравнению со скоростями любого разрешенного элементарного перехода, то есть к{ « к0, то: Нмло «мло,, dt dn, (0 -что означает, что величина —- будет исчезающе мала по сравнению с каждым из составляющих ее членов вида кі;п,(і) и А,-,-иу(0, что и доказывает справедливость квазистационарного приближения.
Алгоритм расчета ядра сворачивания белка. Теперь, после того как мы нашли векторы п(/) и n"", мы можем перейти к расчету вовлеченности аминокислотных остатков в ядро сворачивания белка. Пусть G, — свободная энергия микросостояния /. Положим, как и в пункте 2.3, AG, s(G,-G0)/RT. Тогда AG0=0. В дальнейшем нам понадобится соотношение между скоростями элементарных шагов к0 и кл. Поскольку это соотношение не должно зависеть от концентраций микросостояний / и J (равно как и от концентраций всех остальных микросостояний системы), то для его вычисления следует взять ситуацию, возникающую после установления в системе динамического равновесия. В этом случае поток отсутствует, и число молекул, переходящих из состояния / в состояние J, равно числу молекул, переходящих обратно, то есть кцп? = к}1п], (где п — равновесная населенность микросостояния /), и равновесные населенности состояний определяются больцмановским распределением: - = —— LL # п) exp(-AG;) Тогда ку ехр(-ДС,) = kfi cxpi-AG;) (i,j = 0 М+\). (2.13) Заметим, что константы скорости, определенные согласно критерию Метрополиса (2.5), удовлетворяют данному условию.
Предсказание вовлеченности аминокислотных остатков белка в ядро сворачивания в точке термодинамического равновесия
Предсказание вовлеченности аминокислотных остатков белка в ядро сворачивания в точке термодинамического равновесия. Для проведения расчетов мы взяли 17 белков с экспериментально исследованными ядрами сворачивания (см. Таблицу 6 Приложения Б). Поскольку вычисление величин ф из эксперимента подразумевает предварительное измерение скоростей сворачивания, то все эти 17 белков входят также и в Таблицы 1-4, По формуле (2.24), с использованием пространственных структур из Таблицы 3, мы рассчитали величины ф для всех остатков этих 17 белков и сравнили их с экспериментально полученными величинами ф. Результат вычислений представлен на Рис. 15а (серые столбцы). В среднем коэффициент корреляции по всем 17 белкам с известным ядром составляет 0.27, что говорит о практическом отсутствии корреляции — хотя видно, что качество предсказания сильно зависит от рассматриваемого белка. По-видимому, это связано с тем, что величины ф, находящиеся в диапазоне от нуля до единицы для всех белков, являются более тонкой характеристикой сворачивания белка (в отличие от скоростей, которые для разных белков могут отличаться в миллионы раз). Действительно, если, например, белок сворачивается по двум параллельным путям, один из которых немного более предпочтителен (скажем, на RT), то увеличение на пару RT свободной энергии переходного состояния, соответствующего этому пути, кардинально изменит большинство величин ф — белок теперь будет сворачиваться преимущественно по другому пути, в то время как скорость изменится всего раза в три (заметим, что мутация одного аминокислотного остатка может изменить скорость сворачивания в десятки и сотни раз). Это также подтверждается тем, что предсказание величин ф для некоторых белков сильно зависит от учета водородных атомов, а также от выбора пространственной структуры белка, по которой происходит расчет величин ф [Garbuzynskiy, 2005].
Первый из двух последних фактов следует из расчета величины ф для тех же 17 белков, с использованием тех же пространственных структур, что и раньше, но только с учетом и водородных атомов. Сравнение результатов расчета с экспериментом представлены на Рис. 15а (черные столбцы). В среднем коэффициент корреляции увеличился на 0.12, составляя теперь 0.39, однако для некоторых белков (например, для белков G и src SH3) согласие с экспериментом улучшается драматически.
Затем мы сделали предсказание величин ф для тех же 17 белков, — но с использованием пространственных структур, употребленных в работе [Garbuzinskiy et al., 2004] (где, по историческим причинам, для 9 белков из 17 были использованы файлы координат, отличные от перечисленных в Таблице 3; в частности, Garbuzinskiy et al. всегда предпочитали кристаллографические структуры структурам, решенным методом ЯМР); использованные в работе Garbuzinskiy et al. файлы перечислены в подписи к Таблице 6. Результаты предсказания ядер сворачивания по координатам, приведенным в этих файлах, представлены на Рис.156. Как и раньше, учет водородных атомов в среднем улучшает предсказание ядра сворачивания белка (на этот раз коэффициент корреляции увеличивается на 0.14). Кроме того, переход к другим файлам координат (хотя этот переход охватывает только половину белков!) изменяет коэффициент корреляции с 0.27 до 0.37 (если водородные атомы не учитывались) и с 0.39 до 0.51 (если водородные атомы брались в расчет).
Мы видим, что качество предсказания более-менее удовлетворительное (с учетом того, что на данный момент не существует метода предсказания со средним коэффициентом корреляции, большим, чем 0.54 [Garbuzynskiy et al., 2004]). Однако разброс значений и сильная зависимость качества предсказания для некоторых белков от используемых параметров и от выбора трехмерных белковых структур не позволяет признать наш метод достаточно удовлетворительным — при нынешних, довольно грубых параметрах.
Отметим, что все наши попытки (как и попытки других исследователей) разработать феноменологический, то есть не требующий анализа сети путей сворачивания-разворачивания белка, метод предсказания ядра его сворачивания успеха не имели: коэффициент корреляции всех таких методов с опытом не превышал 0.2.
Эмпирические зависимости: что можно сказать о скорости сворачивания без моделирования процесса сворачивания белка? Прежде всего заметим, что все перечисленные в Обзоре литературы феноменологические методы разработаны для предсказания скоростей сворачивания только одностадийных белков. То есть, для использования этих методов сначала необходимо убедиться в том, что белок, скорость которого мы хотим предсказать, сворачивается в одну стадию, что может быть установлено только при экспериментальном исследовании кинетики сворачивания белка. Однако после проведения такого исследования необходимости в предсказании уже нет, поскольку скорость сворачивания уже измерена. Кроме того, известно, что разделение белков на одно- и многостадийные достаточно условно — мутация или даже простое изменение внешних условий (таких, как концентрация соли или температура) может переключить кинетику сворачивания с одно- на многостадийную или наоборот [Choe et al, 1998; Gianni et al, 2003; Khorosanizadeh et al., 1998]. Поэтому важно разработать универсальный метод предсказания скоростей сворачивания однодоменных глобулярных белков — метод, который бы работал независимо от размера белка, его вторичной структуры и сложности кинетики сворачивания в воде.
В качестве отправной точки мы посмотрели, как зависит скорость сворачивания белка от длины белковой цепи. Как уже упоминалось в Обзоре литературы, было разработано несколько аналитических теорий, из которых следует, что скорость сворачивания должна уменьшаться с увеличением длины цепи белка. Резкое увеличение объема экспериментальных данных по кинетике сворачивания белков за последние годы позволило проверить согласие этих теорий с экспериментом. Первым делом мы обратились к теории Финкельштейна-Бадретдинова, в которой говорится, что скорость сворачивания белка в точке термодинамического равновесия кл/ зависит от длины цепи белка L следующим образом: \пк" -(1±0.5)ш. График этой зависимости для всех более чем 80 белков с экспериментально исследованной на данный момент кинетикой сворачивания изображен на Рис.16. Коэффициент корреляции составляет -0.69±0.06. Отметим, что когда график этой зависимости был впервые получен (совместно с О.В. Галзитской), коэффициент корреляции для вдвое меньшего набора белков был практически такой же: -0.64 [Galzitskaya et al., 2001]. При рассмотрении же разных подгрупп белков (сворачивающихся с интермедиатами при низкой концентрации денатуранта и без) оказалось, что скорости сворачивания как тех, так и других, зависят от длины цепи одинаково — для одностадийных коэффициент корреляции равен -0.60±0.08, для многостадийных 0.58±0.13.
