Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Вклад поверхностных аминокислотных остатков в стабильность белка 6
1.1. Взаимодействия поверхностных аминокислотных остатков, важные для стабильности белка
1.2. Поверхностные остатки и образование вторичной структуры 9
1.3. Аминокислотные замены в петлях и поворотах основной цепочки 12
1.4. Взаимодействие заряженных аминокислот на поверхности белка. Солевые мостики 15
1.5. Гидрофобные остатки на белковой поверхности и обратный гидрофобный эффект 19
ГЛАВА 2. Поверхностные аминокислотные остатки и фолдинг белков 23
2.1. Сопряжение связывания и сворачивания для неструктурированных белков 23
2.2. Влияние антител на сворачивание 28
ГЛАВА 3. Молекулярные свойства экспериментальных объектов - убиквитина и пероксидазы хрена 33
3.1. Термодинамическая стабильность и фолдинг убиквитина 33
3.2. Фолдинг пероксидазы хрена 36
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 41
ГЛАВА 4. Материалы и методы исследования 41
4.1. Материалы 41
4.2. Методы 42
4.2.1. Мутагенез и экспрессия мутантных вариантов убиквитина 42
4.2.2. Измерение термодинамической стабильности вариантов убиквитина с помощью микрокалориметрии 43
4.2.3 Измерение спектров кругового дихроизма (КД) 45
4.2.4 Получение и очистка моиоклональных антител против пероксидазы хрена... 45
4.2.5 Денатурация и ренатурация пероксидазы хрена 46
4.2.6 Измерение каталитической активности пероксидазы 46
4.2.7 Конкурентный твердофазный иммуноферментный анализ 47
4.2.8 Титрование апо-пероксидазы хрена гемом 47
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 49
ГЛАВА 5. Эффект аминокислотных замен на поверхности убиквитина на стабильность белка 49
5.1. Экспериментальная стратегия исследования вклада поверхностных остатков в стабильность убиквитина 49
5.2. Вклад разной способности аминокислот образовывать а-спираль в стабильность убиквитина 55
5.3. Гидрофобные взаимодействия на частично экспонированных позициях на поверхности убиквитина 60
ГЛАВА 6. Влияние антител на сворачивание пероксидазы хрена 74
6.1 Сворачивание пероксидазы хрена в присутствии моноклональных антител... 74
6.2 Причины неполного восстановления каталитической активности пероксидазы при ренатурации 82
6.3 Возможный механизм увеличения выхода ренатурации пероксидазы в присутствии антител 90
Выводы 92
Список литературы 94
- Взаимодействие заряженных аминокислот на поверхности белка. Солевые мостики
- Измерение термодинамической стабильности вариантов убиквитина с помощью микрокалориметрии
- Экспериментальная стратегия исследования вклада поверхностных остатков в стабильность убиквитина
- Причины неполного восстановления каталитической активности пероксидазы при ренатурации
Введение к работе
Сворачивание белков является одной из фундаментальных проблем, находящихся на стыке молекулярной биологии, физической химии и химии полимеров. Со времени классических работ Анфинсена и сотрудников [1] известно, что аминокислотная цепочка белка сворачивается в одну уникальную пространственную структуру; иными словами, последовательность аминокислот однозначно определяет третичную структуру белка. Это значит, что гипотетически возможно предсказать пространственную структуру белка, зная его последовательность. Однако принцип соответствия между последовательностью аминокислот и пространственной структурой белка остается неизвестным. Очевидно, что поиск этой "второй половины генетического кода" и понимание механизма сворачивания очень важны не только в фундаментальном аспекте, но и как потенциальный инструмент для предсказания структуры (а значит, во многих случаях, и функции) белков, основываясь на известной последовательности ДНК. В настоящий момент, когда секвенированы геномы человека и ряда других организмов, актуальность предсказания структуры белка по последовательности ДНК (которая транслируется с помощью генетического кода в последовательность аминокислот) трудно переоценить.
Спрятанные в гидрофобном ядре остатки считаются ключевыми в фолдинге белка. Ранее предполагалось, что поверхностные остатки практически не вносят вклад в стабильность белка и не важны для сворачивания [2].
Роль взаимодействий поверхностных остатков в сворачивании и их влияние на стабильность белка только недавно привлекли внимание исследователей [3]. Установлено, что, по крайней мере, в некоторых случаях, остатки на поверхности могут вносить существенный вклад в термодинамическую стабильность белка и участвовать в сворачивании. Мы предполагаем, что роль поверхности в стабильности и сворачивании белка была в значительной степени недооценена и требует дальнейшего изучения.
Исходя из вьппеизложенного, в данной работе были поставлены следующие задачи:
1) Систематизировать литературные данные о вкладе поверхностных остатков в стабильность и сворачивание белка.
2) Охарактеризовать вклад взаимодействий поверхностных остатков в стабильность белка на примере молекулы дрожжевого убиквитина.
3) Изучить роль белковой поверхности в сворачивании на примере влияния антител на ренату рацию пероксидазы хрена из гуанидин-гидрохлорида.
Взаимодействие заряженных аминокислот на поверхности белка. Солевые мостики
Недавно было обнаружено, что аминокислотные замены экспонированных на поверхности заряженных остатков могут существенно влиять на стабильность белка [22-24, 30, 83].
Сила взаимодействий между заряженными аминокислотами в первую очередь зависит от расстояния между остатками. В нативном и развернутом состояниях расстояния между заряженными аминокислотами различаются, что делает электростатические взаимодействия энергетическими значимыми для свободной энергии сворачивания.
Суммарный энергетический вклад взаимодействия зарядов составляет обычно всего несколько кДж/моль [25]. Однако термодинамическая стабильность белка, как было обсуждено выше, сравнительно мала и составляет величину порядка несколько десятков кДж/моль [12]. Поэтому взаимодействия между заряженными аминокислотами на поверхности могут существенно влиять на стабильность белка [25].
Если рассматривать нативный белок как сферу с низкой диэлектрической проницаемостью, окруженную средой с высокой диэлектрической проницаемостью (водным раствором), то на основании вычисленных по пространственной структуре расстояний между заряженными аминокислотами и степени их экспонированности можно для каждого белка рассчитать энергию взаимодействия зарядов [25]. Данные этих расчетов позволяют найти остатки, которые невыгодно взаимодействуют с остальными заряженными аминокислотами на поверхности. С помощью мутагенеза заряд такого остатка можно либо нейтрализовать, либо изменить на противоположный. Изменения стабильности белка будут отражать вклад взаимодействия зарядов [22, 24]. Так, например, в молекуле убиквитина замена дестабилизируещего по теоретическим расчетам аргинина 42 на глутамат стабилизирует белок на 6,8 кДж/моль [22]. И наоборот, замена выгодно взаимодействующего остатка на противоположно заряженный или нейтральный будет дестабилизировать белок [22].
Моделирование взаимодействия зарядов позволяет предсказывать эффекты мутаций заряженных остатков, по крайней мере, на качественном уровне, и осуществлять рациональный дизайн поверхности белка с целью его стабилизации.
Ряд экспериментальных данных свидетельствует о наличии взаимодействия зарядов в развернутом состоянии белка [84-88]. Однако моделирование взаимодействия зарядов на основании нативной структуры белка не учитывает расстояния между зарядами в развернутом состоянии. Дальнейший прогресс в теоретическом расчете электростатических взаимодействий между заряженными аминокислотами будет связан с созданием реалистической модели взаимодействия заряженных остатков в развернутом состоянии [25]. Важным экспериментальным подходом для вычленения эффекта замен заряженных остатков только на нативное состояние представляется измерение сдвига в рКа ионизируемых групп в результате аминокислотной замены с помощью ЯМР [89].
Замена аминокислотных остатков на заряженные часто поддерживается отбором для того, чтобы дополнительно стабилизировать белок. Моделирование электростатических взаимодействий показывает, что в большинстве случаев белки термофильных организмов имеют более оптимизированную в плане взаимодействия заряженных остатков поверхность по сравнению с мезофильными гомологами [90]. Расчет энергии взаимодействия заряженных аминокислот на поверхности белков холодового шока CspB из мезофильной бактерии Bacillus subtilis, термофильной В. caldolyticus и гипертермофильной Thermotoga maritima выявил, что в термофильном белке элиминированы несколько дестабилизирующих взаимодействий по сравнению с мезофильным белком, а в гипертермофильном белке имеются новые стабилизирующие взаимодействия [25]. Действительно, в присутствии 1 М NaCl, экранирующего электростатические взаимодействия между аминокислотными остатками, стабильность CspB из В. subtilis увеличивается, в то время как стабильность его термофильного и гипертермофильного гомологов уменьшается. Это свидетельствует о выгодном суммарном взаимодействии зарядов в термофильных белках и невыгодном характере взаимодействия в мезофильном [91]. Аминокислотные замены в мезофильном белке каждого из 12 остатков, по которым различаются CspB из В. subtilis и CspB из В. caldolyticus, выявили всего два остатка, ответственных за стабилизацию термофильного белка, оба из которых находятся на поверхности [30, 31]. Замена глутамата 3 и глутамата 66 в мезофильном белке на аргинин и лейцин соответственно ведет к увеличению стабильности на 15,8 кДж/моль [30]. Дальнейший анализ показал, что из этих 15,8 кДж/моль 4 кДж/моль «заработаны» благодаря элиминированию невыгодного взаимодействия одноименных зарядов (глутаматов 3 и 66), еще 4 кДж/моль приходится на выгодные электростатические взаимодействия положительно заряженного аргинина 3 [92]. Отметим, что замены остатков, находящихся вблизи аргинина 3, не влияли на стабильность [92]. Это свидетельствует о том, что выгодные взаимодействия аргинина 3 являются не локальными, а дистанционными [92,93].
Измерение термодинамической стабильности вариантов убиквитина с помощью микрокалориметрии
Калориметрические эксперименты производили с помощью калориметра VP-DSC (MicroCal, Northampton, США) согласно [230]. Белок в концентрации 1,8-3,0 мг/мл диализовали против 30 мМ глицинового буфера, рН 2,0-3,5. Концентрацию убиквитина определяли спектрофотометрически, исходя из оптической плотности Агво ДЗб для раствора белка 1 мг/мл. Все эксперименты проводили при скорости сканирования 1,5 С в минуту. Обратимость тепловой денатурации проверяли повторным сканированием. Для всех вариантов убиквитина обратимость была выше 90%. Калориметрические Щ данные анализировали, используя программу NLREG (Phillip Н. Sherrod, Нешвилл, США, http://www.sandh.com/sherrod). Сворачивание убиквитина рассматривалось как переход первого рода, при котором детектируются только два состояния - развернутое и нативное [230]. Экспериментально измеренная кажущаяся теплоемкость пересчитывалась в парциальную молярную теплоемкость, как это описано [230, 231]. Далее в тексте диссертации преведены значения только парциальной молярной теплоемкости.
Максимум калориметрической кривой приблизительно соответствует температуре плавления белка Тт, при которой 50% белка развернуто, а 50% находится в нативной конформации. Точным же значением температуры плавления или температуры перехода является таковое, при котором площадь под калориметрической кривой слева от Тт равна площади под кривой справа от Тт. Площадь под калориметрической кривой равна непосредственно измеренной в эксперименте энтальпии сворачивания AHcai. Каждая калориметрическая кривая приближалась с помощью моделей двух состояний с энтальпией разворачивания (ЛНсаі), изменением теплоемкости разворачивания (АСр) и температурой плавления (Тт) как независимыми параметрами. Термодинамические параметры сворачивания вычислялись в соответствии со следующими уравнениями: AHcal(T) = AH(Tm) + ACp (Tm) (1) AS(T) = AS(Tm) + ACp-d]n(T/Tm) = + ACp-d]n(T/Tm) (2) AG(T) = (Tm ) (AHcal{Tm)lTm -ACp)ACp -ЩТІТт) (3) где AS(0 и AG(0 - функции энтропии и свободной энергии Гиббса. Все приведенные ниже термодинамические параметры вычислены для «стандартных условий» — рН 3,0,65 С. Выбранная температура минимизирует ошибку вычислений, так как она является близкой к средней температуре плавления большинства вариантов убиквитина. Для модифицированного дикого типа убиквитина (см. раздел Результаты и Обсуждение) значение АСр было равно 2,9 кДж/моль К. 4.23 Измерение спектров кругового дихроизма (КД)
Структурные изменил в различных вариантах убиквитина, а также рефолдинг пероксидазы хрена после денатурации в гуанидин-гидрохлориде изучали с помощью спектроскопии кругового дихроизма. Все спектры снимали с помощью Jasco-715 спектрофотометра (Jasco Corporation, Япония) с использованием 1 см (ренатурированная пероксидаза) и 1 мм (убиквитин, нативная пероксидаза) кварцевых кювет. Концентрация нативной пероксидазы была 2,5 цМ, ренатурированной и развернутой пероксидазы, а также убиквитина - 1 рМ. Измеренное значение эллиптичности, , конвертировалось в эллиптичность на один аминокислотный остаток, [0], в соответствии с формулой: где / - длина оптического пути кюветы, с - концентрация белка в мг/мл, MWR средняя масса аминокислоты в белке, равная 114,6 для убиквитина с гистидиновым тагом и 110,1 для пероксидазы.
Моноклональные антитела против пероксидазы хрена получали по стандартной процедуре [232, 233]. Мышей линии BALB/c иммунизировали нативной пероксидазой, после четырех иммунизации клетки селезенки сливали с клетками миеломы линии Sp2/0 и отбирали клоны, секретирующие специфические антитела. Иммуноглобулин G преципитировали в 40% сульфате аммония и осаждали центрифугированием при 8000 g в течение 15 минут. Осадок растворяли в 50 мМ натрий-фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 100 мМ хлорида натрия, (PBS) и диализовали против того же буфера. Дальнейшую очистку проводили на аффинной колонке — цианбромид-сефароза, модифицированная нативной пероксидазой хрена и уравновешенная PBS с 0,05% Тритона Х-100 (PBST). Неспецифически связавшиеся компоненты удаляли промывкой колонки PBST, антитела элюировали натрий-цитратным буфером, рН 2,7, содержащим 0,5 М хлорида натрия. Очищенные антитела обессоливали с помощью хроматографии на сефадексе G-25, уравновешенном PBS, и хранили при -20С. Гомогенность полученного белка была подтверждена с помощью SDS-электрофореза по Леммли [234].
Пероксидазу хрена (изофермент С) денатурировали в PBS, содержащем 6 М гуанидин-гидрохлорид (Гуан-НС1), в течение ночи при комнатной температуре при концентрации белка 4-40 цМ. Ренатурацию инициировали 40 или 100-кратным разведением препарата в буфере PBS или в 125 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,5, в присутствии антител или без них.
Экспериментальная стратегия исследования вклада поверхностных остатков в стабильность убиквитина
На основании приведенных в обзоре литературы соображений в качестве модельного объекта для исследования вклада поверхностных остатков в стабильность белка был выбран дрожжевой убиквитин. Мы выбрали три остатка, расположенных друг за другом на поверхности убиквитина: аспарагиновая кислота в позиции 32, лизин в позиции 33 и глутаминовая кислота в позиции 34. На каждой из этих позиций был сделан ряд аминокислотных замен с помощью сайт-направленного мутагенеза: на позиции 32 - 11 замен (A, F, G, I, L, М, N, Q, S, Т, V); на позиции 33 -12 замен (А, Е, F, G, I, L, М, N, Q, S, Т, V); на позиции 34-19 замен (все природные аминокислоты). Изученный набор охватывает практически весь спектр различий между остатками в химической природе, геометрии и размере боковой цепи, а также способности образовывать а-спираль. Рекомбинантные белки были экспрессированы в клетках E.coli; термодинамическую стабильность различных вариантов убиквитина измеряли методом дифференциальнойой сканирующей калориметрии. Если выбранные поверхностные остатки влияют на термодинамическую стабильность белка, то эта характеристика должна существенно изменяться в результате аминокислотных замен. Мы также искали корреляцию между наблюдаемыми изменениями в стабильности и свойствами аминокислот для того, чтобы выявить, какие факторы и какие типы взаимодействий влияют на термодинамическую стабильность белка для каждой из изучаемых позиций.
Рассмотрим особенности позиций на поверхности убиквитина, выбранных для аминокислотных замен. Аспарагиновая кислота 32 находится на экспонированной в воду стороне С-конца единственной а-спирали убиквитина (рис. 6), боковая цепочка остатка на позиции 32 полностью доступна для растворителя в соответствии с проведенными вычислениями с использованием программы NACCESS [237] на основании известной кристаллической структуры убиквитина. Лизин 33 является последним остатком а-спирали убиквитина. Этот остаток, как и аспарагиновая кислота 32, расположен на поверхности убиквитина (рис. 6), однако только 50% поверхности его боковой цепочки доступно для растворителя. Наконец, глутаминовая кислота 34 является первым промежуточным остатком между а-спиралью и следующим за ней поворотом основной цепочки (см. рис. 6). Для растворителя доступно только 30% поверхности боковой цепочки глутаминовой кислоты 34. Таким образом, три позиции, выбранные в убиквитине, охватывают широкий спектр экспонированности поверхностных остатков: от полностью экспонированного остатка 32 до спрятанного на 70% остатка 34. Это позволяет ответить на вопрос, как изменение в степени экспонированности остатка влияет на его вклад в стабильность белка.
Вклад взаимодействий между заряженными аминокислотами в стабильность белка был детально охарактеризован на примере убиквитина ранее [22,25,201]. Основываясь на этих исследованиях, можно было предположить, что локальные взаимодействия положительно заряженного лизина 33 и отрицательно заряженных аспарагиновой и глутаминовой кислот 32 и 34 могут существенно влиять на стабильность убиквитина. Кроме того, глутаминовая кислота 34 образует солевой мостик с лизином 11. На основании сравнительного анализа стабильности мутантных вариантов убиквитина было показано, что данный солевой мостик стабилизирует белок на 3,6 кДж/моль [114]. Также было обнаружено, что лизин невыгодно взаимодействует с остальными заряженными остатками убиквитина на обеих позициях 11 и 34, тогда как глутаминовая кислота выгодно взаимодействует с остальными заряженными аминокислотами также на обеих позициях [114].
. Позиции на поверхности убиквитина, выбранные для аминокислотных замен (выделены зеленым цветом). Слева - схематичная структура убиквитина ф-слои обозначены стрелками, а-спираль -цилиндром), справа - изображение его поверхности. Сверху вниз: аспарагиновая кислота 32, лизин 33 и глутаминовая кислота 34.
Влияют ли на стабильность белка другие типы взаимодействий на выбранных позициях, помимо взаимодействия зарядов? Чтобы ответить на этот вопрос, был получен вариант убиквитина, в котором вклад локальных взаимодействий зарядов был минимизирован. В качестве белка дикого типа для всех мутаций на позициях 32, 33 и 34 мы использовали вариант, названный WT , в котором вместо последовательности с солевым мостиком между глутаминовой кислотой 34 и лизином 11
Таким образом, в варианте WT отсутствует солевой мостик и взаимодействия между заряженными аминокислотами вблизи выбранных для замен позиций. Вариант грЛАА оказался стабильнее убиквитина дикого типа на 4 кДж/моль. Структура варианта WTAAA была исследована с помощью ЯМР спектроскопии совместно с группой Анжелы Гроненборн (Angela Gronenborn, National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). Расположение резонансов амидных групп у меченных изотопом N15 убиквитина дикого типа и белка варианта WT7 полностью совпадают. Это позволяет сделать вывод о практически полной идентичности структур данных белков. В последующих экспериментах стабильность всех мутантных вариантов убиквитина для позиций 32,33 и 34 сравнивалась со стабильностью варианта WTAAA.
Термодинамическую стабильность убиквитина анализировали с помощью тепловой денатурации. За плавлением белка следили, измеряя изменения в теплоемкости белка посредством калориметра. Калориметрия является уникальным методом, позволяющим непосредственно определять основные термодинамические параметры сворачивания [230]. Типичные калориметрические кривые представлены на рис. 3; их анализ, описанный в главе Материалы и Методы, позволяет вычислять термодинамические параметры сворачивания, такие как энергия Гиббса (AG), энтальпия (ДН), энтропия (AS) и теплоемкость (АСр).
Причины неполного восстановления каталитической активности пероксидазы при ренатурации
Чтобы получить более полное представление о возможном механизме сворачивания перосидазы в присутствии антитела С7, мы попытались найти ответ на вопрос, почему выход при ренатурации пероксидазы в отсутствие антител далек от 100% (меньше 10% в наших экспериментах). Кроме того, было важно выяснить, почему наблюдаемый выход при ренатурации существенно отличается от опубликованных ранее данных о 60% восстановлении активности пероксидазы при ее ренатурации после разворачивания в 6 М гуанидин-гидрохлориде [211].
В 6 М гуанидин-гидрохлориде вторичная структура пероксидазы (1 цМ) полностью развернута, что следует из ее КД-спектра в дальнем ультрафиолете (рис. 18). В тех же условиях спектр поглощения пероксидазы характеризуется широким пиком с максимумом на 385 нм (полуширина пика примерно равна 90 нм), очень схожим со спектром свободного гема в водном растворе, тогда как гем в составе нативного белка имеет острый пик при 403 нм (полуширина примерно равна 50 нм). Таким образом, в 6 М гуанидин-гидрохлориде пероксидаза полностью развернута и гем высвобожден в раствор. После ренатурации в фосфатном буфере спектр КД-спектр пероксидазы почти идентичен спектру нативного белка. Следовательно, при ренатурации в изучаемой нами системе происходит практически 100%-ное восстановление вторичной структуры пероксидазы. Незначительное понижение амплитуды сигнала при 222 нм в КД-спектре ренатурированной пероксидазы может быть объяснено небольшим вкладом агрегации в развернутом состоянии пероксидазы [211]. Нужно отметить, что присутствие 150 мМ гуанидин-гидрохлорида (финальная концентрация денатуранта на стадии ренатурации) не оказывает существенного влияния ни на вторичную структуру, ни на активность пероксидазы (см. рис. 18,19).
В то время как при ренатурации 1 рМ фермента происходит полное сворачивание вторичной структуры (рис. 18), каталитическая активность пероксидазы восстанавливается только на 60% (рис. 19). Кроме того, поглощение гема в составе пероксидазы при 403 нм увеличивается при ренатурации, но достигает только чуть больше половины поглощения нативного фермента при 403 нм. Таким образом, при ренатурации гем встраивается лишь примерно в 60% процентов молекул пероксидазы.
В литературе сообщалось, что потеря пероксидазой двух ионов кальция, связанных нативным ферментом, ведет к снижению каталитической активности на 50% [247, 248]. Можно было бы предположить, что неполное восстановление каталитической активности при ренатурации пероксидазы частично обусловлено неполным встраиванием ионов кальция. Однако добавление хлорида кальция до финальной концентрации 1-10 мМ при рефолдинге пероксидазы в 50 мМ натрий-ацетатном буфере, рН 5,0, не изменяло выход ренатурации, измеренный по энзиматической активности. По всей видимости, ионы кальция или встраиваются в пероксидазу при ренатурации или остаются связанными с белком в развернутом состоянии последнего. В любом случае, связывание ионов кальция не является причиной неполного восстановления каталитической активности при ренатурации и не влияет на встраивание гема в пероксидазу. Таким образом, наблюдаемое неполное восстановление каталитической активности пероксидазы при ренатурации полностью обусловлено тем, что происходит только частичное встраивание гема.
Как видно из рис. 19, при ренатурации 1 цМ фермента происходит восстановление 60% активности, что согласуется с опубликованными ранее работами [211, 249], но существенно отличается от наблюдаемых нами 8-9% при ренатурации 50-100 нМ пероксидазы. Логично предположить поэтому, то выход ренатурации пероксидазы может зависеть от концентрации фермента. Это предположение нашло свое подтверждение. Были приготовлены несколько разведений пероксидазы и ренатурация была инициирована 40-кратным разбавлением фермента фосфатным буфером; таким образом, для всех образцов условия ренатурации были идентичны, за исключением концентрации белка. Как видно из рис. 20, восстановление каталитической активности зависит от концентрации белка: при понижении концентрации белка от 1 до 0,1 цМ выход ренатурации также снижается от 60 до 10%.
Как сообщалось ранее [211, 249], при сворачивании пероксидазы формирование вторичной структуры предшествует встраиванию гема, то есть существует интермедиат сворачивания с полностью сформированной вторичной структурой, но не имеющий гема. Возможно, таким интермедиатом является полностью свернутый апо-фермент. Следовательно, изучение встраивания гема в апо-фермент может помочь понять причины неполного встраивания гема в пероксидазу при ренатурации. Несмотря на то, что встраивание в апо-фермент порфиринов с различными заместителями было хорошо изучено ранее [250-253], связывание пероксидазой гема в равновесных условиях при разных концентрациях белка ранее не исследовалось.
