Содержание к диссертации
Введение
1.Введение 5
2.Обзор литературы 9
2.1.Липосомы как системы доставки лекарств 9
2.2.Липофильная модификация лекарств 18
2.2.1.Липофильные производные метотрексата 19
2.2.2.Липофильные производные мелфалана 27
2.3.Взаимодействия липосом с белками плазмы крови 31
2.3.1. Белки плазмы крови, вовлеченные во взаимодействия с липосомами и определяемые экспериментально 33
2.3.2.Факторы, определяющие взаимодействия липосом с белками 41
2.3.3.Методы изучения взаимодействий липосом с белками 42
3.Результаты и их обсуждение 49
3.1.Синтез сложноэфирных диглицеридных конъюгатов метотрексата и мелфалана...50
3.2. Получение и характеристика липосом, нагруженных липофильными пролекарствами метотрексата и мелфалана 53
3.2.1.Состав 54
3.2.2.Размер 54
3.2.3.–потенциал 60
3.2.4.Физико-химическая стабильность 60
3.2.5.Стабильность липофильных пролекарств в составе липосом в плазме крови человека in vitro 62
3.2.6.Цитотоксическая активность в культуре метотрексат-резистентных клеток 64
3.3.Гемосовместимость липосом различного состава 66
3.3.1.Липосомы и форменные элементы крови 67
3.3.2.Влияние липосом на свертывание крови 69
3.3.3.Активация системы комплемента 71
3.4.Изучение взаимодействий липосом с белками плазмы крови 77
3.4.1. Анализ липопротеиновых фракций 77
3.4.2.Электрофорез и иммуноблоттинг 78
4.Экспериментальная часть 85
4.1.Синтез диглицеридных конъюгатов метотрексата и мелфалана 86
4.1.1.rac-1,2-диолеоилглицеро-3-(b-аланил-N-карбонилметил)-метотрексат 86
4.1.2.rac-1,2-диолеоил-3-мелфаланилглицерин 91
4.2.Получение и характеристика лекарственных липосом 93
4.2.1.Определение состава липосом 94
4.2.2. Исследование липосом методами динамического лазерного светорассеяния ...95
4.2.3.Исследование липосом методом электронной микроскопии (ЭМ) 96
4.2.4.ВЭЖХ для исследования стабильности диглицеридных конъюгатов 97
4.2.5.Определение цитотоксической активности 98
4.3.Исследование взаимодействий липосом с компонентами крови 99
4.3.1.Панель тестов на гемосовместимость 99
4.3.2.Исследование взаимодействий липосом с плазмой крови человека 101
5.Выводы 105
Список литературы
- Белки плазмы крови, вовлеченные во взаимодействия с липосомами и определяемые экспериментально
- Получение и характеристика липосом, нагруженных липофильными пролекарствами метотрексата и мелфалана
- Анализ липопротеиновых фракций
- Исследование липосом методами динамического лазерного светорассеяния
Введение к работе
Актуальность проблемы
Применение липосом в качестве систем доставки лекарств сегодня является признанным подходом к повышению эффективности лечения. Включение лекарств в состав липосом способствует повышению переносимости инкапсулированного препарата пациентом, а также позволяет увеличить терапевтический индекс (соотношение терапевтического эффекта и токсичности) лекарства. Липосомальные препараты, например, инкапсулированные доксорубицин (Doxil, DaunoXome, Caelyx, Myocet), амфотерицин В (Ambisome), винкристин (Onco-TCS), являются первыми нанолекарствами, предназначенными для системного введения и одобренными к применению в клинике в конце 1990-х-начале 2000-х годов.
Особенно актуально применение липосомальных препаратов в онкологической клинике. В основе эффекта накопления (пассивного транспорта) частиц размера 50-150 нм в опухолях лежит дефектная архитектура образующейся de novo сосудистой системы — явление повышенной проницаемости капилляров и нарушенного лимфатического дренажа (EPR, enhanced permeability and retention; Maeda et ah, J. Contr. Rel. 2000). На сегодня единственным технологичным методом достижения высокой емкости наноразмерных липосом в отношении водорастворимых препаратов является метод так называемой активной загрузки (remote loading) (Barenolz et Haran, U.S. Patent 1993; Zucker et al, J. Contr. Rel. 2009) — диффузии лекарств во внутренний объем липосом против градиентов концентраций солей аммония или ацетата кальция. Однако метод реализуем только для ограниченного числа субстанций, имеющих структуру амфифиль-ных слабых кислот или оснований, например, доксорубицина и других антрациклиновых антибиотиков.
В лаборатории химии липидов ИБХ РАН разрабатываются липосомальные препараты, получаемые методом включения лекарств в состав липидного би-слоя липосом в виде липидных биодеградируемых производных (липофильных пролекарств). К преимуществам такого подхода, по сравнению с инкапсулированием во внутренний объем, относятся возможность создания наноразмерных липосом с приемлемой емкостью загрузки для широкого круга препаратов, уменьшение потерь препарата в кровотоке и при слиянии с клеткой, упрощение самой процедуры получения липосом, а также облегчение их внутриклеточной разгрузки за счет прямого трансмембранного переноса липофильных пролекарств. После интернализации клеткой липофильный остаток должен отщепляться внутриклеточными ферментами, высвобождая активный агент. Эффективность применения противоопухолевых средств в виде липофильных
пролекарств в липосомальных формах подтверждена в ряде экспериментов in vivo на моделях опухолей мышей. Так, липосомы, сформированные из природных фосфолипидов и сложноэфирных липофильных конъюгатов цитотоксического агента сарколизина (В,Ь-мелфалана) или цитостатика мето-трексата, показали значительное улучшение терапевтических свойств по сравнению с исходными лекарствами при лечении лейкоза Р-388 (Козлов и др., Бюлл. Экспер. Биол. Мед. 1997), аденокарциномы молочных желез (Vodovozova et al, Eur. J. Cancer 2000), острого Т-лимфолейкоза (Водовозова и др., Росс. Биотерапевт. Журн. 2008). В то же время, исследований свойств данных липосом как супрамолекулярных систем доставки лекарств, то есть изучения их структуры, стабильности, устойчивости липофильных пролекарств при введении липосомальных препаратов в кровоток, ранее не проводилось.
По сравнению с другими наноразмерными носителями липосомы отличаются высокой биосовместимостью. Однако появляется все больше данных об иммуногенности некоторых липосомальных препаратов (Szebeni et al, Adv. Drug Deliv. Rev. 2011). Реакции гиперчувствительности средней и тяжелой степени отмечены у части пациентов (до 45%) при внутривенном введении липосом Doxil, Ambisome, DaunoXome. Такие реакции связаны с активацией липосо-мами системы комплемента. В связи с этим актуальными представляются исследования взаимодействий разрабатываемых липосомальных препаратов с компонентами крови.
Цель и задачи исследования
Цель настоящей работы — исследование свойств липосом с липофильными пролекарствами мелфалана и метотрексата как новых систем доставки лекарств, то есть изучение физико-химических характеристик препаратов и исследование их взаимодействий с компонентами крови человека в условиях, близких к физиологическим.
В рамках работы предполагалось решить следующие экспериментальные задачи: 1) синтезировать диглицеридные сложноэфирные конъюгаты метотрексата и мелфалана (липофильные пролекарства); 2) определелить характеристики липосомальных препаратов, получаемых на основе природных фосфолипидов и липофильных пролекарств: степень включения пролекарств в липосомы заданного состава, размеры и заряд липосом, стабильность дисперсий липосом и пролекарств в составе липосом; 3) исследовать гемосовместимость препаратов липосом; 4) исследовать взаимодействия липосом с отдельными компонентами плазмы крови человека.
Научная новизна
Впервые детально исследованы физико-химические свойства новых потенциальных систем доставки лекарств — липосом, нагруженных сложноэфирны-ми конъюгатами противоопухолевых препаратов метотрексата и мелфалана с гас-1,2-диолеоилглицерином (MTX-DOG и Mlph-DOG). Ранее, при разработке структур молекул пролекарств, они были сконструированы таким образом, чтобы минимально нарушать упаковку липидного бислоя. В данной работе впервые показано, что пролекарства действительно эффективно встраиваются в липидный бислой, образуя в ходе экструзии вместе с матричными липидами — яичным фосфатидилхолином и фосфатидилинозитом из S. cerevisiae — монола-меллярные липосомы среднего диаметра 100 нм. Впервые исследована стабильность дисперсий наноразмерных лекарственных липосом. Показано, что коллоидные растворы можно хранить не менее 1 месяца при 4С. Показана возможность длительного хранения дисперсий путем замораживания в жидком азоте — липосомы полностью регенерируются после размораживания и кратковременной ультразвуковой обработки. Установлено, что липофильные пролекарства в липосомальных формах стабильны в плазме крови человека не менее суток, то есть липосомы защищают сложноэфирные связи пролекарств от гидролиза эстеразами плазмы.
Впервые установлено в тестах in vitro, что препараты исследуемых липосом, в целом, являются гемосовместимыми системами доставки лекарств. Более того, показано, что наличие на поверхности липосом адресных тетрасахарид-ных лигандов селектинов SiaLex/A не влияет на гемосовместимость. Однако, в отличие от Mlph-липосом, препараты с MTX-DOG вызывали активацию системы комплемента, а также незначительное замедление коагуляции. Обнаружено, что модификация поверхности липосом при встраивании в бислой того или иного пролекарства определяет набор белков плазмы крови, вовлеченных во взаимодействие с липосомами, что, в свою очередь, отражается на функционировании протеолитических каскадов систем комплемента и коагуляции. Показано, что в случае МТХ-липосом снижение нагрузки бислоя пролекарством полностью восстанавливает инертность липосом.
Практическая значимость
Полученные в данной работе результаты свидетельствуют о перспективности исследованных липосомальных препаратов как новых наноразмерных систем доставки лекарств для противоопухолевой терапии. Коллоидные растворы препаратов в солевом буфере достаточно стабильны; более того, их можно длительно хранить после низкотемпературного замораживания (подобно плазме крови доноров). Такие растворы содержат достаточные концентрации проле-
карств, чтобы оказывать терапевтический эффект при системном введении. Стабильность пролекарств в составе липосом к преждевременному гидролизу эстеразами плазмы должна способствовать увеличению времени циркуляции пролекарств в кровотоке и улучшению фармакокинетики препаратов.
Показано, что MTX-DOG в липосомальной форме способен преодолевать устойчивость клеток лейкемии к метотрексату, обусловленную нарушением активного транспорта аналогов фолатов. Полученные данные представляют практический интерес, так как эффективность лечения метотрексатом ограничивается частым развитием резистентности, связанной, главным образом, именно с нарушением транспорта в клетку.
Использование природного фосфатидилинозита в качестве компонента, стабилизирующего липосомы в кровотоке {Gabizon and Papahadjopoulos, PNAS 1988), позволяет избежать побочных эффектов, связанных с иммуногенностью и токсичностью конъюгатов полиэтиленгликоля (ПЭГ) с фосфолипидами (Moghimi et al, FASEB J. 2006). Установлено, что липосомы с Mlph-DOG и MTX-DOG гемосовместимы, то есть не оказывают отрицательного влияния на компоненты крови — эритроциты и тромбоциты, а также протеолитические каскады системы комплемента и коагуляции.
Связь работы с научными программами
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект № 06-04-49432-а), FEBS (программа Collaborative Experimental Scholarships for Central & Eastern Europe, 2009) и Фонда содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере (программа УМ.Н.И.К.-2011).
Апробация работы
Основные результаты работы были представлены автором в виде устных докладов на следующих конференциях: XIV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов-2007", секция "Химия" (Москва, 2007), XXII Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2010), 2ая Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Москва, 2011). Результаты также были представлены на конференциях 6th International Workshop on Drug Delivery Systems for Nanomedicine (Liblice Castle, Czech Republic, 2008), 2nd European Summer School in Nanomedicine (Cascais-Lisboa, Portugal, 2009), Международная научная конференция по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения акад. Ю.А. Овчинникова (Москва-Пущино, 2009), 4th Liposome Advances Conference (London, UK,
2009), 3rd International NanoBio Conference (Zurich, Switzerland, 2010), XXIII Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2011), Liposomes in Jerusalem-2011 international conference (Jerusalem, Izrael, 2011), XXIV Зимняя молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2012).
Структура диссертации
Диссертационная работа изложена на 130 страницах и состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 243 наименования, и приложений. Диссертация содержит 23 рисунка и 4 таблицы.
Белки плазмы крови, вовлеченные во взаимодействия с липосомами и определяемые экспериментально
Как и макроматериалы, при контакте с биологическими средами, в первую очередь, с плазмой крови, наноразмерные частицы, в том числе липосомы, мгновенно покрываются биомакромолекулами, а именно белками и их комплексами с липидами (липопротеинами) [152, 154]. Так называемая белковая «корона» модифицирует физико-химические свойства поверхности носителей. Эффективной единицей доставки является не наночастица как таковая, а комплекс, образуемый наночастицей и более-менее прочно связанными с ее поверхностью белками. Именно с «короной» липосом взаимодействуют клеточные рецепторы в организме, поэтому качественный и количественный состав белков в короне определяет биораспределение препарата и его фармакокинетику (см. рис. 7). Разрабатываются технологии нацеливания наноразмерных препаратов, основанные на дифференциальном связывании белков плазмы крови носителями, введенными внутривенно (PathFinder technology, [155]). В свою очередь, состав белковой «короны» зависит от свойств поверхности липосом, а именно, их размера, распределения заряда и функциональных групп на поверхности. Варьирование этих параметров может лишь изменить количество связываемого белка и состав белковой короны, но не исключить связывание вовсе.
Связывание с белками определяет также стабильность липосомы как нанораз-мерной транспортной частицы в плазме крови. Возможный обмен или селективное «обеднение» отдельными компонентами бислоя за счет взаимодействия и переноса липидов липосом на гидрофобные сайты связывания липопротеинов [156, 157] или белков плазмы [158, 159] в предельном случае приводят к дестабилизации мембраны и нарушению целостности липосом (например, при активации системы комплемента и образовании мембраноатакующего комплекса C5b-9 [160]). Это особенно важно для липосомальных препаратов, нагруженных лекарством во внутреннем водном объеме. Важно отметить, что комплексы липосома–белок представляют собой динамичные структуры, так как различные белки характеризуются разной степенью сродства к поверхности частиц. Первоначально с липосомами, как и с любой поверхностью, связываются белки, присутствующие в плазме в избытке, такие как альбумин, IgG и фибриноген, вне зависимости от их сродства к поверхно- сти. Со временем они вытесняются белками, для которых характерна низкая концентрация в среде, но более высокая степень сродства (так называемый эффект Вромана [161, 162]). Особенно это касается фибриногена, связывающегося с чужеродными поверхностями, в том числе нанодисперсными, мгновенно и неспецифически, но также легко вытесняемого из белкового приповерхностного слоя и находящегося в постоянном динамическом равновесии между раствором и таким сорбированным состоянием [162]. Общее количество связанного белка
Простейшая количественная характеристика взаимодействия липосом с белками — общая адсорбционная способность липосом, или количество связываемого белка (protein binding, PB) — была предложена Чоном с соавт. [163] Было обнаружено, что, за редким исключением, общее количество белка плазмы крови, связываемое в модельных экспериментах на мышах, обратно пропорционально времени полувыведения липосом из кровотока.
Так, липосомы, связывающие более 50 г белка/моль липида, характеризуются временами полувыведения T1/2 менее 2 мин. Обычно к этой группе относятся отрицательно заряженные липосомы, содержащие до 30% таких липидов как фосфати-довая кислота (PA), фосфатидилсерин (PS), кардиолипин [163]. Высокие значения PB ( 500 г белка/моль липида) и быстрое выведение из кровотока характерны и для различных катионных липосом [152]. Это объясняется в первую очередь тем, что для большинства белков плазмы pI 7 и при физиологических значениях pH они заряжены отрицательно. Напротив, липосомы, на мембранах которых ассоциирует 20 г белка/моль липида, например, дисперсии нейтральных частиц на основе смесей фосфатидилхолина (PC) и холестерина (Chol), находятся в кровотоке намного более продолжительное время с характерными значениями T1/2 более 2 ч. Промежуточные значения PB характерны для отрицательно заряженных липосом, содержащих фосфатидилглицерин (PG) и фосфатидилинозит (PI), и соответствуют промежуточным значениям среднего времени нахождения липосом в кровотоке.
Своеобразным исключением из правила являются отрицательно заряженные липосомы с моносиалоганглиозидом GM1, в том числе имеющие в своём составе также сфингомиелин и Chol (такие липосомы моделируют внешний монослой клеточной мембраны эритроцитов). Они связывают много белка, однако это не приводит к их дестабилизации [158].
Тенденции, обнаруживаемые в экспериментах in vivo, в целом, совпадают с результатами полученными при инкубации липосом с плазмой крови in vitro [163, 159]. Таким образом, значения PB, определенные при инкубациях с плазмой in vitro, могут служить прогностическим фактором для сравнительной оценки времени циркуляции в кровотоке лекарственных липосом на основе новых липидных композиций.
Получение и характеристика липосом, нагруженных липофильными пролекарствами метотрексата и мелфалана
Липосомы готовили из смесей природных фосфолипидов (PC – PI, 8 : 1, мольн.) и липидных конъюгатов лекарств экструзией через поликарбонатные мембранные фильтры с размером пор 100 нм. Исходная смесь липидов содержала 10 мол. % конъюгатов Mlph-DOG или МТХ-DOG. Сначала гидратированием липид-ной пленки в соответствующем буфере (см. Экспериментальную часть) получали мультиламеллярные гигантские липосомы. Такие липосомы после нескольких циклов замораживания (–196С) – оттаивания (выше температуры фазового перехода липидного бислоя) образуют моноламеллярные гигантские везикулы, которые после многократного продавливания через мембранные фильтры приобретают заданный размер [42, 201]. При гидратировании липидных пленок физраствором, рН 7.0, была задана концентрация пролекарств ( 4 мМ) в конечных липосомальных дисперсиях, приемлемая для внутривенного введения с точки зрения доза/объем. В случае MTX-DOG в буфер вводили 1 мМ ЭДТА для предотвращения агрегации липидных бислоев, несущих отрицательно заряженный остаток MTX, в присутствии катионов двухвалентных металлов. Ранее нами показано, что в данной концентрации ЭДТА не токсичен при внутривенном введении крысам (неопубл. данные). Обозначения образцов липосом различного состава приведены в таблице Приложения 2, стр. 129.
Степень включения липофильных пролекарств в липосомы определяли с помощью гель-хроматографии на сефарозе: фракции анализировали на содержание фосфолипидов и пролекарств после разрушения липосом этанолом. На рисунке 9 приведены гель-хроматограммы липосомальных препаратов после приготовления. Очевидно, что пики выходов фосфолипидов и пролекарств полностью совпали. Поскольку концентрации МТХ-DOG и Mlph-DOG в липосомальных дисперсиях практически соответствовали исходному количеству конъюгатов, взятому для приготовления липидных пленок (потери на мембранных фильтрах составляли не более 2–3 % в каждом случае), был сделан вывод о количественном включении конъюгатов в липосомы.
Размер липосом с диглицеридными конъюгатами MTX и Mlph контролировали методами динамического лазерного светорассеяния (dynamic light scattering, DLS), анализа траекторий частиц (nanoparticle tracking analysis, NTA) и электронной микроскопии (ЭМ).
По данным измерений на приборе Brookhaven 90Plus (Brookhaven Instruments), средний размер свежеприготовленных лекарственных липосом составляет около 90 нм (таблица 2). Дисперсии (коллоидные растворы) характеризуются узким распределением по размерам, о чем свидетельствуют значения ширины пиков на половине высоты. Низкие значения индекса полидисперсности (PDI) подтверждают, что коллоидные растворы липосом монодисперсны.
Независимая серия липосом была приготовлена для исследования стабильности дисперсий при хранении. Больший размер MTX-DOG липосом в данной серии отражает несколько меньшую воспроизводимость от серии к серии для этих липо-сом. Тем не менее, размеры МТХ-липосом всегда надежно лежат в желаемом В последующих экспериментах для минимизации возможного влияния двухвалентных катионов на процесс формирования MTX-липосом процедуру приготовления липосом модифицировали. Использовали стеклянную посуду, обработанную ЭДТА. Кроме того, предприняли меры для удаления из субстанции MTX-DOG остатков олигомеров пептизированного силикагеля, которые могли элюироваться с колонки при хроматографическом выделении целевого продукта синтеза в системе с достаточно высоким содержанием воды (не менее 4%, см. Экспериментальную часть). Для этого готовили водно-изопропанольный раствор мицеллярной формы MTX-DOG в виде аммонийной соли и фильтровали его через мембраны с диаметром пор 50 нм. В результате нам удалось улучшить воспроизводимость размеров MTX-DOG липосом, получаемых в лабораторных условиях. В таблице 2 представлены характеристики размеров липосом, приготовленных для тестов на активацию Рис. 10. Изменения среднего диаметра липосом при хранении дисперсий (+4C) по данным DLS; приведены средние значения трех измерений ± SE. системы комплемента, после их транспортировки в лабораторию назначения1. Данные получены на приборе Malvern ZetaSizer. Очевидно, что после недели транспортировки и хранения в неконтролируемых температурных условиях (вероятнее всего, при 20–22С) препараты по-прежнему представлят собой монодисперсные коллоидные растворы с узким распределением по размерам. После месяца хранения и транспортировки средний размер MTX-DOG липосом в данной партии составил 113.2 ± 5.0 нм, индекс полидисперсности 0.074 ± 0.027 (данные установки Photocor, снабженной автокоррелятором Brookhaven BI9000).
Новым альтернативным методом определения размеров частиц в жидкостях является так называемый метод анализа траекторий движения наночастиц (Nanoparticle Tracking Analysis, NTA). Суть метода заключается в регистрации траектории и скорости двумерной диффузии отдельных частиц в растворе в процессе броуновского движения, из которой рассчитывается коэффициент диффузии частиц в суспензии Dt, связанный с размером частиц уравнением Эйнштейна–Сток-са. В отличие от метода DLS, где математический аппарат позволяет рассчитать Dt из временной автокорреляционной функции интенсивности рассеяния для ансамбля частиц, в случае NTA коэффициент диффузии рассчитывается для индивидуальной частицы. Поэтому в случае полидисперсных образцов NTA позволяет получить реальную картину распределения по размерам [202].диапазоне 50–150 нм и сохраняются при среднесрочном хранении. Даже после 10 дней хранения при +4С увеличение среднего диаметра составило не более 12%. Увеличение же размеров Mlph-DOG липосом в течение трех недель составило менее 5% (рис. 10). По-видимому, свободные -карбоксильные группы остатка MTX, экспонированные на поверхности липосом, при хранении конкурируют за связывание катионов металлов с присутствующим в буфере ЭДТА, образуя в том числе «мостики» между липосомами и способствуя их агрегации.
Анализ липопротеиновых фракций
Как отмечено в Обзоре литературы (раздел 2.3.1., стр. 35), общее количество белка PB (protein binding), которое липосомы связывают в ходе инкубаций с плазмой in vitro, может служить прогностическим фактором для сравнительной оценки времени циркуляции липосомальных препаратов на основе новых липидных композиций. Причем величины PB получены для коротких времен инкубации (в пределах 1 ч) [152]. Данные настоящей работы, косвенно свидетельствующие о взаимодействии исследуемых липосом с белками системы комплемента и коагуляционных каскадов, также были получены в экспериментах in vitro после кратковременной (15 мин) инкубации липосом в крови. Поэтому для определения значений PB препараты липосом инкубировали в 80%-ой плазме крови человека 15 мин. Затем выделяли фракции, содержащие липосомы, с помощью гель-фильтрации на сефарозе и определяли в них суммарное количество белка, которое относили к общему количеству липидов (рис. 20А). В случае MTX-липосом значение PB составило 83.9 ± 12.7 г белка/моль липидов, для Mlph-липосом в аналогичных условиях 72.6 ± 3.0 г белка/моль липидов (средние значения для двух независимых экспери- ментов). Согласно литературным данным [152] полученные значения PB прогнозируют довольно быстрое выведение липосом из кровотока. Заметно меньшее количества белка связывали контрольные липосомы, построенные из матриксных липидов PC/PI (PB = 26.8 ± 2.2 г белка/моль липидов), а также липосомы с пониженным содержанием MTX-DOG в бислое (PB = 32.8 ± 6.3 г белка/моль липидов) (рис. 20Б).
Даже неспецифически окрашенный гель (рис. 20В) демонстрирует различия в наборах белков, которые связываются разными липосомами, а также позволяет сделать предположения о том, какие белки плазмы вероятнее всего вовлечены в эти взаимодействия. В первую очередь, это касается наиболее распространённых белков плазмы крови. Так, во всех образцах доминирует полоса, соответствующая молекулярной массе 66 кДа. Вероятнее всего, это сывороточный альбумин ( 60 % суммарного белка плазмы), для которого характерно активное связывание с поверхностью липосом. Полоса с массой около 55 кДа, скорее всего, соответствует мономеру фибриногена также одного из основных по содержанию белков плазмы. Другие выраженные полосы предварительно были отнесены к -, 2- и -цепям фактора комплемента C3 ( 130, 45 и 73 кДа, соответственно), тяжёлой цепи IgG ( 50 кДа), IgM (75 кДа) и С4-связывающему белку ( 75 кДа).
Специфическое детектирование отдельных белков, ассоциированных с липо- сомами, осуществляли с помощью иммуноблоттинга1. В связи с полученными данными об активации системы комплемента MTX-липосомами, наибольший интерес представляло изучение связывания различными липосомами именно белков СК. Компонент С3 является самым распространенным среди более чем 30-ти белков СК (1.2 мг/мл плазмы [224]) и состоит из двух полипептидных цепей -(116 кДа) и -субъединиц (68 кДа; рис. 21) [225]. Активация системы комплемента по трем основным путям (рисунок Приложения 1, стр. 128) приводит к гидролизу -субъединицы компонента С3 с высвобожением анафилотоксина С3а (который мы детектировали с помощью ИФА в плазме после инкубации крови с MTX-липосома-ми, см. выше) и фрагмента С3b ( + ).
Регуляторный компонент альтернативного пути системы комплемента — фактор H — конкурирует с фактором B и С5 за связывание с С3b, в том числе ассоциированным с поверхностью, таким образом ингибируя амплификацию сигнала за счет петли альтернативного пути активации [226, 227] (рисунок Приложения 1, стр. 128). Фактор Н также вытесняет фрагмент Bb из активных C3- и C5-конвер-тазных комплексов. В присутствии фактора H фактор I (рис. 21) гидролизует фрагмент C3b, высвобождая 3-кДа фрагмент С3f и неактивный iС3b (его фрагменты 1, 2 и детектируются при электрофорезе в восстанавливающих условиях). Фрагмент iC3b не способен связываться с Bb для образования С3 конвертазы, однако, связываясь с поверхностями патогенов, является активным опсонизирующим агентом.
С4-связывающий белок (С4BP) — мультимерный белок, синтезируемый в печени. Наиболее распространенная форма включает 7 -субъединиц (75 кДа) и одну субъединицу (45 кДа). С4BP способствует диссоциации конвертаз классического и лектинового путей активации СК, а также является кофактором фактора I в реакции гидролиза фактора С4b (см. рисунок Приложения 1, стр. 128). Поскольку значительное связывание С4BP (рис. 22В) обнаружено как для MTX-липосом, вызывающих активацию СК in vitro, так и для Mlph-липосом, не приводящих к активации СК, вряд ли этот белок-регулятор влияет на функционирование СК в присутствии исследуемых липосом.
Интересно, что связывание фактора Н с поверхностями в норме служит для распознавания СК клеток организма-хозяина и патогенов. Считается, что fH связы вается с поверхностью клеток, прежде всего эндотелиальных, постоянно контактирующих с плазмой, посредством специфических взаимодействий с интегринами, например, CD11b/CD18, а также неспецифических — с полианионными структурами, такими как сиаловыми кислотами, гепаринсульфатами и гликозаминогликанами ([228] и цитируемая лиетратура). Таким образом, fH участвует в ингибировании активации СК в непосредственной близости к клеточной поверхности. Для связывания fH с фрагментом C3b, адсорбированным на поверхности, необходимо наличие анионной поверхности [229]. В случае MTX-липосом можно предположить два варианта развития событий. (1) Активация системы комплемента в присутствии липосом инициируется по одному из трех путей, что приводит к образованию поверхностно-ассоциированного фрагмента С3b, но амплификация сигнала за счет петли альтернативного пути ингибируется фактором Н. Именно петля амплификации (см. рисунок Приложения 1, стр. 128) альтернативного пути обеспечивает более 80% активации всего каскада при его инициации по классическому или лектиновому путям [230]. В таком случае, развитие терминальной части каскада, вносящей наибольший вклад в развитие реакций воспаления в результате активации СК, прежде всего, посредством анафилотоксина С5а (завершающееся образованием мембранолитического комплекса, и, как следствие, наблюдаемым лизисом сенситизированных эритроцитов, см. рис. 18Б, стр. 71), происходит, но в гораздо меньшей степени, чем можно было бы ожидать при активном альтернативном пути. (2) Активация СК происходит, однако связанный с поверхностью липо-сом фактор Н теряет способность регулировать развитие ответа, что маловероятно, поскольку именно в связанном состоянии он выполняет свои функции в физиологических условиях.
Исследование липосом методами динамического лазерного светорассеяния
Размеры липосом контролировали на приборах Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Великобритания), Brookhaven 90PLUS Particle Size Analyzer (Brookhaven Instruments Corp., США), а также с помощью гониометра Photocor Complex (Photocor, США), снабженного автокоррелятором BI9000 (Brookhaven Instruments Corp.). Во всех случаях использовали гелий-неоновый лазер, = 633 нм, под углом 90. Проводили по меньшей мере 3 измерения разбавленных суспензий (50 мкг липидов/мл PBS).
Кроме этого, размер липосом определяли с помощью метода анализа траекторий движения частиц на приборе Nanosight LM10HS (Nanosight, Великобритания) с синим лазером (405 нм) после разбавления в изотоническом растворе в 25000 раз.
Определение -потенциала лекарственных липосом
Для определения -потенциала поверхности готовили образцы 200-нм лекарственных липосом в 1 мM калий-фосфатном буфере, профильтрованном через 0.2-мкм фильтр, в присутствии 10 мМ KCl и 1 мМ ЭДТА с общей концентрацией липи-дов 0.95–1.0 мг/мл. Измерения проводили на приборе Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, США) при 25С после 1 мин уравновешивания дисперсии в одноразовых пластиковых кюветах с золотыми электродами при напряжении 150 В, силе тока 4 мА. 4.2.3. Исследование липосом методом электронной микроскопии (ЭМ)
Метод негативного контрастирования Работа проведена доктором биол. наук В.А. Кадыковым, ИБХ РАН.
При исследовании липосом методом негативного контраста опорные пленки-подложки для электронной микроскопии готовили по стандартной методике. Для приготовления опорной пленки использовали 0.05% раствор пиолоформа в хлороформе. Образцы липосом размещали на опорных пленках-подложках нанесением на опорную пленку капли дисперсий (1–4 мМ по суммарным липидам). Излишки препарата липосом удаляли фильтровальной бумагой. Препарат контрастировали 1% водным раствором уранилацетата и анализировали в электронном микроскопе JEM 100CX11 (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ.
Метод замораживания со скалыванием
Работа проведена С.С. Хуцяном, Институт биофизики клетки РАН, Пущино.
Образцы липосом для исследования методом замораживания–скалывания готовили по методике, описанной в работе [240], с некоторыми модификациями. Для препарирования использовали оригинальную установку «Вакуумный Криотом», собранную на базе стандартного вакуумного поста JEE-4C (JEOL, Япония). Капли липосомальной дисперсии (объемом 10 мкл, 40 мМ по суммарным липидам, включая пролекарства) помещали в выемку в шляпке держателя грибовидной формы. Образцы быстро охлаждали, погружая в жидкий пропан при температуре 90 К. Затем в жидком азоте держатели с образцами ввинчивали в патрончик, рассчитанный на одновременную установку до шести держателей. Патрончик с держателями вносили в вакуумную установку (давление 0.3 мПа) через шлюзовую камеру. Иней, образовавшийся на поверхности сколов образцов при их переносе в воздухе и шлюзовании, удаляли путем сублимации в вакууме при температуре патрончика с образцами 170 К с преимущественной реконденсацией влаги на более холодном (80 К) экране, расположенном вблизи поверхности образцов. Образцы раскалывались с помощью ножа, после чего температура патрончика понижалась до 120 К, и c помощью электроннолучевых испарителей на обнажен ную поверхность скола наносили оттеняющий слой толщиной порядка 5 нм, состоящий из платиноуглеродной композиции. Были использованы два варианта напыления: одностороннее угловое (под углом 40) и с вращением, позволяющее выявлять более тонкие элементы структуры объекта. Поверх оттеняющего слоя перпендикулярно поверхности скола наносили укрепляющий слой чистого углерода толщиной около 20 нм. После напыления образцы извлекали наружу, отогревали и помещали в воду. Напыленный слой, отражающий рельеф поверхности скола образца, отделяли от этой поверхности, после чего он всплывал, его отмывали от остатков суспензии и вылавливали на сеточки-носители. Полученные таким образом оттененные реплики исследовали в электронном микроскопе LIBRA 120 (Carl Zeiss SMT AG, Германия) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Изображение реплики поверхности скола липосомальных дисперсий фиксировали с помощью цифровой камеры с разрешением 2048 2048 пикселей.
ВЭЖХ-анализ проводили с помощью хроматографической системы Стайер (Аквилон), состоящей из насоса II серии, инжектора Rheodyne 7725i, UV/Vis детектора UVV 104, снабженного ячейкой объемом 5 мм/10 мкл, и программой Chrom&Spec для сбора данных (Ampersand).
Разделение MTX/MTX-DOG проводили на колонке Luna Silica, 5 мкм, 4.6 150 мм (Phenomenex, USA) в изократическом режиме в системах хлороформ–метанол–ледяная уксусная кислота, 65 : 25 : 10, 1.2 мл/мин при температуре 22 ± 3С. Рабочие концентрации растворов составляли 2.5–12.5 мкг/мл для MTX и 5– 20 мкг/мл для MTX-DOG. Объем петли 20 мкл. Детекция UV на 303 нм.
Калибровочные кривые были линейны (R2 0.97) в исследуемых диапазонах концентраций. Базовые растворы MTX и MTX-DOG в смеси хлороформ–метанол, 65 : 25 (0.5 мг/мл MTX и 1 мг/мл MTX-DOG) хранили при –20С, калибровочные растворы готовили разведением базовых растворов подвижной фазой в день анализа до соответствующих концентраций (2.5–5–10–12.5) мкг/мл MTX и (5–10–15– 20) мкг/мл MTX-DOG.
Разделение Mlph/Mlph-DOG проводили на колонке Luna C18(2), 5 мкм, 150 4.6 мм (Phenomenex) в градиентном режиме, 1 мл/мин, 45С. Программа градиента: А — 20 ммоль гексилсульфоната натрия, 1% монохлоруксусной кислоты, В — AcСN/AcOH, 9 : 1; 30% В — 4 мин., 30 100% В — линейный градиент за 11 мин., 100% В 5 мин., 100 30% В — линейный градиент за 1 мин, 30% В 6 мин. Объем петли 20 мкл. Детекция UV на 258 нм.
Пробоподготовка. Аликвоты (50 мкл) дисперсии липосом добаляли к 450 мкл плазмы крови или PBS. Образцы инкубировали при 37С. После инкубации, по 20 мкл образцов отбирали, добавляли 450 мкл смеси хлороформ–метанол, 65 : 25, активно перемешивали, центрифугировали в течение 10 мин при 4С при 13000 g. Супернатанты собирали и использовали для анализа с помощью ВЭЖХ. В случае Mlph-липосом супернатанты выпаривали при 50С в токе воздуха испарительного концентратора и перерастворяли в подвижной фазе (30% B). Представлены данные трех независимых экспериментов.
