Содержание к диссертации
Введение
1. Котрансляционное сворачивание белков 9
1.1. Гипотеза Анфинсена 9
1.2. Гипотеза котрансляционного сворачивания белков 10
1.3. Котрансляционное формирование ферментативно и иммунологически активной конформации 14
1.4. Котрансляционное образование дисульфидньгх связей 16
1.5. Связывание лигандов растущими полипептидными цепями 19
1.6. Котрансляционное формирование устойчивых к протеолизу доменов растущего белка 21
1.7. Котрансляционная олигомеризация растущих цепей 23
1.8. Ферментативная активность синтезированных белков после высвобождения из рибосомы 24
1.9. Ферментативная активность белков, связанных с рибосомой 26
1.10. Котрансляционное сворачивание белков в клетках про- и эукариот 27
2. Люцифераза светлячка PHOTINUS PYRALIS 31
2.1. Свойства фермента 31
2.2. Люцифераза как объект исследований сворачивания белков 35
3. Рибосомный канал для растущего полипептида 37
3.1. Визуализация внутририбосомного туннеля методом криоэлектронной микроскопии 40
3.2. Визуализация внутририбосомного туннеля с помощью рентгеноструктурного анализа 44
3.3. Величина скрытого в рибосоме участка растущего полипептида 46
3.4. Конформация пептида в рибосомном канале 51
3.5. Форма рибосомного канала: туннель или желоб 52
3.6. Резюме 59
4. Сворачивание светлячковои люциферазы в процессе синтеза в бесклеточной системе 61
4.1. Синтез активной люциферазы в бесклеточной системе из зародышей пшеницы 61
4.2. Координированное накопление полноразмерного полипептида люциферазы и нарастание её ферментативной активности 64
4.3. Длительность пост-трансляционной фазы сворачивания синтезированной de novo люциферазы 68
5. Ренатурация светлячковои люциферазы из полностью развёрнутого состояния 70
5.1. Кинетика ренатурации люциферазы в эукариотическом цитозоле 70
5.2. Вклад цис-транс изомеризации Х-Про пептидных связей в скорость ренатурации люциферазы 71
6. Энзиматическая активность связанного с рибосомой растущего полипептида 74
6.1. Приобретение энзиматически активной конформации люциферазы при выходе полипептида из рибосомы 74
6.2. Экспонированность синтезируемого полипептида на поверхности рибосомы 76
6.3. Синтез люциферазы с С-концевым удлинением в бесклеточной системе трансляции 81
6.4. Энзиматическая активность удлинённой люциферазы, связанной с 80S рибосомой 83
7. Котрансляционное сворачивание люциферазы в прокариотическом и эукариотическом цитозоле 87
7.1. Накопление полноразмерной люциферазы и её ферментативно активной формы при синтезе фермента в бактериальной бесклеточной системе трансляции 88
7.2. Длительность пост-трансляционной фазы сворачивания люциферазы, синтезированной в бактериальной системе трансляции 90
7.3. Кинетика ренатурации люциферазы в прокариотическом цитозоле 91
7.4. Энзиматическая активность растущего полипептида люциферазы на бактериальной рибосоме 93
7.5. Скорость перехода от неактивной к энзиматически активной конформации полипептидной цепи люциферазы на рибосоме 95
7.6. Удельная ферментативная активность люциферазы, синтезированной в различных бесклеточных системах трансляции 97
7.7. Влияние молекулярных шаперонов семейств GroEL и DnaK на котрансляционпое сворачивание люциферазы 99
Заключение 102
- Гипотеза котрансляционного сворачивания белков
- Визуализация внутририбосомного туннеля с помощью рентгеноструктурного анализа
- Координированное накопление полноразмерного полипептида люциферазы и нарастание её ферментативной активности
- Экспонированность синтезируемого полипептида на поверхности рибосомы
Введение к работе
Сворачиванием (фолдингом) белка называют процесс приобретения полипептидной цепью уникальной для данного белка пространственной структуры (конформации). Приобретение белком его уникальной пространственной структуры является необходимым условием осуществления его биологической функции. Удивительная способность линейного полимера принимать устойчивую пространственную конформацию, называемую также правильной или нативпой и способную выполнять строго определённые биологические функции, является важнейшим свойством белковой молекулы, без которого было бы невозможно осуществление белком его функций в клетке.
Поскольку полипептидная цепь состоит из множества аминокислотных остатков (нескольких сотен, как правило), число теоретически возможных конформации белка огромно. Тем не менее, сворачивание белка в единственную, строго определенную конформацию происходит быстро, в пределах десятков секунд. Проблема сворачивания белков, сформулированная Полингом в тридцатые годы, наиболее ярко отражена в так называемом парадоксе Левинталя [1], подсчитавшего, что если бы сворачивание происходило путем случайного перебора конформации и поиска наиболее выгодной, белку длиной в 100 аминокислотных остатков потребовалось бы 10 лет для достижения нативного состояния. К настоящему времени выполнено огромное количество работ, посвященных проблеме сворачивания белков, но механизм этого процесса, равно как и управляющие им законы, остаются невыясненными, несмотря на разнообразные экспериментальные подходы, разработанные и применяемые для изучения сворачивания уже более полувека.
Пристальный интерес к данной проблеме вызван не только тем, что сворачивание белка - самый непонятный в настоящее время этап в процессе передачи наследственной информации от ДНК к функциональному белку («вторая половина генетического кода»). Сейчас известно, что многие наследственные заболевания связаны с мутациями, нарушающими сворачивание какого-либо белка. В частности, с нарушением сворачивания коллагена связаны многие болезни соединительной ткани [2]. К болезням, вызванным неправильным сворачиванием белков, относят также болезнь Альцгеймера, так называемые «приоиовые заболевания» [3].
Неоспоримо также значение понимания механизмов сворачивания белков для белковой инженерии и биотехнологии. Известно, что суперэкспрессия чужеродных генов часто увеличивает уровень ошибок сворачивания белков в клетках-продуцентах, что, в свою очередь, приводит к образованию крупных агрегатов, называемых «телами включения» [4]. Это является серьёзным ограничением в получении больших количеств биологически активных рекомбинантных белков в условиях их суперпродукции. Успешное развитие белковой инженерии (дизайн и синтез белков с заранее заданными свойствами) также требует достоверного предсказания пространственной структуры белка на основе его аминокислотной последовательности.
Подходы к исследованию сворачивания белка разнообразны и многочисленны. Однако подавляющее большинство этих исследований относится к сворачиванию полноразмерных полипептидных цепей в нативную структуру, когда в качестве исходного состояния цепи выступает полностью или частично денатурированный белок, Несомненно, эта методология позволила выяснить основные принципы организации структуры белка и внесла огромный вклад в знания о белках. Тем не менее, очевидны и существенные недостатки этого направления. Уже тот факт, что в процессе синтеза белка сначала появляется N-концевой сегмент растущего полипептида, в то время как его С-концевая часть прикреплена к транслирующей рибосоме (обладающей гигантской по сравнению с пептидом массой), выявляет различия между сворачиванием синтезируемого de novo белка и его ренатурацией in vitro, происходящей в присутствии обеих терминальных последовательностей, способных свободно перемещаться в пространстве друг относительно друга. Таким образом, изучение сворачивания белков в процессе их синтеза, в условиях максимального приближения к природной ситуации, должно привести к более адекватным представлениям об этом процессе. По нашему мнению, прогресс в понимании механизмов сворачивания наиболее вероятен именно в этом направлении исследований.
Гипотеза котрансляционного сворачивания белков
Быстрая спонтанная ренатурация, полностью соответствующая гипотезе Анфинсена, продемонстрирована для целого ряда небольших однодоменных белков: цитохрома С [9,10], нуклеазы стафилококка [11], лизоцима [12] и многих других. Однако существует несколько причин (как экспериментальных наблюдений, так и теоретических предпосылок), которые вызывают сомнения в верности такой точки зрения на процесс сворачивания. Во-первых, синтез полипептидной цепи происходит направленно, векторно от N-конца к С-концу. Это предоставляет N-концевой части цепи возможность начать сворачивание уже в ходе трансляции, не дожидаясь построения С-концевого фрагмента. Такое развитие событий в процессе синтеза представляется весьма вероятным, поскольку пептидные фрагменты длиной всего в 10-20 аминокислотных остатков уже способны приобретать нативную вторичную структуру в растворе [13]. Более того, полипептиды, соответствующие доменам белка, способны формировать правильную пространственную структуру, такую же, которой они обладают в составе полноразмерного нативного белка [14]. Векторность синтеза полипептидной цепи на рибосоме также может приводить к возникновению контактов (как внутри цепи, так и с внешним её окружением), отличающихся от таковых при репатурации денатурированного полноразмерпого белка. Представляется очевидным, что у N-концевой части белковой молекулы больше времени на поиск правильной конформации. В связи с этим интересен тот факт, что внутри многих белковых доменов N-концевой участок более компактен, чем С-концевой [15]. Кроме того, в ряде экспериментов по ренатурации продемонстрировано, что С-концевая часть молекулы сворачивается быстрее, чем её N-концевая часть [14, 16]. Этот результат вполне ожидаем, если принять во внимание необходимость для С-концевой части обрести нативную конформацию быстрее всего при сворачивании в клетке — вероятно, её последовательность должна быть эволюционно «оптимизирована» для быстрого сворачивания. Во-вторых, во время синтеза С-конец растущего пептида присоединен к рибосоме, обладающей гигантской по сравнению с пептидом массой. Это может оказывать значительное влияние как на скорость, так и на путь (последовательность событий) сворачивания [17, 18].
Подобное «заякоривание» С-конца молекулы могло бы, теоретически, способствовать отбору правильной конформации даже до того момента, когда смогут сформироваться нативные дальние взаимодействия. В-третьих, транслирующая рибосома должна производить полипептидную цепь с универсальной начальной конформацией аминокислотных остатков в пептидил-трансферазном центре, и эта конформация, скорее всего, является а-спиральной [18]. Если это так, то сворачивание белка щ vivo начинается вовсе не из состояния беспорядочного клубка, как в случае ренатурации in vitro. И, наконец, микроокружение растущей на рибосоме цепи, а также физико-химические параметры (концентрация белков и других молекул, температура) внутри клетки a priori отличаются от таковых при эффективной ренатурации в условиях лабораторного опыта [19]. Более того, существует ряд экспериментальных данных, противоречащих предположению о полностью пост-трансляционном характере сворачивания белка. Например, для ренатурации ряда белков требуются десятки минут, если не часы, в то время как время полужизни большого числа белков в живой клетке намного короче [20]. Кроме того, для столь медленно сворачивающегося белка in vivo чрезвычайно высока вероятность подвергнуться протеолитическому расщеплению (поскольку денатурированные и не полностью свернутые белки гораздо менее устойчивы к протеолизу, чем нативные). Обнаружено также, что не все белки удается ренатурировать in vitro. В большинстве случаев выход нативного белка при рентурации очень низок, следовательно, точность этого процесса несравнима с точностью сворачивания in vivo. Большинство белков успешно ренатурируют только при пониженной температуре и при очень низкой концентрации белка (тогда как в клетке концентрация белка на несколько порядков выше). Кроме того, в клетках был обнаружен ряд белков, способных помогать правильному сворачиванию синтезированных de novo цепей (шапероны) и катализировать такие скорость-лимитирующие этапы сворачивания, как образование дисульфидных связей и изомеризация связи Хаа - Про (PDI, PPI). Первоначальная гипотеза предполагала, что сворачивание белка в клетке происходит аналогично его ренатурации [7]. Долгое время считали, что синтезируемый на рибосоме полипептид имеет при трансляции некую конформацию, близкую статистическому клубку, и приобретение нагивной структуры начинается только после высвобождения белка из рибосомы. Изложенные выше аргументы свидетельствуют в пользу совершенно иного взгляда на сворачивание белка в клетке, сформулированного как гипотеза котрансляционного сворачивания белков. Согласно этой гипотезе, белки in vivo начинают приобретать свою пространственную структуру во время трансляции, когда полипептидные цепи, присоединенные к рибосоме, еще не достроены [21-23]. Одной из первых работ, в которой предполагалось котрансляционное сворачивание белков, была работа Филлипса [22], основанная на анализе пространственной структуры молекулы лизоцима и распределения в ней гидрофобных аминокислот. Поскольку в этой молекуле присутствует протяжённый гидрофобный участок, который при посттрансляционном сворачивании мог бы вызывать агрегацию молекул, автор предположил, что сворачивание лизоцима осуществляется котрансляционно, и гидрофобный участок сразу же после своего синтеза погружается в уже синтезированный и свернутый гидрофобный карман, образуемый N-концевой частью молекулы. Последующие участки полипептидной цепи также организованы вокруг N-концевого фрагмента. Оригинальный подход, предложенный и успешно использованный для предсказания пространственной структуры белков по данным тритиевой планиграфии [24], также основывается на положении о котрансляционном сворачивании белков. Авторы этой работы показали, что, в соответствии с предложенным ими алгоритмом, необходимым условием получения правильной пространственной структуры является её укладка в направлении от N- к С-концевой части молекулы. Несмотря на сравнительно раннее появление предположения о котрансляционном сворачивании белков, экспериментальных работ по его проверке долгое время практически не было. Во-первых, большинство методов, применяемых при изучении ренатурации in vitro, непригодны для работы с растущими полипептидными цепями (из-за низкой концентрации последних в клеточных экстрактах и бесклеточных системах трансляции по сравнению с концентрацией тотального клеточного белка или белков, обеспечивающих трансляцию). Во-вторых, поскольку процедура выделения рибосом с растущими белковыми цепями длительна, трудно исключить возможность формирования структуры в ходе эксперимента. Тем не ф менее, ряд прямых экспериментальных подтверждений гипотезы котрансляционного сворачивания получен.
Визуализация внутририбосомного туннеля с помощью рентгеноструктурного анализа
Первое же успешное решение структуры 50S рибосомной субъединицы из археи Haloarcula marismortui с разрешением в 9 А выявило внутририбосомный туннель, идущий от пептидил-трансферазного центра к домену выхода пептида из рибосомы [104]. Улучшение разрешения до 5 А [105] позволило охарактеризовать морфологию туннеля; его длина составляет чуть более 100"А, а серединная линия туннеля является практически прямой. Стенки туннеля не гладкие, но имеют развитую поверхность сложной морфологии, а диметр таков, что позволяет вместить неорганическую молекулу радиусом около 20 А. Кристаллы субъединицы для рентгено-структурного анализа и фазирования по тяжелоатомным замещениям были выдержаны в растворе гетерополивольфрамата, каждая молекула которого содержала 11 атомов вольфрама. Оказалось, что четыре тяжелоатомных кластера расположились во впутририбосомном туннеле па всём его протяжении [105]. Следует отметить, однако, что туннель имеет сужение, просвет которого не превышает 11 А. По всей видимости, 20А-ные кластеры попали в туннель с обоих его концов: и со стороны пептидил-трансферазного центра, и со стороны домена выхода. Дальнейшее улучшение разрешения до 2.4 А и получение высокоупорядоченных кристаллов субъединиц позволили выяснить, что стенки туннеля состоят в основном из рРНК, а также определить, какие рибосомные белки находятся вблизи туннеля или являются частью его стенок [106]. Было выяснено, что сужение туннеля и его небольшой изгиб вблизи пептидил-трансферазного центра сформированы белками L4 и L22, которые своими неглобулярными учасками выходят прямо в туннель с противоположных сторон [106, 107]. Изгиб находится на расстоянии 20-35 А от пептидил-трансферазного центра. Диаметр туннеля (среднее значение 15 А) варьирует от 20 А в самом просторном его месте до 10 А в двух сужениях: одно рядом с пептидил-трансферазным центром, другое - на расстоянии 28 А от выхода из туннеля. Большую часть белковой компоненты поверхности туннеля составляет участок белка L22; значителен также вклад белка L39e, не имеющего глобулярной части и, по-видимому, неструктурированного в свободном виде [106, 107]. Все пять доменов 23S рРНК участвуют в формировании поверхности туннеля: 28 участков, образующих стенки туннеля, расположены по всей длине молекулы РНК и относятся, как правило, к петлям в её вторичной структуре. Начало туннеля образовано доменом V 23 S рРНК, следующие 20 А протяжённости туннеля формируют совместно участки доменов II и IV, а также белки L22 и L4. Дистальная половина туннеля выстлана участками доменов I и III, белком L39e и участком глобулярной части белка L22 [107].
В целом же поверхность туннеля не содержит протяжённых заряженных или гидрофобных участков, что, по мнению авторов работы [107], делает возможным движение развёрнутой полипептидной цепи внутри туннеля без её связывания и фиксации на стенках. Сужение, образованное белками L22 и L4, предположительно может функционировать как клапан, открывающийся при поступлении сигнала от связывания с транслоконом; или наоборот - сигнал от клапана может подготовить связывание с транслоконом, поскольку глобулярная часть белка L22 находится вблизи домена выхода (вместе с белками L19, L23, L24, L29 и L31е) [107]. Решение структуры полной 70S рибосомы Thermus thermophilus с разрешением в 7.8 А [108] и 5.5 А [109] также обнаружило присутствие внутририбосомного туннеля 50S субъединицы со сходными характеристиками. Домен выхода на рибосоме из Т. thermophilus окружают белки L22, L24 и L29. В 50S субъединице эубактериалыюго мезофила Deinococcus radiodurans, структура которой была получена с З.іА-ньш разрешением, туннель также обнаружен [ПО]. Различия в морфологии туннеля и в окружении домена выхода для архейного и эубактериального микроорганизмов сводятся к тому, что белки L23 и L31e из Н. marismortui слиты в единый полипептид L23 из Д radiodurans. Очевидно, что хорошо документированный факт существования внутририбосомного туннеля не доказывает того, что растущая полипептидная цепь проходит по нему к выходу из рибосомы. Тождество туннеля и рибосомного канала для растущего пептида [111] подкреплено лишь косвенными данными, К сожалению, результаты рентгено-структурного анализа рибосом или 5OS рибосомных субъединиц, содержащих пептидил-тРНК с достаточно протяжённой полипептидной цепью, пока недоступны. 3.3. Величина скрытого в рибосоме участка растущего полипептида Предположение о полностью вытянутой конформации растущей цепи в рибосоме и длине туннеля в 100 А (120 А для эукариот) приводит к заключению, что во внутририбосомном туннеле должно скрываться как минимум 28 аминокислотных остатков синтезируемого полипептида (33 остатка для эукариотических рибосом). Кроме того, расстояние между ССА-концом тРНК в Р-участке и участком связывания эритромицина, отождествляемым со входом в туннель [112], вмещает ещё 6-8 остатков С-концевого сегмента растущей цепи [112]. Это означает, что общая длина скрытого в в рибосоме участка пептида (включая путь от пептидил-трансферазного центра до входа в туннель и путь в туннеле) составляет 34-36 аминокислотных остатков (39-41 остаток для эукариот). Существует ряд прямых экспериментальных данных, противоречащих такой оценке величины участка растущего пептида, скрытого в рибосоме, В первую очередь это данные по котрансляционным модификациям растущего пептида, происходящим на рибосоме, поскольку именно они дают информацию о минимальной длине пептида, при которой он становится доступным модифицирующим ферментам. К ним относятся деформилирование N-концевого формилметионина, отщепление метионина с N-конца и ацетилирование N-терминального аминокислотного остатка. Известно, что и у про-, и у эукариот синтез каждого белка начинается с формилметионина (метионина), который впоследствии часто, но не всегда удаляется специальной аминопептидазой [ИЗ, 114]. Основываясь на данных работы [115], Джексон и Хантер заключили, что в полисомах из ретикулоцитов кролика, транслирующих экзогенную глобиновую мРНК, N-концевой метионин отщепляется от растущей цепи при длине последней в 15-20 аминокислотных остатков [116]. Аналогичные результаты были получены и в работе [117]. Авторы этой работы показали, что все пептиды, выделенные из полисом ретикулоцитов кролика, содержали N-концевой метионин, если их длина не превышала 16 аминокислотных остатков. Если же длина пептидов превышала 30 остатков, они вообще не содержали N-концевого метионина. Заслуживают внимания также эксперименты по удалению N-концевого метионина из растущих цепей овальбумина (бесклеточная система трансляции из ретикулоцитов кролика и трансляция в клетках яйцевода цыпленка) [118]. Длину пептидов, теряющих N-концевой метионин, определялась с помощью гель-хроматограф ни и деградации по Эдману. Она составляла 19-22 аминокислотных остатка. Прямые попытки определения длины растущего пептида, при которой происходит отщепление формильной группы от формилметионина, не известны, но были получены указания на то, что деформилирование предшествует отщепленшо метионина [119], и если деформилирования не произошло, то котрансляционное удаление N-концевого метионина невозможно [120].
В связи с этим представляются интересными данные Болла и Кэсберга [121], изучавших котрансляционное отщепление N-концевого метионина от белка оболочки фага Q/3. Полученное ими значение размера растущего пептида, теряющего метионин, составляет 35-45 аминокислотных остатков [121]. Но следует учесть, что растущий пептид подвергается воздействию деформилазы до отщепления метионина. Это означает, что длина пептида, доступного деформилазе, еще меньше того значения, которое определяет доступность цепи N-концевой метиониновой аминопептидазе. В аналогичной работе по изучению котрансляционггого удаления формилметионина из белка оболочки фага f2 в инфицированных клетках Е, coli было выяснено, что это событие происходит при достижении растущей цепью размеров в 40-60 аминокислотных остатков [122].
Ацетилирование N-терминальных аминокислотных остатков в ряде случаев также происходит котрансляционно. Изучение ацетилирования N-концевого метионина а-кристаллина из глазной линзы теленка показало, что ацетильная группа начинает включаться в состав пептида при его длине в 25 аминокислотных остатков и ацетилирование завершается при достижении пептидом длины в 50 остатков [123]. Длину пептида в данной работе определяли по гель-хроматографии, а наличие ацетильной группы - по одномерным пептидным картам после фрагментации пептидов термолизипом. В работе Кастен-Джолли и Такета [124] было показано, что ацетилирование N-терминального серина /З-цепи гемоглобина Б кошки происходит при длине растущего пептида около 30 аминокислотных остатков (гель-хроматографическая оценка длины). Следует отметить, что до ацетилирования происходило отщепление N-концевого метионина, а это означает, что метиониновой аминопептидазе был доступен пептид более короткий, чем пептид из 30 аминокислотных остатков.
Координированное накопление полноразмерного полипептида люциферазы и нарастание её ферментативной активности
В предварительных экспериментах (см. раздел 4.1.) было установлено, что ферментативно активная полноразмерная люцифераза светлячка может быть синтезирована в бесклеточной системе из зародышей пшеницы. Для того чтобы определить, в какой именно момент с начала синтеза в трансляционной смеси появляется активный (а значит, правильно свёрнутый) фермент, был разработан новый подход к измерению активности люциферазы. Новый метод основывался на том факте, что необходимые для трансляции условия (температура, ионный состав раствора) очень похожи на условия для измерения люциферазной активности. Кроме того, субстраты люциферазной реакции не токсичны для трансляционного аппарата. Поэтому в транслирующую систему до начала синтеза белка добавляли люциферин до 0,1 мМ (АТФ и ацетат магния там уже присутствовали). Измерения проводили следующим образом: после добавления люциферина аликвоту трансляционной смеси помещали прямо в термостатированную при 25С ячейку люминометра, и лишь затем вводили мРНК люциферазы с помощью инъекции. Это предоставляло возможность детектировать появление активной люциферазы без какой-либо задержки на процедуру измерения ферментативной активности, поскольку световой сигнал регистрировался сразу же по появлении активных молекул в растворе. Интенсивность излучаемого света, пропорциональную количеству активных молекул, фиксировали непрерывно на протяжении всего эксперимента. Как следует из рис. 4, в первые 18 минут от начала трансляции активный фермент в транслирующей системе из зародышей пшеницы отсутствовал. Измеримая активность появлялась после этого периода и нарастала со временем. Появление люциферазной активности коррелировало с появлением полноразмерпого фермента в трансляционной смеси, что было выявлено с помощью SDS-электрофореза: полосу полноразмерной люциферазы обнаруживали после 21 минуты инкубации (рис, 4, а). Нарастание светового сигнала, кроме того, соответствовало увеличению количества зрелой люциферазы. Результаты этого эксперимента говорят о том, что кривая зависимости интенсивности светового сигнала от времени отражает накопление зрелой активной люциферазы в системе трансляции. Более того, из этих результатов следует, что весьма короткий период времени требуется для синтезированной de novo люциферазы, чтобы приобрести активную конформацию, т.е. завершить сворачивание.
Тот факт, что после 18 минут инкубации активность люциферазы может быть зафиксирована, но полноразмерного фермента на радиоавтографе не обнаруживается, объясняется низкой чувствительностью радиоавтографии по сравнению с люциферазным тестом, проводимым с помощью люминометра. Проявление ферментативной активности недостроенными полипептидами люциферазы маловероятно: этот белок не обладает активностью, если его 12 последних С-концевых остатков отсутствуют [67, 68]. Для измерения длительности периода, в течение которого освобожденная из рибосомы люцифераза завершает сворачивание и приобретает конформацию активного фермента (пост-трансляционная фаза сворачивания), были проведены эксперименты по быстрой остановке трансляции люциферазной мРНК с помощью ингибиторов трансляции. Длительность этого периода определяется временем, за которое кривая нарастания активности достигнет плато (нарастание прекратится) после инъекции ингибитора. Трансляцию люциферазной мРНК проводили в присутствии люциферина в ячейке люминометра, как описано выше. Когда активность фермента в трансляционной смеси достигала достаточно высокого уровня, в ячейку быстро инъецировали ингибитор, что вызывало быструю остановку синтеза. На рис. 5 приведены результаты эксперимента, в котором для ингибирования синтеза использовали рибонуклеазу А. Контролем служила бесклеточная система трансляции люциферазы с инъецированием буферного раствора без ингибиторов. Как видно из рис. 5, остановка синтеза приводила к немедленному (в течение нескольких секунд) прекращению накопления активного фермента. Никаких значимых изменений в контрольном опыте после инъекции буферного раствора в транслирующую систему не происходило. Вывод, с очевидностью следующий из описанного эксперимента, таков: синтезированная de novo люцифераза завершает сворачивание и приобретает конформацию активного фермента за чрезвычайно короткое время после освобождения из рибосомы. Это утверждение могло бы послужить основанием для вывода о котрансляционном сворачивании фермента, поскольку из рибосомы освобождался белок со сформированной структурой, практически готовый для выполнения своей биологической функции. Однако оставалась непроверенной возможность того, что люцифераза является ферментом, способным сворачиваться из развернутого состояния очень быстро, в течение нескольких секунд. И, следовательно, сохранялась вероятность того, что сворачивания на рибосоме не происходит, но полипептидная цепь лгоциферазы быстро сворачивается уже после выхода из рибосомы. Для проверки этого предположения были предприняты следующие эксперименты Для того чтобы определить, сворачивается ли люцифераза во время синтеза на рибосоме или сразу же после выхода из нее, была изучена кинетика ренатурации этого фермента из полностью денатурированного состояния. Люцифераза, выделенная из светлячков Photinus pyralis, была денатурирована 8 М мочевиной или повышением рН до значения 11 путём добавления раствора аммиака. Аликвоты денатурированного белка разбавляли раствором, представляющим собой бесклеточную систему трансляции с добавленным до 0,1 мМ люциферином, но без мРНК. Таким образом многократно снижали концентрацию денатуранта (от 20 до 500 раз), давая тем самым развернутой цепи люциферазы возможность начать сворачивание. Следует отметить особо, что сворачивание происходило в условиях, идентичных условиям при синтезе люциферазы: в растворе присутствовали все те же компоненты (кроме мРНК) и в тех же концентрациях, что и при трансляции. За восстановлением нативной структуры люциферазы следили по восстановлению её ферментативной активности. Из кинетических кривых ренатурации (рис. б) следовало, что характеристическое время восстановления 50% от максимально достижимой в эксперименте активности составляет 14 минут как в случае денатурации мочевиной (рис. 6, а), так и в случае денатурации повышением рН среды (рис. б, б).
Скорость ренатурации не зависела и от концентрации фермента. В исследованных пределах концентрация люциферазы влияла лишь на конечный выход продукта - от 20% восстановления активности при концентрации денатурированного белка в 50 мкг/мл до 60% при концентрации в 4 мкг/мл. Таким образом можно заключить, что сворачивание люциферазы из полностью денатурированного состояния является медленным процессом с характеристическим временем в 14 минут. Дополнительно были проведены эксперименты по оценке вклада цис-транс изомеризации пептидных связей с участием пролина, Х-Про связей, в скорость ренатурации люциферазы. Для этого была использована техника «двойного прыжка» [145, 146], в соответствии с которой белок сначала быстро переводят в денатурированное состояние и инкубируют в растворе денатуранта, давая возможность пролиновым пептидным связям изомеризоваться. По прошествии определенных интервалов времени денатурант быстро разбавляют, инициируя тем самым ренатурацию белка. В экспериментах с люциферазой, денатурированной 8 М мочевиной, время инкубации в денатурированном состоянии составляло от 8 до 600 секунд при 25 С и при 4С. Как следует из рис. 1, скорость ренатурации, измеренная по восстановлению ферментативной активности, оставалась неизменной независимо от времени контакта с денатурантом. Не бьшо обнаружено и зависимости скорости ренатурации от температуры, при которой осуществлялся контакт с денатурантом. Полученные результаты прямо указывают на то, что цис-транс изомеризация Х-Про связей не является лимитирующей стадией в ренатурации люциферазы Таким образом, стало очевидно, что ренатурация люциферазы из состояния беспорядочного клубка происходит значительно медленнее, чем приобретение нативной структуры после освобождения полипептида из рибосомы: 14 минут против нескольких секунд. Это однозначно указывает на то, что фермент начинает сворачиваться во время синтеза, когда он еще связан с рибосомой, и, вероятно, формирование нативной структуры практически заканчивается на рибосоме.
Экспонированность синтезируемого полипептида на поверхности рибосомы
Нами было показано, что связанная с рибосомой в виде пептидил-тРНК светлячковая люцифераза ферментативной активностью не обладает. Существует несколько возможных причин отсутствия такой активности. Так, вполне убедительным представляется предположение о том, что ориентация глобулы синтезируемого фермента по отношению к рибосоме может оказаться такой, что транспорт субстратов к активному центру оказывается затруднённым.. Наиболее же вероятная причина отсутствия активности люциферазы кроется, скорее всего, в стерических препятствиях, не позволяющих С-концевой части полипептидной цепи занять правильное положение по отношению к остальному ферменту, либо в силу её локализации в рибосомном туннеле, либо по причине взаимной ориентации глобулы белка и рибосомы, удерживающей С-конец цепи в пептидил-трансферазном центре. В случае люциферазы последнее весьма вероятно, поскольку 12 С-концевых остатков этого фермента чрезвычайно важны для его функционирования: их последовательное удаление приводит к снижению удельной активности люциферазы вплоть до полного её исчезновения [67, 68]. Не исключено также, что ассоциированные с растущей цепью белки препятствуют С-концевому сегменту принять правильную конформацию, которую он имеет в нативном белке. В экспериментах по мечению транслирующих рибосом атомарным тритием (метод тритиевой бомбардировки [147, 148]) нами было показано, что короткие полипептидные цепи, связанные с рибосомой в виде пептидил-тРНК, экспонированы на рибосомной поверхности, а не находятся в рибосомном канале. Метод тритиевой бомбардировки основан на взаимодействии атомизированного трития с органическими молекулами-мишенями. Метод позволяет внедрять тритий по С-Н-связям, расположенным в тонком поверхностном слое макромолекул, что обусловлено малой глубиной проникновения (3-5 А) реакционноспособных атомов трития. Количество трития, включённого в тот или иной участок макромолекулы, отражает степень его экспонированности на поверхности макромолекулы. Рибосомы, заряженные растущими полипептидными цепями, получали в бесклеточной системе трансляции, программированной полиуридиловой кислотой в присутствии [14С]фенилаланиаа. Далее рибосомы выделяли с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы и подвергали мечению атомарным тритием. После удаления лабильно связанного трития с помощью многократного персосаждения этанолом, олигофенилаланиновые пептиды из меченых рибосом выделяли экстракцией в этилацетат, и дальнейший анализ проводили с помощью жидкостной обратнофазовой хроматографии высокого давления на колонке С-8. Градиентное элюирование метанолом позволяло разделять олигофенилаланиновые пептиды разной длины. Измерение радиоактивности во фракциях элюата выявило включение трития в полипептидную цепь длиной всего в три аминокислотных остатка (и в более длинные пептиды). Результаты анализа распределения включения трития в олигофенилаланиновые пептиды приведены на рис. 9. Важно отметить, что мечение транслирующих рибосом атомарным тритием не повреждало их: рибосомы не только сохраняли свои гидродинамические характеристики (коэффициент седиментации оставался равным 70S), но и функциональные свойства. После мечения тритием пептидил-тРНК и фенилаланил-тРНК оставались связанными с рибосомами. Кроме того, рибосомы сохраняли компетентность к пуромицину: выход пуромициновой реакции составлял в среднем 80 % как до, так и после мечения тритием. Таким образом было продемонстрировано, что даже очень короткие пептиды экспонированы на поверхности, а не скрыты в рибосомном канале-туннеле, что ставило под сомнение само существование канала. Экспонированность синтезируемого пептида на рибосомной поверхности была проверена также и на химически синтезированном пептиде СИэСО Gly Ala Ala [ C]Phe, связанном с рибосомой в виде предсинтезированной пептидил-тРНК в присутствии полиуридиловой кислоты. Связывание было специфичным, поскольку компетентность рибосом к пуромиципу составляла 75 %. Рибосомы, выделенные из инкубационной смеси с помощью центрифугирования, подвергались далее мечению атомарным тритием, после чего лабильно связанный тритий удаляли многократным переосаждением рибосом этанолом. Для выделения пептида рибосомы обрабатывали 0.4 М КОН, затем экстрагировали ацетоном при рН 5.0. При этом рибосомные белки и фрагменты рРНК выпадали в осадок, а освобождённый от тРНК пептид оставался в ацетоновой фазе. Экстрагированный пептид подвергали полному кислотному гидролизу, а образовавшиеся аминокислоты модифицировали данзилхлоридом. Данзилпроизводные аминокислот разделяли в тех же условиях, что и олигофенилаланиновые пептиды. Анализ распределения трития по аминокислотным остаткам этого пептида показал значительное включение трития в аланиловый остаток, являющийся третьим и вторым от С-конца (см. таблицу), что свидетельствует о его экспонировшшости на рибосомной поверхности. Более высокий уровень мечения фенилаланинового остатка в свободной пептидил-тРНК по отношению к глициловому и алаииловым остаткам отражает количество С-Н связей, в которых водородные атомы могут быть замещены тритием. Доступность растущих полипептидов крупным макромолекулам была обнаружена вблизи пептидилтрансферазного центра рибосомы и в других случаях: 1) фактор Ха расщепляет пептид на расстоянии всего в 12 аминокислотных остатков от С-конца цепи [127]; 2) фотоактивируемая ковалентная сшивка возникает между комплексом NAC и растущей цепью на расстоянии в 17 аминокислотных остатков от С-конца [127]; 3) N-концевая метионил-аминопептидаза отщепляет инициаторный метионин у растущих глобиновых цепей в 16-30 остатков длиной [117], и у растущей цепи овальбумина длиной в 19-22 остатка [118]. Эксперименты по гашению флуоресценции флуорофоров, ковалентно связанных с растущей полипептидиой цепью вблизи пептидилтрансферазного центра рибосомы [133-135] также свидетельствуют о доступности проксимального сегмента цепи молекулам из среды, окружающей рибосому. Принимая во внимание эти и ряд других данных, проанализированных в главе III настоящей работы и противоречащих концепции внутририбосомного туннеля для растущего полипептида, отсутствие ферментативной активности у полноразмерной люциферазы до её освобождения из рибосомы следует объяснять скорее стерическими препятствиями, не позволяющими С-концевой части полипептидной цепи занять правильное положение по отношению к остальному ферменту, или недоступностью её активного центра субстратам, или влиянию ассоциированных белков, чем локализацией значительного участка С-конца фермента в рибосомном туннеле. 6.3. Синтез люциферазы с С-концевым удлинением в бесклеточной системе трансляции Так или иначе, вопрос о том, обязателен ли уход белка из рибосомы для завершения сворачивания в ыативную структуру и может ли фермент приобрести активную конформацию на рибосоме, оставался открытым. Чтобы ответить на него, с помощью направленного мутагенеза было создано несколько рекомбинантных генов люциферазы. У всех конструкций отсутствовали терминирующие кодоны в открытой рамке считывания люциферазы: они были заменены другими последовательностями. Трансляция мРНК, считанной с этих генов, приводила к синтезу полноразмерного белка, содержащего дополнительный пептидный сегмент на Оконце цепи, состоящий из дополнительных, не принадлежащих люциферазе дикого типа аминокислотных остатков. Этот сегмент, «удлиняя» растущую полипептидную цепь, мог «выдвинуть» синтезируемый фермент из рибосомы, позволяя тем самым С-концевому фрагменту белка правильно встроиться в структуру фермента, или развернуть белок по отношению к рибосоме так, чтобы открылся доступ субстратов к активному центру. В экспериментах были использованы два типа удлиняющих люциферазу последовательностей. Первый тип удлинения состоят из случайной аминокислотной последовательности, закодированной в последовательности плазмидного полилинкера и не встречающейся в природных белках. Второй тип удлинения представлял собой N-концевую последовательность природного белка, неомицинфосфотрансферазы II (NPTII). ДНК-матрицы для синтеза люциферазы с неприродным удлинением получали путем гидролиза плазмиды pGEM luc(-stop) соответствующими рестрикционными эндонуклеазами, что позволяло получать люциферазу, удлиненную на 1, 19, 21, 26 и 31 аминокислотный остаток. В случае с удлинением люциферазы последовательностью природного белка, ДНК-матрицы синтезировали полимеразной цепной реакцией с плазмидой pTZ luc(NPT II). Таким образом получали люциферазу, удлиненную на 12, 19, 27 и 42 остатков N-концевой части белка NPTII. Удлинение люциферазы на 1 и 59 остатков NPTII также получали с помощью рестрикции ДНК-матрицы. Схемы сконструированных ДНК-матриц показаны на рис. 10. Матричные РНК синтезировали с помощью вирусных РНК-полимераз и транслировали в бесклеточной системе из зародышей пшеницы в присутствии [353]метионина.
