Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 7
1.1, Кинетическая модель активации и дезактивации триплетного состояния индольного хромофора 7
1.2, Фосфоресценция триптофана и его производных 11
1.3, Низкотемпературная фосфоресценция белков 14
1.4, Температурная зависимость триптофановой фосфоресценции белков 16
1.5, Общая характеристика внутримолекулярной подвижности белков 18
1.6, Динамическая структура биологических мембран ,. 24
1.7, Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре (ТФКТ) как метод изучения структурно-динамического состояния белков и биологических мембран (постановка вопроса) 30
Глава 2. Объекты и методы исследования 34
2.1. Модельная система: триптофанеодержащая плёнка поливинилового спирта, модифицируемая растворителями с.разной диэлектрической.проницаемостью 34
2.2. Белки в растворе, порошкообразные белки и белковые плёнки 35
2.3. Животные клетки, микроорганизмы, субклеточные структуры 36
2.4. Мембраны эритроцитов человека 38
2.5. Удаление кислорода из исследуемых образцов 40
2.6. Статистическая обработка экспериментальных данных 41
Глава 3. Разработка и создание чувствительной автоматизированной установки для регистрации. параметров ТФКТ 42
3.1. Функциональные блоки чувствительного автоматизированного фосфориметра 42
3.2. Математическая модель для обработки результатов фосфоресцентних измерений 48
3.3. Аналоговое и цифровое преобразование получаемой информации 51
Глава 4. Фосфоресцентные характеристики белков, биологических мембран и клеток 58
4.1. Белки в растворе и конденсированном состоянии 59
4.2. Нативные биологические мембраны и клетки 68
4.3. Мембранные белки - источник фосфоресцентного сигнала клетки 73
Глава 5. Изучение взаимодештвия тришгетов индолъного хромофора с молекулярным окружением при комнатной температуре 80
5.1. Триптофансодержащая плёнка поливинилового спирта как модель при изучении ТФКТ белков 83
5.2. Влияние кёсткости и полярности микроокружения индольного хромофора на параметры ТФКТ 88
5.3. О механизме безызлучательной дезактивации энергии триплетного состояния индольного хромофора 97
Глава 6. Информационные возможности ТФКТ в исследованиях структурно-динамического состояния биологических мембран 100
6.1, рН-зависимые изменения структуры эритроцитарных мембран 101
6.2. Влияние гуанидинхлорида на структурно-динамическое состояние мембранной матрицы 104
6.3, Структурная реакция мембран эритроцитов на мягкую ультразвуковую обработку 108
6.4. Изменение структуры эритроцитарных мембран при их взаимодействии с грулпослецифичными антителами 112
Выводы 117
Литература 120
- Температурная зависимость триптофановой фосфоресценции белков
- Белки в растворе, порошкообразные белки и белковые плёнки
- Математическая модель для обработки результатов фосфоресцентних измерений
- Мембранные белки - источник фосфоресцентного сигнала клетки
Введение к работе
Для исследования конформационной подвижности белковых макромолекул и тестирования структурных перестроек биологических мембран успешно используется метод собственной белковой флуоресценции /12, 31, 66, 115/. Метод собственной белковой фосфоресценции не получил широкого распространения. Это связано с низкой чувствительностью параметров низкотемпературной триптофановой фосфоресценции к изменениям структурного состояния макромолекул /66/, что, вероятно, обусловлено унификацией динамических свойств гликроокружения естественных белковых хромофоров при охлаждении образцов до температуры жидкого азота.
Триптофановую фосфоресценцию при комнатной температуре (ТФКТ) впервые наблюдали у белков в конденсированном состоянии - кератина шерсти, фиброина шёлка, казеина молока и белковых плёнок /29, 30/. Позднее /90/ свойства триплетного состояния триптофанилов в сухом и увлажнённом препаратах кератина шерсти были исследованы при комнатной температуре методами фосфоресценции и флеш-фотолиза. Кроме того, в работе /127/ обнаружена и изучена миллисекундная ТФКТ у алко-гольдегидрогеназы из печени лошади и щелочной фосфатазы Е. сои в растворе. Перечисленными публикациями исчерпывались сведения о фосфоресценции при комнатной температуре белков к моменту начала наших исследований /48/, а данные о ТФКТ нативных биологических мембран и клеток в суспензии вообще отсутствовали.
Вместе с тем, в последнее время для изучения структурно-динамических свойств белков и биологических мембран развивается метод, основанный на явлении фосфоресценции вводимых в исследуемые объекты триплетних меток и зондов - искусственных хромофоров с высоким квантовым выходом фосфоресценции и оптимальным временем жизни /38, 46, 99/. Благодаря большой длительности жизни триплетов, этот метод позволяет получать информацию о медленных, микро- и миллисекундных процессах, которые могут быть сопряжены с осуществлением каталитических, рецепторных и транспортных функций белков и мембран. В этой связи, заманчиво использовать в качестве триплетной метки естественный индольный хромофор белка, который не возмущает нативную структуру макромолекулы и позволяет рассчитывать на получение информации о динамическом состоянии внутренних, недоступных для "чужих" триплетних меток или зондов, областей биологических мембран.
Таким образом, представляется важным оценить возможность применения метода триптофановой фосфоресценции при комнатной температуре для изучения конформационной подвижности белковых макромолекул и структурной лабильности биологических мембран. С этой целью в данной работе систематически исследовано явление ТФКТ белков в растворе и в конденсированном состоянии (порошки, плёнки), биологических мембран и клеток различного происхождения.
Температурная зависимость триптофановой фосфоресценции белков
Изучение температурной зависимости фосфоресценции белков показало, что изменения фосфоресцентных характеристик (положение спектра, квантовый выход и время жизни) происходят при температурах, превышающих Ю0К /58, 100, 127, 139/, Наблюдаемые изменения параметров связаны с "размораживанием" секундной и субсекундной подвижности молекулярного окружения триптофанилов. "Размораживание" подвижности растворителя в первую очередь будет сказываться на хромофорах, расположенных на поверхности белковой макромолекулы, а около внутренних хромофоров соответствующий уровень молекулярной подвижности может возникнуть при более высоких температурах.
Весьма наглядно указанная структурно-динамическая гетерогенность белка выражена у алкогольдегидрогеназы из печени лошади, идентичные субъединицы которой содержат по одному поверхностному и одному внутреннему триптофанилу /127/. При-77К максимум спектра триптофановой фосфоресценции, обусловленный переходами между нижними колебательными уровнями триплетного и основного состояния, вырожден. Внешнему триптофанилу соответствует пик при 405, а внутреннему - при 410 нм. В области температур от 100 до 130К происходит "красный" сдвиг пика при 405 нм. Дальнейшее нагревание приводит к тушению фосфоресценции внешнего триптофанила. Аналогичное изменение параметров фосфоресценции наблюдается для триптофана и родственных ему соединений (см. 1.2). Таким образом, "размораживание" подвижности молекул растворителя с ростом температуры сопровождается сначала длинноволновым спектральным сдвигом, а затем тушением фосфоресценции внешнего триптофанила. Однако указанный рост подвижности молекул растворителя по мере увеличения температуры никак не отражается на параметрах фосфоресценции внутреннего триптофанила вплоть до 200К.
Индивидуальный характер температурной зависимости фосфоресценции у различных белков выявлен в работе /58/. Авторы показали, что повышение температуры от 100 до 200К сопровождается резким падением интенсивности и времени жизни фосфоресценции. При этом кривые температурного тушения для разных белков отличаются друг от друга температурой начала тушения, крутизной и формой. Индивидуальный характер тушения авторы связывают с различиями в уровне броуновской подвижности окружения хромофоров.
Структурно-динамическая гетерогенность окружения белковых хромофоров выявлена также при изучении вращательной подвижности триптофанилов в нескольких белках и мембранах эритроцитов человека /139/. Зависимость анизотропной функции от температуры для мембран имеет ступенчатую форму. Переходы между ступеньками наблюдаются в области -80С и -20С.
Совокупность рассмотренных данных показывает, что различные белки значительно отличаются друг от друга по температурному диапазону, в котором наблюдаются изменения их фосфоресцентних параметров. Сравнение же значений интенсивности и времени жизни фосфоресценции белков при постоянной температуре в диапазоне изменения параметров показывает, что эти значения могут различаться на несколько порядков. Таким образом, температурный интервал падения квантового выхода и времени жизни фосфоресценции, а также изотемлературные различия этих величин характеризуют структурно-динамическую гетерогенность микроокружения триптофанилов в белках.
Первые экспериментальные результаты, свидетельствующие о подвижности структуры белков, были получены методом дейте-рообмена /114/. Вслед за дейтерообменом последовало развитие других подходов к исследованию динамического поведения белков: люминесцентные метки /145/, собственная белковая люминесценция /10, 32/, спиновые метки /44, 45/, мессбауровские метки /64/, рентгеноструктурный анализ /87, 118/ и ЯГЛР /3, 68/. Систематическая разработка указанных подходов и их разновидностей, привлечение в методический арсенал ряда новых физических и физико-химических подходов характерны для современного положения в области изучения динамики структуры белков.
Методические трудности изучения внутримолекулярной динамики в белках связаны с одновременным участием атомов и их круппировок в нескольких видах движений. По вовлекаемым массам движения можно разделить на мелкомасштабные (линейные и крутильные колебания атомов и групп), среднемасштабные (перемещения и повороты крупных аминокислотных радикалов и участков полипептидной цепи) и крупномасштабные (смещения доменов или субъединиц относительно друг друга). Крупномасштабная подвижность обеспечивается кооперативными движениями более мелкого масштаба. Начиная обсуждать особенности динамического поведения белковых макромолекул, остановимся в первую очередь на вопросе об основных характеристиках, определяющих подвижность элементов структуры белка.
Белки в растворе, порошкообразные белки и белковые плёнки
В работе использовались отечественные и импортные коммерческие препараты белков: альбумин сывороточный быка ("Сигма", США), альбумин сывороточный человека ("Реанал", Венгрия), альбумин яичный ("Сигма", США), алкогольдегидрогеназа из дрожжей ("Реанал", Венгрия), алкогольдегидрогеназа из пе- чени лошади ("Реанал", Венгрия), альдолаза из мышц кролика (ОЗХР, СССР), jB-амилаза (ОЗХР, СССР), D -аминокислотаокси-даза из почек свиньи ("Реанал", Венгрия), аргиназа из печени быка ("Реанал", Венгрия), ацилаза из почек (ОЗХР, СССР), гексокиназа ("Флюка", Швейцария), гемоглобин ("Сигма", США), гиалуронидаза из бычьего семенника ("Реанал", Венгрия), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из мышц ("Реанал", Венгрия), Y-глобулин человека ("Мерк", ФРГ), глюкозооксидаза (Львовский завод бактлрепаратов, СССР), декарбоксилаза ("Серва", ФРГ), диастаза ("Мерк", ФРГ), оС-карбоксилаза ("Реанал", Венгрия), карбоксипептидаза А из поджелудочной железы быка ("Реанал", Венгрия), коллагеназа ("Серва", ФРГ), конканавалин А ("Сигма", США), креатинфосфатаза ("Серва", ФРГ), лактатдегидрогеназа ("Реанал", Венгрия), В-лактальбу-мин ("Сигма", США), лизоцим из яичного белка (ОЗХР, СССР), липаза (ОЗХР, СССР), миоглобин ("Сигма", США), палаин ("Флюка", Швейцария), пектиназа ("Щугард", ФРГ), пепсин ("Шугард", ФРГ), пероксидаза из хрена ("Реанал", Венгрия), пируватки-наза из мышц кролика ("Реанал", Венгрия), лроназа ("Серва", ФРГ), рибонуклеаза ("Реанал", Венгрия), трипсин из панкреаса крупного рогатого скота ("Спофа", ЧССР), трилсиноген ("Pea-нал", Венгрия), уреаза ("Флюка", Швейцария), фосфатаза кислая из пшеничных отрубей ("Реанал", Венгрия), фосфатаза щелочная из кишок цыплят ("Реанал", Венгрия), фосфолипаза v"Реанал", Венгрия), химотрипсин из поджелудочной железы ("Реанал", Венгрия), о химотрилсиноген из поджелудочной железы ("Реанал", Венгрия), целлюлаза ("Мерк", ФРГ), эдес-тин ("Шутгард", ФРГ). Для приготовления белковых растворов использовали 0,155 М фосфатный буфер или 0,2 М раствор КСІ в дистиллированной воде. Порошкообразные препараты белков перед измерением уравновешивали в течение суток с атмосферой 50$ влажности при комнатной температуре. Белковые пленки получали из концентрированного раствора белка. Белковый раствор объемом 0,2 мл заливали на кварцевую подложку размером 9x20 мм , и медленно высушивали при комнатной температуре.
Белковые пленки, как и порошки, выдерживались перед измерением в течение суток в атмосфере 50% влажности при комнатной температуре для стандартизации образцов. В опытах использовали нормальные фибообласты культуры первого пассажа Ю-суточных куриных эмбрионов (вторичные культуры). Клетки выращивали при 37С в 1500 мл стеклянных матрасах на 5% гемгидролизате для культур тканей (произволства Белорусского НИИ эпидемиологии, микробиологии и гигиены МЗ БССР) с 10 -ной сывороткой крупного рогатого скота. В среду добавляли пенициллин в конечной концентрации 100 ед/мл. Начальная плотность посева составляла 5,3x10 кл/мл. Объем среды в матрасе 250 мл.
Для приготовления суспензий клеток использовали четы-рехсуточные слившиеся культуры. Клеточные монослои трехкратно промывали теплым раствором Хенкса и затем инкубировали в течение 10 мин при 37С с 250 мл 0,02$ ЭДТА в растворе Дальбекко без кальция и магния (рН 7,4). После этого клетки вновь трехкратно промывали теплым раствором Хенкса. Суспендирование клеток осуществляли путем легкого встряхивания и пипетирования в растворе Хенкса. Для удаления не-диссоциированных клеток суспензию фильтровали через тонкое нейлоновое сито. Опыты проводили в течение первых двух часов после приготовления клеточных суспензий. ШШШ Candida иШй выращивали на среде Ридер с 4% глюкозой при непрерывной аэрации. Исследования проводили на 15-часовой культуре. Различные концентрации клеток создавали быстрым разведением свежей средой густого осадка дрожжей, полученного после центрифугирования культуры, находившейся на логарифмической стадии роста. Такая методика получения клеточных суспензий позволяет изучать межклеточные взаимодействия, исключив онтогенетические различия между клетками. Плотность дрожжевых клеток в суспензии определяли прямым подсчетом в камере Горяева.
Математическая модель для обработки результатов фосфоресцентних измерений
Кривые затухания фосфоресценции гомогенной системы, как известно, описываются кинетикой реакции 1-го порядка: Для гетерогенной системы кинетическая кривая может быть представлена в виде суммы экспоненциальных компонентов /82/: В этой формуле Гги 7 - начальная интенсивность и время жизни компонентов, At - число компонентов. В работе использовалось главным образом разложение экспериментальных кривых затухания ТФКТ на два экспоненциальных компонента. Здесь AJH Tf - времена жизни медленнозатухающего и быстроза- тухающего компонентов, а оС - вклад "медленного" компонента. При Тм - T f - Т приведенная зависимость переходит в формулу (3,1), Значения lo Hf SycL были использованы нами в качестве исходных для интерпретации полученных результатов. Начальная интенсивность фосфоресценции (1 ?) по физическому смыслу представляет собой скорость излучательной дезактивации энергии триплетного состояния и служит для определения квантового выхода фосфоресценции (вероятности фосфоресценции синглетно-возбукденного индольного хромофора). Квантовый выход фосфоресценции гомогенной системы определяется временем жизни фосфоресценции и другими характеристиками электронных переходов в хромофоре формулой (см.гл.1, формула 1.2): В отсутствии спин-орбитального возмущения константа интерконверсии (CST и константа скорости излучения с триплетного уровня кр почти не зависят от условий окружения хромофора.
Время жизни флуоресценции Tf также обычно варьирует довольно в узких пределах /II/. Поэтому значительные изменения (до нескольких порядков) квантового выхода связаны главным образом с изменением времени жизни tp . В связи с вышесказанным выражение 3.4 можно представить в виде зависимости В от слабо меняющегося параметра K=ksr%kp L-f, умноженного на сильно изменяющуюся от условий микроокружения хромофора величину \о: В случае рассматриваемого нами биэкслоненциального затухания фосфоресценции квантовый выход для "медленных" и "быстрых" хромофоров (Вм и Bg) будет определяться формулами: Здесь Лі и N$ - доля хромофоров в объекте, фосфоресцирующих соответственно с временами жизни Тм и О" . Сумма И +Л-представляет собой ту часть индольных хромофоров, которые фосфоресцируют в миллисекундном диапазоне (регистрируются). Тогда величина У- А/ - A/f может служить для оценки числа нефосфоресцирующих или фосфоресцирующих с субнаносекундным характеристическим временем (нерегистрируемых) хромофоров. Таким образом, выражения 3.5 можно использовать для оценки общего числа центров фосфоресценции с миллисекундами длительностями жизни, а также числа "быстрых" и "медленных" хромофоров.
При относительной (сравнительной) оценке вместо квантового выхода может быть взята величина соответствующего значения интенсивности фосфоресценции в начальный момент времени І , Ім или Іб (при постоянстве условий возбуждения и поглощения). При этом число "медленных" центров оценивается отношением Ім/ мі а "быстрых" - 1 / 60 Их Умма Даст оценку количества "миллисекундных" центров фосфоресценции. Исходя из равенства числа "миллисекундных" центров сумме "быстрых" и"медленных" хромофоров, можно ввести среднее значение времени жизни )( ): Откуда: г , т г/сґА (3«6) В работе использовалось также усреднение для времени жизни, из соображений равенства светосуммы затухания двум свето-суммам компонентов: 1о,(Г= Гм м + І « ТҐ. В этом случае Г= Тм + (V- " (3.7) Полученные с помощью математической модели величины среднего времени жизни ( Ґ ) и отношение интенсивности к среднему времени жизни v-0/? ), позволяющие оценивать количество фосфоресцирующих в миллисекундном диапазоне хромофоров, применялись нами наряду с параметрами начальной интенсивности (10)» временами жизни "медленного" и "быстрого" компонентов ( 2 и 0, а также вкладами "медленного" ( ) и "быстрого" (У-ot) компонентов, определяемых непосредственно из анализа кинетических кривых.
Мембранные белки - источник фосфоресцентного сигнала клетки
Поскольку у белков в растворе миллисекундная ТФКТ, как правило, отсутствует (см. 4.1), а нативные биологические мембраны и клетки обладают фосфоресценцией (см. 4.2), то естественно возникает вопрос об источнике фосфоресцентного сигнала, его привязке к определённым белковым пулам клетки.
Для решения этого вопроса была проведена "разборка" клеток и изучена ТФКТ мембранных и растворимых белков. По принятым методикам (см. 2.3) из печёночной ткани крысы были выделены изолированные клетки, субклеточные структуры и растворимые белки.
В таблице 3 и на рисунках 14 и 15 представлены спектральные и кинетические параметры ТФКТ печёночной ткани, ге-патоцитов, плазматических мембран, ядер, митохондрий, а также растворимых белков цитоплазмы, кариоплазмы и митохондри-ального матрикса. Анализ результатов показывает, что в клетке при комнатной температуре фосфоресценцией обладают белки, входящие в состав мембранных структур - плазматических мембран, ядер, митохондрий. В противоположность этому растворимые белки цитоплазмы, кариоплазмы и митохондриального матрикса не обладают свечением. Качественно сходная картина получена при исследовании лимфоцитов периферической крови человека и дрожжевых микроорганизмов С. ил.liU.
Наличие миллисекундной ТФКТ у мембранных белков и её отсутствие у белков цитоплазмы, кариоплазмы и митохондри-ального матрикса открывает возможность изучения равновесных состояний и структурных перестроек белков в нативных клетках в условиях, когда немембранные, растворимые белки "выключены и молчат". Важно и то, что становится возможным следить за состоянием мембранных белков непосредственно в ин-тактной функционирующей клетке без предварительной изоляции мембран, сопряжённой с известными нарушениями их структурно-функционального состояния.
Способность мембранных белков фосфоресцировать можно объяснить менее эффективным по сравнению с белками в растворе тушением их ТФКТ вследствие низкого уровня внутримолекулярной подвижности белков в достаточнб жёсткой мембранной матрице, обладающей промежуточными свойствами между жидкостью и твёрдым телом.
Действительно, равновесная конформация и уровень динамики структуры белка в значительной степени определяются вязкостными и диэлектрическими свойствами среды. Даже из общих соображений ясно, что погружение белковых макромолекул в более вязкую, чем вода, среду - липидную фазу мембраны - должно оказывать на структуру белка "замораживающее" действие. Это подкрепляется и экспериментальными данными. Методом реле-евского рассеяния мессбауэровского излучения показано уменьшение внутримолекулярной подвижности сывороточного альбумина человека при возрастании вязкости раствора /20/. 0 затормаживании и ограничении движений структуры белков в мембране говорят на основании исследований с помощью ШР /129/. Описано увеличение конформационной жёсткости цитохрома Р-450 при встраивании белка в фосфолипидный бислой /6/.
Ограничению динамики структуры белков из-за белок-белковых взаимодействий должно способствовать образование динамических ансамблей /28/. Вероятность образования белковых ансамблей в мембране может быть значительно выше, чем в цитоплазме, вследствие высокой концентрации мембранных б.елков. Например, концентрация белка в эритроцитарной мембране в 8-10 раз выше, чем в цитоплазме /135/. Следует иметь в виду и то, что многие ферменты организованы в мембране в форме полиферментных комплексов; олигомерным субъединичным строением обладают также системы активного транспорта и ионного переноса, например, натриевые каналы.
Значительной жёсткостью могут обладать, в частности, участки интегральных белков, "встроенные" в бислойную матрицу мембраны. Согласно литературным данным /94/, эти участки представляют собой компактные "связки" из оС-спиралей и "бочонки" из й-структур. Ограничен, вероятно, уровень динамики структуры у белков в составе мембранного "каркаса" /35, 74/. В последнее время были проведены прягше измерения, указывающие на высокую жёсткость (твёрдое состояние) некоторых мембранных белков /128, 137/ (см. параграф 1.6).
Совокупность перечисленных обстоятельств говорит в пользу того, что в биологических мембранах имеются белки, внутримолекулярная подвижность которых в значительной степени заторможена. Эти белки и являются, по-видимому, источником наблюдаемого фосфоресцентного сигнала мембран и клеток. Полученные нами результаты позволяют оценить долю фосфоресцирующих мембранных белков. Мембраны и белки в конденсированном состоянии имеют сравнительно близкие значения времён жизни ТФКТ, но значительно различаются по квантовому выходу. Поскольку выход ТФКТ у мембран в 10-ки и 100-ни раз меньше, чем у белков, то примерно в такое же количество раз число фосфоресцирующих триптофанилов в мембранах меньше, чем в белках. Таким образом, анализ полученных результатов и литературных данных показывает, что наиболее вероятным источником фосфоресцентного сигнала биологических мембран являются ассоциированные интегральные белки, составляющие менее 10% всего фонда мембранных белков.
Похожие диссертации на Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре и структурное состояние белков и биологических мембран
